负染色电子显微镜方法的变化: 处理具有挑战性的系统的工具

本视频的总体目标是演示制备负染透射电子显微镜样品的技术的几种不同变化。阴性染色是快速评估 EM 样品质量的最佳方法。重要的是要认识到，不同的网格制备技术更适合某些样品。

最适合任何给定样品的技术必须通过反复试验来确定。首先，使用碳片法制备 EM 网格，并按照随附文本方案中的说明制备阴性染色试剂。将碳片涂层的 EM 网格面朝上放在显微镜载玻片上。

将玻片放入辉光放电装置中，并以 10 毫安的电流处理网格至少 30 秒，以使网格亲水。完成后，从出液装置中取出样品。然后，用一对负压镊子夹住网格的边缘。

要使用侧面印迹法染色，首先将 3 到 5 μL 样品涂在支撑面上。让样品吸附到网格表面 10 秒到 1 分钟，然后将网格边缘接触一张滤纸，让毛细管作用拉出液体。接下来，将 50 微升超纯水或适当的挥发性缓冲溶液滴在一张实验室胶片上。

轻轻地将网格的碳表面接触液滴，然后将一个小液滴掀到网格表面。然后，将网格的边缘接触一张滤纸，让毛细管作用拉出液体。接下来，将两滴 50 微升的染色试剂滴在一张实验室胶片上。

轻轻地将网格的碳表面接触液滴，然后将一个小液滴掀到网格的顶部表面。如果污渍迁移到网格的背面，则碳膜已破裂，必须丢弃。10 到 15 秒后，将网格的边缘接触一张滤纸，让毛细管作用吸出液体。

再次重复此染色步骤，然后让网格风干。要使用轻弹法对样品进行染色，请用一对负压镊子夹住网格的边缘，然后将 3 到 5 微升样品涂抹在支撑面上。一只手握住镊子，将网格倾斜，使其背对着外部大约 45 度，然后快速轻弹手腕以弹掉网格顶部的大部分液滴。

然后，使用玻璃巴斯德移液管将一滴洗涤液涂抹在支撑表面上。轻弹液滴并重复几次以洗涤样品。接下来，将一滴染色试剂滴在支撑表面上，然后再次弹掉液滴。

重复此染色步骤一到三次，具体取决于标本可视化所需的染色深度。将一张滤纸的撕裂边缘接触网格边缘，然后让网格自然干燥，以去除多余的污渍。要使用快速冲洗方法对样品进行染色，首先将 30 至 70 μL 的染色剂吸入 200 μL 移液器的尖端。

转动体积刻度盘，吸取 5 微升空气，然后吸取 5 至 30 微升洗涤试剂，然后再吸取一个小气隙，然后再吸取 5 微升样品。用一对负压镊子抓住网格的边缘，并将网格朝外倾斜约 45 度。以一个快速的动作，将移液器吸头的全部内容物弹出到碳涂层 EM 网格的表面。

将一张滤纸的撕裂边缘接触网格边缘，然后让网格自然晾干，以去除多余的污渍。阴性染色的理想选择高度依赖于样品。最常用的染色剂是乙酸铀酰，但也可以使用镧系元素染色剂。

对于深包埋的样品，基于镧系元素的染色剂，乙酸铥和乙酸铒，产生了与乙酸铀酰相当质量的阴性染色，根据染色颗粒的表观对比度和清晰度来判断，乙酸铥产生的图像比乙酸铒更清晰。乙酸铥的大晶粒尺寸在高放大倍率下变得明显，当烟草马赛克纤维颗粒样品用 1% 乙酸铥染色时，如图所示。使用乙酸铥，烟草花叶纤维颗粒的 23 埃重复序列肉眼清晰可见。

测试的其他镧系元素染色剂都无法解决这一特征。另一个难以成像的样本是肌肉来源的 C 蛋白。该样品根据染色方法产生明显不同的图像。

当用侧印法染色时，它表现为球状、塌陷的翅状结构。当通过轻弹法制备网格时，C 蛋白被观察到为一系列结构域，类似于绳子上的珠子。这更好地代表了实际的 C 蛋白结构。

掌握后，只需大约一分钟即可制备阴性染色样品。重要的是要记住，每个样品对每种染色技术的反应都不同。对于新样品，必须通过实验确定最佳方法。

不要忘记铀酰染色试剂有毒且具有轻微放射性。确保它们被丢弃在适当的废物流中。