Name: 中枢神经元轴突静脉曲张形成和恢复的 Microbiomechanical 系统研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 了解利用加压流体系统在培养的海马神经元中诱导可逆轴突静脉曲张的方法。该技术可研究机械应激诱导的神经元可塑性机制，为脑损伤治疗提供药物筛选平台。

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所有动物实验均按照美国国立卫生研究院动物使用指南进行。本工作部分由美国国立卫生研究院向 C. Gu 提供的基金资助（项目编号：R01NS093073 和 R21AA024873）。

以下所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 盖玻片准备
<ol>
	<li>将一盒或多盒12 mm或25 mm盖玻片放入盛有70%硝酸的玻璃烧杯中，在室温下孵育过夜。 
	注意：不要将25 mm盖玻片与12 mm盖玻片在同一烧杯中清洗，建议分别清洗。</li>
	<li>将所有盖玻片转移至一个盛有 2.5 L 去离子水的 4 L 烧杯中2O，并在100 rpm条件下振荡含有盖玻片的烧杯1小时。振荡时使用橡皮筋固定烧杯。用新鲜的2.5 L ddH₂O重复冲洗2O 四次。</li>
	<li>将清洗后的盖玻片转移至带金属盖的干燥烧瓶中，在225 °C烘箱中烘烤6 h，随后冷却至室温。 
	注意：25 mm 盖玻片易碎。需逐片分离后空气干燥，再放入烘箱中烘烤。</li>
	<li>将干燥且清洁的盖玻片存放于灭菌的塑料容器中，室温保存，直至使用。</li>
	<li>按照以下步骤包被盖玻片：
	<ol>
		<li>在离心管中配制新鲜的包被溶液。</li>
		<li>将每张盖玻片放入24孔（或6孔）板的一个孔中。加入30（或100）µL盖玻片包被溶液（表1将溶液滴加到12 mm（或25 mm）盖玻片上并轻轻混匀。向孔中加入1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS，组织培养级）。这些培养板可立即使用，或在无菌PBS中4 °C保存，最长可保存一周。</li>
		<li>解剖当天，移除PBS，空气干燥后将培养板置于紫外灯（30 W）下照射2–4小时。 
		注意：最后一步应在细胞培养超净台内开启紫外灯的条件下完成。应将超净台门略微抬起，以保持空气流通，使盖玻片干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 孕鼠/大鼠海马神经元的分离、解离与培养
<ol>
	<li>用于培养的海马神经元的分离与解离
	<ol>
		<li>解冻蛋白酶溶液（3 mg/mL 蛋白酶 23 溶于 SLDS中， 表1）并预热铺板培养基（表2在 37 °C 下。</li>
		<li>解剖海马组织，并用SLDS冲洗，具体步骤参见先前发表的文献方法14. 
		注意：四个海马体提供的细胞足以用于一个24孔板或一个6孔板。</li>
		<li>去除 SLDS，加入 2 mL 蛋白酶溶液，将样品在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 15分钟。</li>
		<li>用5–10 mL铺板培养基洗涤海马体外植体两次，每次加入5 mL铺板培养基。使用带有1 mL塑料吸头的移液器产生轻微涡旋，将海马体外植体解离成单细胞。上下吹打约40次，避免产生氧气气泡，直至溶液变浑浊且无明显外植体碎片残留。 
		注意：洗涤过程中需保留部分培养基，整个操作过程应确保海马组织外植块始终浸没在培养基中。</li>
		<li>以 1,125 × g 离心 3 分钟。移除上清液，细胞保持浸没在培养基中。将细胞重悬于 145 mL 铺板培养基中。取 1 mL 细胞悬液加入 24 孔板每孔（或取 3 mL 加入 6 孔板每孔）。 
		注意：使用145 mL铺板培养基制备低细胞密度的细胞悬液。该体积可满足六块24孔板、八块6孔板，或根据实验需求选择的不同组合的24孔板和6孔板的铺板需要。每块24孔板的每个孔中约含有3 × 104 细胞9.</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞置于铺板培养基中孵育2 孵育2-4小时后，移除所有铺板培养基，并更换为新鲜的维持培养基。</li>
		<li>2天后（2天 体外，2DIV）时，用含有2 µM Ara-C（阿糖胞苷）的维持培养基替换一半培养液，以抑制成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞的生长。细胞暴露于Ara-C两天后，更换为新鲜的维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于细胞形态观察的转染技术 
	注意：用绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、mCherry 的荧光表达载体转染细胞， 等等。 以揭示单个神经元的形态。
	<ol>
		<li>将构建体从原液（1 µg/µL）用 Opti-MEM 培养基稀释（每 50 µL Opti-MEM 培养基中含 0.8 µg 构建体），涡旋混匀。每个孔准备一份构建体稀释液。 
		注意：24孔板每孔需要0.8 µg质粒，溶于50 µL Opti-MEM培养基中；6孔板每孔需要2.4 µg质粒，溶于150 µL Opti-MEM培养基中。</li>
		<li>将脂质体介导的转染试剂用 Opti-MEM 培养基稀释（每 50 µL Opti-MEM 培养基中加入 1.5 µL 转染试剂），涡旋混匀。每个孔制备一份转染稀释液。 
		注意：24孔板每孔需要1.5 µL转染试剂加入50 µL Opti-MEM培养基中；6孔板每孔需要4.5 µL转染试剂加入150 µL Opti-MEM培养基中。</li>
		<li>将构建物与转染试剂分别用Opti-MEM培养基配制，取等体积（各50 µL，共100 µL）混合后涡旋振荡。室温孵育20分钟。 
		注意：若使用24孔板，每孔应含有约100 µL包含质粒、转染试剂和Opti-MEM培养基的溶液（6孔板每孔为300 µL）。</li>
		<li>从每个孔中移除一半的培养基（24孔板每孔500 µL，6孔板每孔1.5 mL），并将移出的培养基转移至洁净的锥形管中。将该管置于培养箱内。然后向每孔剩余的培养基中加入100 µL混合液（步骤2.2.3）。将细胞在37 °C孵育20–30 min。</li>
		<li>孵育期间（步骤 2.2.4），向锥形管中的培养基加入等体积的新鲜维持培养基（步骤 2.2.4）。将混合液置于同一培养箱中（37 °C 和 5% CO₂）2).</li>
		<li>孵育结束后，从各孔中移除含有转染液的培养基，并替换为锥形管中按1:1比例混合的新旧维持培养基（步骤2.2.5）。 
		注意：根据构建体的大小，细胞可能在12小时内开始表达；对于较大的构建体，可能需要3-4天才能达到表达峰值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置喷射移液装置
注意：该装置包含五个基本组件：玻璃移液管、管路、注射器、显微操作器和缓冲液（Hank's）。任何具有生理相关盐浓度的缓冲液均可用于此装置中。
<ol>
	<li>使用显微拉针仪和表3中的参数，将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成尖端开口直径约为45 µm的微电极。 
	注意：实验条件下发现，45 µm是微电极开口直径的合适尺寸。开口尺寸的轻微变化通常不会显著影响实验结果。需要注意的是，若偏离该数值较大，仍可通过调节与微电极通过导管连接的注射器高度来实现膨体诱导，但需重新校准压力值。</li>
	<li>将未拉制的一端插入细橡胶导管中。 
	注意：导管管壁应较薄且质地坚硬，以最大限度降低流体阻力，确保注射器的高度与流经微电极的液体压力成正比且阻力可忽略不计。导管长度不应超过约0.6 m，以进一步减小阻力。</li>
	<li>通过带有可旋转阀门的连接器，将导管另一端连接至一个10 mL塑料注射器。 
	注意：塑料注射器需保持在恒定且可测量的高度，以准确估算从微电极流出的假设压力。本实验采用190 mm的高度，因其提供的压力最小，但能可靠诱导轴突膨体形成。若压力导致细胞从盖玻片表面脱落，可尝试其他高度值。建议在整个实验过程中使用相同的设置。</li>
	<li>将微电极插入显微操作仪的螺口固定装置中以固定其位置。旋紧显微操作仪臂上附带的金属平头螺丝，使其夹住微电极未拉制的一端，位置应刚好在橡胶导管连接处上方。将微电极倾斜至与含神经元的盖玻片表面呈45°角。 
	注意：显微操作仪的结构应确保在夹持微电极时不会压迫橡胶导管。显微操作仪必须能够在x、y和z方向上移动微电极，以便将其精确定位至细胞可及范围内。下文提供了该装置的示意图和实物照片（图1）。</li>
	<li>打开荧光滤光片，开启光圈，并确认可通过物镜观察到荧光斑点。使用显微操作仪将微电极移动至其尖端与荧光斑点对齐的位置，并将其降低至略高于细胞培养皿（35 mm × 10 mm）表面的高度。到位后，打开透射光并关闭荧光照明。</li>
	<li>使用镊子将一块细胞面向上（朝向微电极）的盖玻片从细胞培养板转移至含有约2 mL室温Hank's缓冲液的细胞培养皿中。</li>
	<li>将含有盖玻片的培养皿放置于显微镜载物台上。</li>
	<li>使用细调焦旋钮和20倍物镜，聚焦于比细胞所在平面高约四整圈（约0.4 mm）的焦平面。利用显微操作仪调整微电极尖端位置，使其在目镜视野中清晰聚焦，并位于该平面左侧中央。 
	注意：树突是应与其胞体处于同一视野中的突起结构。为诱导轴突膨体形成，应追踪从胞体延伸出的较长突起，直至中段和远端轴突。</li>
</ol>
4. 利用可拉伸膜系统校准移液管压力
<ol>
	<li>使用与上述完全相同的参数设置喷射移液装置，作用于包含微加工硅胶膜的系统（直径500 µm，厚度50 µm），并将显微镜聚焦在膜的表面。 
	注意：该系统设计用于测量微小压力值，其原理已有文献报道10。若喷射实验采用完全相同的设置，则此测量仅需进行一次即可。</li>
	<li>将显微镜聚焦于微点阵列（微点直径为4 µm，中心间距为10 µm）。打开截止阀，使液体从移液管中流出。利用共聚焦显微镜观察膜在流体压力作用下的形变情况。</li>
	<li>采用线性模型确定与膜形变相对应的压力值。 
	注意：尽管最近一项研究发现，当注射器高度为190 mm时，膜的形变量为w = -3.143 ± 0.69 µm，但在当前移液管设置下，这对应的压力为0.25 ± 0.06 nN/µm2，处于生理和病理相关范围内；然而注射器高度并非唯一决定因素。其他因素也会影响作用于神经元上的精确压力值，包括移液管开口大小、移液管尖端相对于细胞的位置（距离和角度）以及管路本身的柔韧性4,10。</li>
</ol>
5. 诱导曲张体形成的吹泡法
<ol>
	<li>当移液器就位后，将显微镜聚焦于包含感兴趣区域的焦平面。将细胞及其突起置于成像视野（通过相机实时捕获所见）的左侧半部分，该区域位于喷流作用范围内，而右侧半部分则位于喷流作用范围之外。 
	注意：由于神经元的轴突和树突广泛生长，单个神经元的所有突起几乎不可能全部位于同一喷流作用区域内。这实际上是该系统的一个优势，可用来研究喷流的局部效应。有两种类型的喷流可用于诱导轴突串珠样变：长时间喷流和脉冲式喷流。</li>
	<li>喷流操作
	<ol>
		<li>长时间喷流
		<ol>
			<li>将注射器置于适当高度，即高于含有培养神经元的盖玻片190 mm处4。以优化的曝光时间开始对感兴趣区域进行延时成像，以清晰显示神经元形态。以2秒间隔至少采集15帧图像（共30秒），作为基线数据。根据实验需要，可调整时间间隔。在第16帧时，打开注射器的可旋转止流阀，使液体流动持续75帧（150秒）。在第75帧时，关闭阀门，停止液体流动。停止视频采集。 
			注意：对于培养7–9天的神经元（7–9 DIV），通常在5–10秒内即可诱导出轴突串珠样变，而较老的神经元形成串珠样变所需时间更长。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>脉冲式喷流（持续2秒）
		<ol>
			<li>将注射器置于适当高度（190 mm）。开始延时成像，以2秒间隔至少采集15帧图像（共30秒）。在第16帧时，打开注射器阀门使液体流动，2秒后关闭阀门。等待5–20秒（根据待测试的频率而定）后再次打开阀门。重复开关阀门以产生液体脉冲，总持续时间为150–300秒。继续延时成像20分钟，以记录恢复阶段。 
			&#8203;注意：当脉冲间隔超过10秒时，诱导产生的串珠样变显著减少；在20秒间隔下，脉冲无法诱导出任何串珠样变4。为获得可靠且一致的串珠样变形成，建议注射器高度保持在约190 mm。注射器高度和液体压力不应过高，以免导致细胞从盖玻片表面脱落。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用前一天，用约10 mL 70%乙醇冲洗整个装置（移液器、管路和注射器）进行清洁。乙醇冲洗后，再用10 mL Hank's缓冲液（或其他所需缓冲液）冲洗装置，以完成当日使用的系统预处理。当天实验结束后，按前述方法用乙醇清洗装置，防止污染物在过夜期间生长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 补充方法
注意：喷射实验可与引言部分讨论的多种不同技术结合使用。本文重点介绍最常与喷射实验联合使用的几种核心技术，包括高分辨率荧光延时成像、钙成像以及恢复实验。以下将对这些技术进行详细说明。
<ol>
	<li>按照以下方案进行高分辨率荧光延时成像
	<ol>
		<li>使用100倍油镜追踪神经元内荧光标记蛋白的运动。神经元已转染适当的cDNA构建体。以2秒间隔采集150帧图像（总计300秒）。 
		注意：有时会进行多色延时成像，以同时观察多种荧光标记蛋白的运动。</li>
		<li>通过视频采集软件或ImageJ（NIH）生成走时图（kymograph）。 
		注意：可通过走时图确定运动的速度和方向性。*务必记录所采集区域相对于胞体（soma）的方向。朝向胞体的运动为逆行（retrograde），而从胞体向轴突末端方向的运动为顺行（anterograde）。</li>
		<li>在喷射处理后重复此过程，或可在喷射实验过程中进行图像采集以生成走时图。 
		注意：近期一项研究已证明喷射处理对线粒体和突触蛋白轴突运输的影响4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙离子成像
	<ol>
		<li>向一个孔的培养基中加入1 µL（24孔板）或3 µL（6孔板）的5 mM Fluo-4 AM，并在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>用1 mL Hank's缓冲液洗涤细胞两次。 
		注意：负载染料的神经元可通过FITC滤光片组发出绿色荧光。荧光信号较强的区域表示细胞内存在显著的钙离子浓度变化。当与喷射处理结合时，可观察到荧光强度增加（即细胞内钙离子水平升高）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轴突串珠样结构恢复实验 
	注意：喷射实验结束后，可立即进行20分钟的恢复期观察。
	<ol>
		<li>以4秒间隔采集300帧图像（总计1,200秒）。 
		注意：转染了可溶性YFP/mCherry/GFP的细胞在成像结束时应表现出中等程度（低于50%）的恢复。轴突的恢复程度受多种因素影响，例如培养神经元的发育阶段4。该实验也可与上述高分辨率荧光成像和钙离子成像结合进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该微生物力学检测实验的操作流程简单直接。只要严格按照各个步骤进行，即可获得可靠的结果。其中若干关键步骤若操作不当，将会影响数据的顺利采集。关键步骤始于施加喷射刺激之前。仔细地解剖、培养以及妥善维护原代神经元培养物至关重要。如果培养的神经元状态不健康，则其反应将不一致，因为这些神经元可能已处于应激预激活状态。在培养之后，需耐心完成喷射装置的初始设置与校准，以提供稳定的压力——该压力应足以诱导神经末梢膨大（varicosities），但又不会导致细胞从盖玻片表面脱落。由于移液管堵塞、管路或阀门问题，准确校准整个系统可能需要约1小时。在将细胞放入培养皿并定位移液管尖端之前，必须确保液体能够以最小阻力从移液管中顺畅流出。关于装置的改进，可将喷射装置与灌流系统、膜片钳以及其他基于显微镜的仪器联用，主要取决于显微镜两侧可用的物理空间。
该系统存在两个需要关注的内在局限性。通过向细胞吹入液体，该装置能够持续诱导培养的海马神经元轴突中可逆性串珠样肿胀的形成。然而，需要注意的是，在同一吹液区域内，不同神经元所受到的确切压力值并不完全相同。作用于细胞的流体压力是基于微加工硅胶膜的压力负荷测量计算得出的...

轴突沿线出现的串珠样变性或肿胀/成结，是中枢神经系统多种疾病和损伤中观察到的神经退行性变的显著特征，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和创伤性脑损伤。1,2尽管轴突串珠样膨大对动作电位传导和突触传递具有显著的生理影响3，但其产生机制仍不清楚。最近，利用新建立的微生物力学检测方法对啮齿类动物培养的海马神经元进行研究，我们发现机械刺激可诱导这些神经元产生具有高度引人注目特征的串珠样膨大。首先，串珠样膨大的诱导过程迅速（&#60;10秒），且该过程出乎意料地可逆。其次，串珠状突起的形成依赖于吹流压力的强度：压力越高，串珠状突起的形成速度越快。第三，串珠状突起的形成与神经元的年龄有关。相较于较老的神经元，年轻神经元的轴突对机械应力表现出更高的敏感性。第四，串珠状突起出现在海马神经元的轴突上，而在相同的吹流条件下，这些神经元的树突和轴突起始段则未发生明显变化。因此，本研究揭示了神经元极性的一种新特征。这些发现结合 体外 系统具有生理相关性。使用一种 体内 轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型显示，小鼠在颅骨闭合状态下受到冲击后，体感皮层中的轴突发生多灶性串珠样膨大，与我们的结果一致 体外 结果4需要注意的是，我们对轻度创伤性脑损伤小鼠的染色和成像仅能提供神经元形态变化的瞬时快照，因为进行 体内 在机械冲击过程中对神经元形态进行延时成像仍然不可行。
该流体喷射系统不仅使我们能够捕捉与机械应力诱导的轴突曲张体形成相关的独特特征，还能确定其潜在机制。通过测试不同的细胞外溶液、多种机械敏感性离子通道候选分子的阻断剂和激活剂，并结合细胞电生理学方法，我们发现瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员4（TRPV4）通道在喷射刺激下被激活，对Ca2+和Na+具有通透性，主要负责在轴突曲张体形成初期感知机械应力4。这一结论进一步通过siRNA基因敲除方法得到验证。综上所述，我们建立的这一新型检测系统结合海马神经元培养，对于研究中枢神经元的微观力学特性具有重要价值，尤其适用于与其他技术联合使用。
我们建立的这种微机械系统具有独特性，在多个主要方面不同于以往已有的系统。首先，在该系统中，神经元会受到垂直于平面方向的机械应力，表现为压缩和剪切力。在机械冲击过程中，神经元突起仍附着在盖玻片表面，不会发生移动。这一点不同于其他主要涉及弯曲和平面内拉伸（或张力）的实验系统，例如成束轴突像振动的弦一样发生偏转5,6，或生长在微图案化通道和可拉伸膜上的轴突被拉伸7,8。此外，尽管在这些实验体系中也能诱导出轴突串珠样变性，类似于我们的液体喷射系统，但该过程所需时间显著更长（从10分钟到数小时不等6,7,8），且表现为不可逆。最后，我们的局部液体喷射系统除了可研究串珠形成的时序特征外，还能分析其空间特征（e.g.，树突、树突棘、胞体、轴突起始段、轴突末梢）。利用该系统，我们发现了轴突串珠形成的若干出乎意料且独特的特征，特别是快速起始、缓慢可逆性以及轴突-树突极性差异。
本文所讨论的系统可与多种分子生物学和细胞生物学技术兼容。例如，为研究机械应力对神经元形态和功能的影响，该系统可与髓鞘共培养、荧光共振能量转移（FRET）和全内反射荧光（TIRF）的时间延时成像、钙成像以及膜片钳记录技术联合使用。本文重点介绍该系统的核心组成部分。以下将逐步说明海马神经元培养、液体脉冲施加装置、用于轴突运输的高分辨率时间延时成像以及钙成像的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>12 mm 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0702</td><td>用于 24 孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-545-102&amp;nbsp;</td><td>用于 6 孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11 179 179 001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100 倍溶液 (P/S)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Earle's 盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷 (Ara-C)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>1854313</td><td>转染试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃棒&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>用于吹液移液管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>橡胶管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10 cc 塑料注射器及推杆</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 (35 mm × 10 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>用于钙成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP 质粒&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于细胞转染&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 质粒&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于细胞转染&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Flaming/Brown 微量移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x 物镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>物镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 油镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>物镜&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

轴突曲张体是沿轴突主干分布的膨大结构，具有高度异质性。它们不仅存在于患有神经退行性疾病或脑损伤的脑组织中，也存在于正常脑组织内。本文介绍一种新建立的微机械系统，可快速、可靠且可逆地诱导轴突曲张体的形成，从而帮助我们理解调控曲张体生成及其蛋白质异质性组成的机制。该系统提供了一种新颖手段，用于评估压缩力和剪切应力对神经元不同亚细胞区室的影响，不同于其他主要关注拉伸效应的体外（in vitro）模型。尤为重要的是，得益于本系统的独特特性，我们近期取得了一项新发现：施加压力流体可通过激活瞬时受体电位通道，快速且可逆地诱导轴突曲张体的形成。我们的生物力学系统可方便地与药物灌注、活细胞成像、钙成像以及膜片钳记录技术联合使用。因此，该方法可用于研究机械敏感性离子通道、轴突运输调控、轴突细胞骨架动态、钙信号传导以及与创伤性脑损伤相关的形态学变化。

在施加喷射压力之前，轴突通常很少出现串珠样膨大。在使用标准压力（190 mmH2O 高度）进行喷射后，轴突开始形成大量珠状的串珠样膨大。串珠样膨大的形成具有部分可逆性，如轴突某些区域在恢复10分钟后可回到喷射前的状态（图2A-B）。经过更长时间的恢复（>20 分钟），部分轴突可完全恢复。若喷射移液管位置欠佳，或注射器未能准确置于载物台上方190 mm处，则可能无法快速诱导串珠样膨大的形成。在最佳条件下，年轻神经元（约7天体外培养，7 DIV）的轴突应在约5秒内出现串珠样膨大4。
<img alt="用于轴突运输研究的显微镜装置与微流控系统示意图；细胞图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57202/57202fig1.jpg" data-alt...

本方案描述了一种生理相关、加压液体方法，用于在神经元中快速且可逆地诱导曲张体形成。

轴突曲张体是沿轴突主干分布的膨大结构，具有高度异质性。它们不仅存在于病变脑组织中……

该加压流体装置的总体目标是在培养的神经元轴突上产生可重复且一致的肿胀。该方法有助于回答脑损伤领域中的关键问题，例如神经元损伤后亚细胞形态变化的机制。该技术的主要优势在于，其能够产生随时间可恢复的一致且可重复的形态学改变。这是我们实验室开发的一项非常重要的技术。因为该系统不仅可以用于鉴定调控机械应力诱导轴突形态变化的分子机制——作为一种新型的神经元可塑性形式，还可作为筛选工具，用于发现治疗轻度或创伤性脑损伤的新药物和治疗策略。开始此操作时，将一盒或多盒12毫米或25毫米的盖玻片放入盛有70%硝酸的玻璃烧杯中，在室温下孵育过夜。第二天，将所有盖玻片转移至一个装有2.5升双蒸水的四升烧杯中。以100 RPM的转速振荡含有盖玻片的烧杯一小时，并记得在振荡过程中使用橡皮筋固定烧杯。随后，将清洗后的盖玻片转移至带金属盖的干燥烧瓶中。将盖玻片置于 225 摄氏度的烘箱中烘烤 6 小时。随后使其冷却至室温，并储存在灭菌的塑料容器中备用。现在，将一片盖玻片放入 24 孔板的每个孔中。在12毫米的盖玻片上加入30微升盖玻片包被液并轻轻旋转混匀。随后，向每孔加入1毫升无菌PBS。该培养板可立即使用，也可在无菌PBS中于4摄氏度保存长达一周。解剖当天，从培养板中移除 PBS。风干后将培养板置于紫外光下照射 2 至 4 小时。为分离海马神经元进行培养，将蛋白酶溶液解冻，并将铺板培养基预热至 37 摄氏度。接着，用SLDS冲洗解剖出的海马体。然后将其取出，加入2毫升蛋白酶溶液，并在37°C下孵育15分钟。随后，用5至10毫升铺板培养基洗涤海马体外植体两次，再加入5毫升铺板培养基。使用带有一毫升塑料吸头的移液器产生轻微涡流，将海马组织块解离为单细胞。上下吹打约40次，避免产生氧气气泡，直至溶液变浑浊且无较大组织块残留。随后，将细胞以1,125 × g离心3分钟。吸除上清液，使细胞保持在培养基中，将细胞重悬于145毫升铺板培养基中。随后，每孔加入1毫升细胞悬液至24孔板中。将细胞在37摄氏度的铺板培养基中孵育2至4小时。随后，移除铺板培养基，并更换为新鲜的维持培养基。两天后，将一半培养基更换为含有2 µM RSC的维持培养基，以抑制成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞的生长。接着，在细胞暴露于RSC两天后，再次更换为新鲜的维持培养基。为了观察细胞形态，将构建体从原液用 Opti-MEM 培养基稀释至每微升含一微克，并涡旋混匀。然后，将脂质体介导的转染试剂用 Opti-MEM 培养基稀释，并涡旋混匀。随后，为每个孔分别准备一份构建体稀释液和一份转染试剂稀释液。接下来，将构建物与Opti-MEM培养基的混合物和转染试剂与Opti-MEM培养基的混合物按1:1比例混合，并涡旋振荡。室温孵育20分钟。20分钟后，从每个孔中移除一半培养基，并将该培养基转移至洁净的锥形管中。将离心管保留在培养箱中，然后将上一步制备的混合物100微升加入孔中剩余的培养基中。将细胞在37摄氏度下孵育20至30分钟。孵育期间，向锥形管中的培养基加入等体积的新鲜维持培养基，并将混合物置于同一培养箱中。孵育结束后，从孔中移除含有转染溶液的培养基，并替换为锥形管中等体积新旧维持培养基的混合液。在此操作过程中，将移液管插入显微操作仪的螺口顶端，以固定其位置。拧紧连接在显微操作仪臂上的金属平头螺丝，使其夹住移液管未拉制的一端，位置应刚好位于橡胶管连接处的上方。将移液枪与含有神经元的盖玻片表面呈45度角放置。打开荧光滤光片，打开光圈，并确保可通过物镜观察到荧光亮点。使用显微操作仪，将移液管移动至使其尖端与荧光点对齐的位置，并将移液管下放至略高于细胞培养皿表面的位置。到位后，打开透射光源并关闭荧光光源。使用镊子，将一块载玻片从细胞培养板转移至含有2毫升室温Hank's缓冲液的细胞培养皿中，转移时使细胞面朝向移液管。使用细调焦旋钮和20倍物镜，将焦平面调至细胞上方约四整圈的位置。随后，利用显微操作器调整移液管尖端，使其通过目镜观察时位于视野左侧中央的焦平面上。移液管定位后，将显微镜聚焦于包含目标区域的焦平面。对七天大的小鼠海马神经元进行成像，这些神经元经GFP转染，在施加喷 puff 操作前后以及随后的10分钟恢复期内均可见轴突。此处为同一神经元延时成像的线扫图（Kymograph）。红色箭头指示在30秒时开始施加190毫升H₂O喷 puff 操作后150秒内形成的串珠样膨大结构。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在完成该步骤后，可进一步开展全细胞记录、时间分辨FRET和TIRF成像以及钙成像等其他方法，以回答更多科学问题，例如机械应力对神经元电信号传导、钙信号、蛋白质转运与相互作用的影响。该技术建立后，为研究光诱导创伤性脑损伤的科研人员阐明活神经元中轴突串珠样结构形成的分子机制铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何开展实验以研究中枢神经元的机械感觉。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

中枢神经元轴突静脉曲张形成和恢复的 Microbiomechanical 系统研究

可将活的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中利用原子力显微镜（AFM）进行成像。...

用于原子力显微镜成像的细菌固定方法

本视频展示了一种利用微流控腔室系统追踪运动神经元轴突运输的方法。该方法包括将小鼠胚胎脊髓组织培养在聚合物包被的孔中，并加入营养培养基以诱导轴突生长。通过活体成像观察荧光染料标记的细胞器的运动，可证实轴突的双向运输。...

使用微流控装置追踪运动神经元中细胞器的轴突运输

本视频展示了通过在神经元上施加微机械刺激来诱导轴突串珠样变的过程。该系统由连接至注射器的微移液管组成，注射器通过管路内含缓冲液。使用显微操作器将微移液管定位在神经元上方，随后施加流体压力，以诱导轴突形成串珠样结构。...

通过微机械刺激在神经元中诱导轴突串珠样膨大

尽管周围神经系统（PNS）在损伤后具有显著的修复能力，但调控这一现象的细胞和分子机制仍知之甚少。通过使用活体转基因斑马鱼和可重复的神经横断实验，我们能够研究神经变性和再生过程中胶质细胞的动态行为。...

运动神经切断及活体斑马鱼中胶质细胞行为的延时成像

双光子成像结合激光纳米解剖技术是研究中枢神经系统中退行性与再生过程的有力工具，可实现亚细胞分辨率下的观察。本方案展示了如何在小脑皮层中对单根攀缘纤维进行标记、成像与解剖 体内.

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一个 离体 实时评估轴突变性机制的激光诱导脊髓损伤模型

本文介绍了一种基于脊髓切片在多电极阵列上培养的方案，用于研究脊髓固有连接的功能性再生 体外.

在多电极阵列上培养的脊髓组织共培养物中研究功能再生

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制。在本方案中，我们提供了一种详细的方法，利用微流控小室对运动神经元轴突中酸性区室和线粒体的轴突运输进行示踪。...

使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

了解利用加压流体系统在培养的海马神经元中诱导可逆轴突静脉曲张的方法。该技术可研究机械应激诱导的神经元可塑性机制，为脑损伤治疗提供药物筛选平台。

用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统

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