Name: 负染色电子显微镜方法的变化: 处理具有挑战性的系统的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学习负染色透射电子显微镜的多种制备技术，包括侧吸法、弹甩法和快速冲洗法。掌握针对不同生物样品选择最佳染色方法的关键技能，提高大分子结构成像质量。

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我们非常感谢 Peter Knight 对本文手稿提出的有益讨论和批评性审阅。我们还要感谢 Neil Ranson 和 Stephen Muench 实验室的所有成员以及 Astbury 生物结构实验室工作人员提供的有益讨论。本研究由欧洲研究理事会（FP7/2007-2013）/欧洲研究理事会资助协议 322408 资助。C-蛋白的制备使用了由英国心脏基金会资助项目（BHF PG/13/83/30485）提供的资源。我们同时感谢惠康信托基金为支持利兹大学电子显微镜设备提供的经费（090932/Z/09/Z 和 094232/Z/10/Z）。CS 由惠康信托 ISSF 基金资助。

1. 电镜载网的制备
<ol>
	<li>碳膜制备法
	<ol>
		<li>准备一块新解理的云母片。
		<ol>
			<li>在云母片的一角，将精密注射器针头或剃刀刀片轻轻插入云母层之间几毫米处。尽可能靠近云母片的垂直中心插入工具，以获得两片厚度大致相等的部分。</li>
			<li>小心地将云母片的两半分开。此操作可凭肉眼进行，也可在解剖显微镜下完成。</li>
			<li>将每块新解理的云母片的一个角剪去。若在碳镀膜仪抽真空后释放过程中云母片发生翻转，仍可通过此标记识别出已镀碳的一侧。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将解理后的云母片放入碳镀膜仪的腔室内，确保新解理的表面朝上。</li>
		<li>确保碳镀膜仪已正确安装，并配备了适当制备的碳电极。 
		注：碳棒的制备方法因碳镀膜仪的具体规格而异。以下是一种仪器的操作流程，直至步骤1.1.5。
		<ol>
			<li>使用磨刀器将碳棒尖端磨尖，然后用纸巾抛光，以去除任何粗糙的毛刺。</li>
			<li>用细砂纸将第二根碳棒的端面磨平，再用纸巾再次抛光至光滑。</li>
			<li>根据制造商说明，将两根碳棒装入镀膜仪中。确保第一根碳棒的尖端与第二根碳棒的平面端紧密接触。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若需通过目视判断碳膜厚度，可在云母片下方部分放置一小块洁净干燥的滤纸。或者，在云母片旁边放置一块带有少量真空脂的白色磨砂载玻片，用于监测碳膜厚度。</li>
		<li>按照制造商说明在云母片上沉积碳膜。
		<ol>
			<li>抽真空至10-5 mbar，待真空度稳定后，将电极电压设为4.0 V（根据碳棒来源不同，最高可能需要5 V）。</li>
			<li>通过电极施加多个持续时间约为3.5秒的短脉冲，使碳在云母表面蒸发沉积形成1–2 nm厚的薄层。 
			注：当电流通过碳棒时，碳棒会先发红光，随后变为白光。切勿直视强光，以免损伤眼睛。</li>
			<li>持续沉积碳膜，直至达到所需厚度，可通过碳镀膜仪的厚度监测仪或通过观察滤纸或载玻片上沉积的碳层进行判断。最终碳层厚度应为5–10 nm。
			<ol>
				<li>若采用目视法判断厚度，可比较涂有真空脂的磨砂载玻片区域与未覆盖区域的颜色变化：随着碳沉积量增加，该区域颜色会逐渐变深。 
				注：使用此方法无法对碳膜厚度进行定量测定。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>释放真空腔室，取出镀有碳膜的云母片。 
		注：镀碳后的云母片可在进行后续步骤前静置过夜</li>
		<li>使用两个水容器之一将碳膜漂浮至透射电镜（EM）载网上：一种是底部带排水阀的容器，可通过排水使碳膜缓慢下降至待接载网上；另一种是带有升降装置的容器，可将载网置于水面以下，随后将其提升至水面处与碳膜接触。</li>
		<li>向容器中加入超纯蒸馏水，使水面距离容器顶部约5 mm。用一至两张镜头纸轻轻拖过水面，清除任何漂浮的颗粒物，以清洁水面。</li>
		<li>将一块洁净的不锈钢网（尺寸约为1英寸×2.5英寸）置于水面以下。</li>
		<li>使用精细镊子，将洁净干燥的EM载网按制造商说明正面朝上放置于不锈钢网上。尽可能紧密地排列载网，但避免相互重叠。</li>
		<li>载网排列完成后，用镊子或胶片夹牢固夹住镀碳的云母片。</li>
		<li>将云母片缓慢浸入水中，确保以非常小的角度（约10度）入水。 
		注：云母片应穿透水面并完全浸没，而碳膜则应从云母片上分离并漂浮于水面。此步骤不应直接在载网上方进行，以避免造成损伤或污染。
		<ol>
			<li>为降低碳膜无法从云母片上分离的风险，可在将云母片浸入水中前，用剃刀刀片在其边缘划痕，或用小剪刀剪去一个角。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>待碳膜完全脱离后，取出云母片或将云母片任其沉至容器底部。</li>
		<li>使用尖头镊子，施加极轻微的压力，并缓慢移动，引导碳膜覆盖在载网上方。</li>
		<li>通过缓慢排水或提升升降环（取决于所用装置类型），使碳膜与载网表面接触。</li>
		<li>小心地将不锈钢网（现载有镀碳的载网）从装置中取出，并用滤纸吸去部分多余的水分。操作时应仅将滤纸接触不锈钢网的最边缘，避免触碰载网或碳膜。</li>
		<li>将载网所在的金属网放入含有干燥滤纸的培养皿中，使其完全干燥。 
		注：最佳方式是在室温下过夜干燥，也可将载网置于约60 °C的烘箱中以加快干燥过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漂浮并镀膜法（直接碳沉积）。该方法此前已有详细描述16
	<ol>
		<li>用蒸馏水完全充满一个洁净的大玻璃碗，直至水面形成弯月面。</li>
		<li>使用洁净的巴斯德移液管，在水面滴加一滴火棉胶溶液（硝化纤维素溶于乙酸戊酯），让液滴自然铺展并完全干燥。干燥后，可在水面上看到一层薄而透明的火棉胶膜。</li>
		<li>用牙签轻轻移除水面上的灰尘或其他污染物。</li>
		<li>向水面滴加第二滴火棉胶溶液，使其铺展并干燥2–3分钟。 
		注：重复步骤1.2.3–1.2.4，直至获得一张平整无皱的火棉胶膜。</li>
		<li>使用精细镊子，按制造商说明将EM载网正面朝下放置于漂浮的火棉胶膜上。将载网紧密排列成六边形阵列，但避免重叠。 
		注：若某个载网位置错误或方向颠倒，通常建议保持原位，避免在调整过程中损坏火棉胶膜。</li>
		<li>所有载网放置完毕后，轻轻将一张滤纸覆盖其上，让滤纸通过毛细作用自然浸湿。 
		注：只要滤纸能完全覆盖载网，其尺寸或厚度均可接受。</li>
		<li>使用牙签去除超出滤纸范围的火棉胶膜。</li>
		<li>捏住滤纸边缘，将其从水面缓慢剥离。 
		注：载网应牢固附着于滤纸上。</li>
		<li>将滤纸平放于培养皿中，火棉胶面朝上，使其完全干燥。</li>
		<li>将带有载网的滤纸放入碳镀膜仪腔室中，碳电极应按步骤1.1.2所述方式正确制备。</li>
		<li>按照“碳膜制备法”中所述的碳蒸发程序进行操作</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两次脉冲之间应间隔数秒，以避免过热而损坏硝化纤维素膜。 
	注：如有需要，可在载网完成碳镀膜后去除聚合物层，但此步骤通常非必要。将载网碳面朝上放置于一张新的滤纸上，在滤纸靠近（但不接触）载网处滴加数滴丙酮，使丙酮在载网下方扩散，溶解并吸收聚合物层。</li>
</ol>
2. 负染试剂的制备
<ol>
	<li>醋酸铀酰的制备
	<ol>
		<li>取少量超纯水加热至沸腾，持续煮沸 10 分钟以充分脱气。稍冷却后，用其溶解醋酸铀酰（UA），配制成 1–2%（w/v）的溶液。 
		注意：该操作应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>待溶液冷却后，通过 0.2 µm 注射器滤器或滤纸过滤。</li>
		<li>将 UA 溶液避光保存于 4 ˚C。溶液可稳定保存长达 1 年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由粉末制备甲酸铀酰。此方法此前已有详细描述8
	<ol>
		<li>在 2 mL 煮沸并脱气的超纯水中（同步骤 2.1.1）加入 20 mg 甲酸铀酰（UF）粉末，搅拌溶解。</li>
		<li>继续搅拌的同时，加入 8 µL 5 M NaOH，溶液应变为更深的黄色，但不应产生沉淀。</li>
		<li>通过 0.2 µm 注射器滤器过滤溶液。</li>
		<li>将 UF 染液避光保存。若观察到任何沉淀或出现褐色变色，应弃用染液。该溶液仅可稳定保存 1–2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由醋酸铀酰制备甲酸铀酰
	<ol>
		<li>向 1 mL 1%（w/v）的 UA 染液中加入 100 µL 1 M NaOH，使醋酸铀酰沉淀。</li>
		<li>将混合物在台式离心机中以最大速度离心 2 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀物用 100 µL 5%（v/v）甲酸剧烈涡旋溶解。</li>
		<li>加入 900 µL 超纯水稀释至终体积 1 mL，得到含 0.5%（v/v）甲酸的 UF 染液。</li>
		<li>将 UF 染液避光保存。若观察到任何沉淀或褐色变色，应弃用染液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>其他染色试剂的制备
	<ol>
		<li>镧系元素醋酸盐染液的制备
		<ol>
			<li>将醋酸钐（SmAc）、醋酸钆（GdAc）、醋酸铥（TmAc）或醋酸铒（ErAc）以 1–2%（w/v）浓度溶于超纯水中。 
			注意：若使用这些染液时样品出现正染色或在载网上附着不良，可加入最多 0.5%（v/v）甲酸进行酸化处理。正染色表现为样品呈深色物体，周围有白色晕圈；附着不良则导致在载网上观察到的分子数量少于预期。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>钼酸铵和磷钨酸钠的制备
		<ol>
			<li>将染液以 1–3%（w/v）浓度溶于超纯水中。如需，可用 5 M NaOH 调节 pH 至 7.0。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将样品吸附至碳基底并染色
<ol>
	<li>通过使载网表面亲水化以准备样品施加
	<ol>
		<li>将载网正面朝上放置在电晕放电仪中的载玻片上。</li>
		<li>在10 mA条件下处理载网至少30秒。 
		注意：具体的电晕放电方法将取决于所用设备的规格。</li>
		<li>或者，也可使用台式紫外灯进行10分钟的紫外照射来实现此步骤4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧边吸滤法。该方法此前已有详细描述8
	<ol>
		<li>用负压镊子夹住载网边缘，并在支持膜表面施加3–5 µL样品。</li>
		<li>让样品在载网表面吸附10秒至1分钟。应针对不同样品优化吸附时间。</li>
		<li>将载网边缘轻触滤纸，利用毛细作用吸除液体。</li>
		<li>可选：清洗载网。在实验室用塑料膜上放置50 µL超纯水或适当的挥发性缓冲液液滴。轻轻将载网的碳膜面接触液滴，使少量液滴附着于载网表面。再将载网边缘轻触滤纸，利用毛细作用吸除液体。</li>
		<li>根据需要重复此清洗步骤多次。</li>
		<li>在实验室用塑料膜上放置两滴50 µL染色剂。</li>
		<li>轻轻将载网的碳膜面接触染色液滴，使少量染色剂附着于载网表面。 
		注意：如果染色剂迁移至载网背面，则应弃用该载网。</li>
		<li>将载网边缘轻触滤纸，利用毛细作用吸除液体。此染色步骤需重复两次。</li>
		<li>让载网自然晾干或在白炽灯下干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弹滴法
	<ol>
		<li>用负压镊子夹住载网边缘，并在支持膜表面施加3–5 µL样品。</li>
		<li>一手持镊子，使载网倾斜约45°且正面朝外，快速甩动手腕，将载网上大部分液滴“弹”去。</li>
		<li>可选：使用玻璃巴斯德移液管在支持膜表面加一滴洗涤液，按3.2.2步骤“弹”去。根据需要重复操作。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管在支持膜表面加一滴染色剂，按3.2.2步骤“弹”去。根据观察样本所需的染色深度重复1–3次。 
		注意：最终染色深度并非仅由该步骤决定（见讨论部分）。</li>
		<li>用撕开边缘的滤纸轻触载网边缘，去除多余染色剂。</li>
		<li>让载网自然晾干或在白炽灯下干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>快速冲洗法
	<ol>
		<li>用200 µL移液枪吸取30–70 µL染色剂（通常使用1%醋酸铀），旋转容量调节旋钮吸入5 µL空气，然后根据需要吸入5–30 µL洗涤/混合试剂，再吸入一小段空气，最后吸入5 µL样品。</li>
		<li>用负压镊子夹住载网边缘，持镊时使载网倾斜约45°且正面远离操作者，将移液枪尖端内的全部液体快速喷射过碳膜覆盖的透射电镜载网表面。</li>
		<li>用撕开边缘的滤纸轻触载网边缘，去除多余染色剂。</li>
		<li>让载网自然晾干或在白炽灯下干燥。 
		注意：对于所有方法，建议将撕开边缘的滤纸沿镊子滑动至载网处，以清除镊子两侧之间残留的溶液，否则在打开镊子时残留液可能将干燥的载网拉入镊子夹口。此外，夹有载网的镊子也可置于通风橱边缘干燥，持续的气流有助于获得更均匀的染色效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文描述了使用多种染色试剂（包括两种新型镧系试剂TmAc和ErAc）对样品进行负染色以用于电子显微镜观察的多种方法。负染色过程中的许多步骤必须根据具体样品进行优化，包括染色剂的选择、是否需要以及所需的洗涤次数，以及滤纸吸附技术。因此，本文为显微镜工作者提供了基础，使其能够建立适用于复杂体系负染色的个性化工作流程。
染色剂的选择高度依赖于样品特性。对于特别敏感于低pH值的样品，尽管醋酸铀（UA）和甲酸铀（UF）具有固定作用，仍可能导致样品降解19。在此类情况下，基于镧系元素的染色剂（如乙酸铥TmAc或乙酸铒ErAc）可能更为合适，但必须将制备液的整体pH值保持在样品蛋白质等电点以下，以防止产生正染色效应。如有必要，可通过乙酸酸化染色液来实现这一点。对于对极低pH值特别敏感的样品，阴离子型钨酸盐或钼酸盐染色剂可能效果更佳。尽管这些染色剂在某些情况下可能引发伪影的形成，例如在脂蛋白样品中导致缗钱状结构（rouleaux）的出现20。同样，此时可能需要将染色液的pH值调节至高于样品的等电点，以避免正染色现象的发生。
如果保存样本的缓冲液含有高浓度的盐或磷酸盐成分，则在染色前可能需要对样本进行洗涤。在许多情况下，可以使用超纯水进行洗涤；但对于更敏感的样本，单独接触水可能导致降解或发生结构变化，此时可能需要使用低离子强度的挥发性缓冲液进行洗涤8。即使在严格控制的条件下，洗涤仍可能导致碳表面发生一定程度的结构重排21。
网格样品的制备方法，包括样品吸附、 blotting（吸除）和染色步骤，也会显著影响观察结果。因此，最合适的方法在很大程度上仍取决于具体样品。例如，C-蛋白在侧向 blotting 染色后呈现为球状环形结构，但这种形态似乎是染色过程产生的人工假象，这一点在采用 flicking 法（或快速冲洗法）制备载网时得以揭示（图3）。在 flicking 法和快速冲洗法中，样品在固定前与碳支持膜表面相互作用的时间被最小化15。此外，在固定前的 blotting 过程中，样品所受弯月面后退产生的作用力也更小。这意味着样品在碳膜上长时间吸附或因毛细作用导致的结构变化被降至最低。快速冲洗法还可用于样品的时间分辨分析。可在移液枪头内将样品与配体或添加剂混合并孵育一定时间后施加到载网上，也可在载网表面短暂接触数毫秒内即完成固定。
染色深度需要根据特定样品的特性来确定，以获得最佳成像效果，这再次取决于样品本身2。如果染色过浅，分子可能受到电子束的损伤；而如果染色过厚，则可能导致结构特征丢失。染色深度受多种因素影响，包括载网表面的亲水性、碳膜的均匀程度、施加到载网上的染液量、染液在吸水前与载网接触的时间、吸水的程度以及载网完全干燥所需的时间。载网上的染色分布不可能在整个表面完全均匀，因此必须仔细选择适合成像的区域。事实上，即使在同一天、相同条件下制备的载网，其质量也常常存在差异。Burgess et al5 提供了一个很好的实例，说明了染色深度的变化如何影响分子的外观，以及成像时适宜的染色深度应为何种程度。
尽管负染色法是一种非常通用、快速且简单的技术，但并非所有生物样本都适用于该方法进行观察。脆弱的结构在吸附、染色或在电镜载网上的干燥过程中可能发生塌陷或解体22。负染色还可能导致分子扁平化，并诱导分子在碳支持膜上产生优势取向7。
负染色法本身是一种评估样品的宝贵工具，也可在冷冻电镜分析之前使用，但样品在该过程中所经历的许多物理作用力尚未被充分理解。因此，最佳操作方法高度依赖于具体样品，必须通过反复试验来确定，而无法通过遵循固定方案进行教学。

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Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

尽管近年来由于冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的显著进步带来了“分辨率革命”并受到广泛关注1，负染电子显微镜技术仍然是一个强有力的手段，也是电子显微镜研究者工具箱中的关键组成部分。在优化冷冻样品载网条件之前，负染仍是快速评估样品的最优方法2。负染样品具有高对比度且制网速度快，非常适合用于评估样品的纯度、浓度、异质性以及构象灵活性3。尽管该技术的分辨率受限于约18 Å4,5,6，但已有许多具有重要生物学意义的结构通过负染三维重构获得，且出于多种原因，某些样品在负染中的成像效果优于冷冻电镜7。
负染电镜技术中，目标颗粒吸附于电镜载网表面，并被一层无定形的高电子密度染色剂基质所包绕。由于目标颗粒的电子密度低于周围染色剂，因而与背景之间形成较高的相对反差。8颗粒呈现为较亮的区域，是由于其电子散射能力较周围致密的染色背景低，后者散射电子更强而显得更暗。通过仔细观察所得图像，可推断颗粒的亚结构特征，因为染色剂会渗入任何缝隙，从而产生不规则的对比细节。9.
负染色过程首先需要制备一种支撑基底，用于捕获样品颗粒并承载干燥的染色层。最常用的支撑基底是一层无定形碳，有时由一层聚乙烯醇缩甲醛（例如 Formvar）或硝化纤维素（例如 Collodion）聚合物提供支持。这些基底可从商业途径购买，也可按照下述方案在实验室自行制备。
在制备好支撑基质后，即可施加样品，并用滤纸吸去多余的溶液。用于负染色的样品应悬浮于合适的缓冲液中。应尽量避免使用磷酸盐缓冲液和高盐浓度溶液，因为它们可能产生结晶沉淀，从而遮蔽样品。还应避免使用还原剂、去污剂、蔗糖、甘油以及高浓度核苷酸，因为这些物质也会影响染色质量4。当缓冲液成分无法更改时，可在样品吸附后、染色前，用水或更合适的缓冲液洗涤电镜载网表面，以减少与缓冲液相关的伪影，并通常可改善染色背景。若怀疑存在缓冲液引起的伪影，可通过制备仅含缓冲液而不含样品的载网进行染色，以判断缓冲液成分是否为所观察到的伪影来源。
样品吸附后，根据需要进行 blotting 和洗涤，然后施加染色试剂。多种试剂已被证实可有效作为负染色剂（表1），但染色剂的选择必须与样品相匹配。由于蛋白质疏水区域会排开染色分子，同时带电基团之间存在排斥作用，因此在颗粒周围会形成染色剂的“晕环”。因此，应选择在工作 pH 值下与蛋白质上潜在带电基团质子化状态相同的染色剂。若蛋白质表面带有相反电荷，则可能导致正染色效应，尽管该技术本身具有应用价值10，但不在本文讨论范围之内。最常用的负染色剂是醋酸铀酰和甲酸铀酰。这些染色剂具有相对较小的颗粒尺寸（4–5 Å）9，相比磷钨酸盐（8–9 Å 颗粒尺寸）9,11、钼酸铵11 以及某些基于镧系元素的染色剂12，可提供更高分辨率的图像。醋酸铀酰和甲酸铀酰还具有固定作用，可在毫秒时间尺度上保持许多蛋白质-蛋白质相互作用13，但其较低的 pH 值以及在生理 pH 条件下易沉淀的特性可能对某些样品造成不利影响14。尽管铀酰盐具有实用性，但由于其具有毒性且具有轻微放射性，可能需要特殊的操作、储存和处置要求，因此一些用户倾向于寻找非放射性替代品。
关于电镜载网的基底制备、样品施加和染色方法，已有多种不同方法被报道。具体采用哪种方法取决于样品特性，而在研究新体系时，往往难以确定最合适的方法。本文描述了两种基底制备方法和三种 blotting 方法：侧边吸滤法、弹 flicking5 和快速冲洗法15。其中，侧边吸滤法是所描述方法中最简单的一种。弹 flicking 法和快速冲洗法实施难度较高，但可缩短样品与支撑膜接触的时间，从而在固定前减少染色伪影的形成，已有研究显示这两种方法对某些样品可有效改善染色质量5。因此，本文旨在为利用负染电镜技术对具有挑战性的体系进行可视化分析提供一个初步的实验流程。

<table><tbody><tr><td>200目铜网电镜载网</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4776-1VL</td><td>也可使用其他材料和/或目数的载网</td></tr><tr><td>钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>碳蒸发仪</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>9620</td><td>Cressington 208 或同等产品</td></tr><tr><td>2%醋酸戊酯胶棉溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9817</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 负压镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501202</td><td>或根据需要选用其他镊子</td></tr><tr><td>醋酸铒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>325570</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钆</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>325678</td><td></td></tr><tr><td>云母片，75×25×0.15 mm</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG250-1</td><td></td></tr><tr><td>白色磨砂载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12607976</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>10018130</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>巴斯德吸管（玻璃）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10343663</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>11904325</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>砂纸</td><td>五金商店</td><td></td><td>使用粒度细于200目的干湿两用砂纸（建议使用600目）</td></tr><tr><td>醋酸钐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>325872</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6395</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢网，150×150 mm（按需裁剪）</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG252</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铥</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367702</td><td></td></tr><tr><td>两步式碳棒削尖器，适用于1/4&quot;碳棒</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>57-10</td><td>或与所用碳蒸发仪匹配的等效产品</td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>12719406</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Whatman #1 滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001 090</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Whatman #40 滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>10674122</td><td>或同等产品</td></tr></tbody></table>

负染电子显微镜方法的多种改进：应对复杂体系的工具

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

负染透射电子显微镜（EM）通过使用增强对比度的染色试剂，能够相对简便且快速地观察大分子及大分子复合物。尽管其分辨率有限，最高约为 ~18 – 20 Å，负染 EM 仍适用于多种生物学问题，并可作为冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品快速评估的有效手段。负染流程操作简单：将样品吸附至载体表面，随后施加染液，经吸除、干燥后形成一层电子密度较高的薄染色层，使颗粒嵌入其中。然而，不同样品在不同染色条件下可能表现出显著差异。这促使了多种载体制备技术、负染试剂以及载网洗涤与吸液方法的发展。针对每个具体样品，必须根据实际情况选择最适宜的技术，显微技术人员需掌握多种不同方法，以获得最佳质量的负染结果。本文提供了两种不同载体制备方法和三种不同吸液技术的详细实验方案，并展示了一个因所用方法不同而呈现显著差异的样品实例。此外，还介绍了若干常用负染试剂以及两种新型基于镧系元素的染色剂的配制方法，并讨论了各自的应用特点。

所有测试的染色试剂均在一定程度上产生负染效果，其中UF染色的样品对比度最高，颗粒最清晰、细节最丰富。对于深部包埋的样品（图1），基于镧系元素的染色剂ErAc和TmAc所产生的负染效果在颗粒的可见对比度和清晰度方面与UA相当，其中TmAc产生的图像比ErAc更清晰、更锐利。尽管TmAc的晶粒尺寸较大在高倍放大下较为明显，但当用1% TmAc对烟草花叶病毒（TMV）颗粒染色时，TMV颗粒约23 Å的重复结构仍能通过肉眼清晰观察到，并在原始图像的傅里叶变换中表现为一条明显的赤道层线。17 其他测试的镧系染色剂（ErAc、SmAc和GdAc）均无法分辨该特征。通过从可见螺旋重复结构的TMV颗粒中提取重叠片段生成分类平均图像，随后使用RELION18对提取的片段进行比对和分类，以更清晰地展示该周期性特征（图2）。
某些样品对染色方法特别敏感，例如肌肉来源的C蛋白。C蛋白由一系列柔性的Ig和Fn样结构域串联而成，其负染电镜图像会因染色方法的不同而呈现显著差异（图3）。采用侧向吸滤法时，观察到的是塌陷的环状结构；而使用快速冲洗法或弹洗法染色时，C蛋白则呈现为类似串珠状的一系列结构域。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度</td>
			<td>pH </td>
			<td>类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钼酸铵</td>
			<td>1 - 2 %</td>
			<td>5 – 7</td>
			<td>阴离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸铒 (ErAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸钆 (GdAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钨酸甲胺</td>
			<td>2%</td>
			<td>6 – 7</td>
			<td>阴离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸钐 (SmAC)</td>
			<td>1%</td>
			<td>6</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硅钨酸钠</td>
			<td>1 – 5 %</td>
			<td>5 – 8</td>
			<td>阴离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷钨酸钠</td>
			<td>1 - 3 %</td>
			<td>5 – 8</td>
			<td>阴离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸铥 (TmAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸铀酰 (UA)</td>
			<td>1 – 3%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲酸铀酰 (UF)</td>
			<td>0.75 – 1%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>阳离子型</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：一些常见的负染色试剂。
<img alt="显示纳米结构的电子显微镜图像；六面板分析；形态学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：用不同负染试剂染色的烟草花叶病毒的显微图像示例 (A) 1% UF (B) 2.5% TmAc (C) 2.5% ErAc。(D) 1% UA (E) 2.5% GdAc 和 (F) 2.5% SmAc。比例尺为100 nm。图像来自多次重复实验，每次重复均采集多个区域的代表性图像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电子显微镜结果；a) 显微照片，b) 分类平均图像，c) 衍射图样分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：乙酸铥染色烟草花叶病毒 (A) 用1% TmAc染色的TMV显微照片高倍放大区域。标尺为20 nm。(B) 提取的TMV片段的分类平均图像。(C) A图图像的傅里叶变换，显示约23 Å处的层线反射。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="冷冻电子显微镜图像；蛋白质结构分析；分子观测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： blotting 方法对 C-蛋白构象的影响。 (A) 使用 UA 染色并通过侧面 blotting 法制备的 C-蛋白，以及 (B) flicking 法制备的 C-蛋白。上方图中标尺为 50 nm，下方图中标尺为 20 nm。图像代表多次重复实验中多个区域的典型结果。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

负染电镜是一种用于观察大分子结构的强大技术，但不同的染色方法可能因样本而异，产生不同的结果。本文详细描述了多种负染方法，旨在为解决复杂体系的可视化问题提供初步的工作流程。

负染电子显微镜（EM）通过使用负染技术，可相对简便快速地观察大分子及大分子复合物。

本视频的总体目标是展示几种不同的负染透射电子显微镜样品制备技术的变体。负染色法是快速评估电镜样品质量的最佳方法。需要认识到，不同的载网制备技术对某些样品的效果更佳。对于任何特定样品，最有效的技术必须通过反复试验来确定。首先，使用碳膜法制备透射电镜载网，并按照随附的文字实验方案准备负染试剂。将覆有碳膜的透射电镜载网正面朝上放置在载玻片上。将载网放入辉光放电仪中，在10毫安电流下处理至少30秒，以使载网具有亲水性。处理完成后，从放电仪中取出样品。然后使用一对负压镊子夹住载网边缘。采用侧面染色法染色时，首先将三到五微升样品滴加至支撑面上。让样品在载网表面吸附10秒至1分钟，然后将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用吸去液体。接着，在实验室用膜上放置50微升的超纯水或适当的挥发性缓冲液液滴。轻轻将载网的碳膜表面接触液滴，使少量液滴吸附到载网表面。然后，将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用将液体吸走。接着，在实验室用覆膜纸上放置两滴50 µL的染色试剂。轻轻将载网的碳膜表面接触液滴，使少量液滴吸附到载网的上表面。如果染液扩散至载网背面，则表明碳膜已破损，必须弃用。10至15秒后，将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用将液体吸走。再重复此染色步骤一次，然后让载网自然晾干。若采用 flicking 法染色，需用负压镊子夹住载网边缘，将三至五微升样品滴加到支撑面上。一手持镊子，将载网倾斜至约 45 度角并朝向远离操作者的方向，快速甩动手腕，将附着在载网表面的大部分液滴甩去。然后，使用玻璃巴斯德移液管向支撑表面滴加一滴洗涤液。甩去液滴，并重复数次以清洗样品。接着，向支撑表面滴加一滴染色试剂，再次甩去液滴。根据观察样本所需的染色深度，重复此染色步骤一至三次。用滤纸的撕边轻轻接触载网边缘，去除多余的染液，然后让载网自然晾干。若采用快速冲洗法染色，首先将30至70微升染液吸入200微升移液器的吸头中。旋转旋钮吸取5 µL空气，然后吸取5至30 µL洗涤试剂，接着再吸入一小段空气间隙，之后再吸取5 µL样品。用一对负压镊子夹住载网边缘，将载网倾斜约45度，使碳膜面向外侧。迅速地将移液枪尖中的全部液体沿碳膜表面一次性排出。用滤纸的撕边接触载网边缘，吸去多余的染液，然后让载网自然晾干。负染色法中最合适的染色剂选择高度依赖于样品。最常用的染色剂是醋酸铀酰，但也可使用镧系元素染色剂。对于深部包埋的样品，基于镧系元素的染色剂——乙酸铥和乙酸铒——所产生的负染效果在染色颗粒的明显对比度和清晰度方面与乙酸铀酰相当；其中，乙酸铥产生的图像比乙酸铒更清晰、更锐利。乙酸铥的晶粒较大，在高倍放大下尤为明显，如图中用1%乙酸铥染色的烟草花叶病毒纤维颗粒样品所示。使用乙酸铥时，烟草花叶病毒纤维颗粒的23埃重复结构肉眼即可清晰辨识。其他测试的镧系染色剂均无法分辨此特征。另一种难以成像的样品是来源于肌肉的C蛋白。该样品根据染色方法的不同，会产生显著不同的图像。采用侧向滴染法染色时，其呈现为球状、塌陷的翼形结构。当载网通过 flicking 法制备时，C 蛋白则表现为一系列类似串珠状的结构域，更能真实反映 C 蛋白的实际结构。一旦掌握，制备负染样品仅需约一分钟。需要注意的是，每种样品对不同染色技术的反应各不相同。对于新样品，最佳方法必须通过实验确定。请勿忘记，铀酰染色试剂具有毒性且具有轻微放射性。务必将其弃置于适当的废液处理系统中。

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