中枢神经元轴突静脉曲张形成和恢复的 Microbiomechanical 系统研究

这种加压液体设置的总体目标是沿着培养神经元的轴突产生可重复且一致的肿胀。这种方法可以帮助回答脑损伤领域的关键问题，例如损伤后神经元亚细胞形态变化背后的机制。这种技术的主要优点是该方法产生一致且可重复的形态变化，这些变化会随着时间的推移而恢复。

这是我们在实验室开发的非常重要的技术。这是因为我们不仅可以使用该系统来识别控制机械应力诱导的轴突形态变化的分子机制作为一种新的神经元可塑性，还可以将该系统用作筛选工具来识别新药和轻度或创伤性脑损伤的治疗策略。要开始此过程，将一盒或多盒 12 毫米或 25 毫米的盖玻片放入含有 70% 硝酸的玻璃烧杯中，并将盖玻片在室温下孵育过夜。

第二天，将所有盖玻片转移到装满 2.5 升双蒸水的 4 升烧杯中。以 100 RPM 的速度摇动装有盖玻片的烧杯 1 小时，并且在摇动过程中不要忘记使用橡皮筋固定烧杯。随后，将清洁后的盖玻片转移到带有金属盖的干燥烧瓶中。

将盖玻片放入 225 摄氏度的烤箱中烘烤 6 小时。然后，让它们冷却至室温并存放在消毒的塑料容器中直至使用。现在，将一个盖玻片放入 24 孔板的每个孔中。

将 30 微升盖玻片涂层溶液添加到 12 毫米盖玻片上并涡流。然后，向每个孔中加入 1 毫升无菌 PBS。该板可以立即使用，也可以在 4 摄氏度的无菌 PBS 中储存长达一周。

在解剖当天，从板中取出 PBS。风干并将板置于紫外线下 2 到 4 小时。为了解离海马神经元进行培养，解冻蛋白酶溶液并在 37 摄氏度下预热铺板培养基。

接下来，用 SLDS 冲洗解剖的海马体。然后，将其取出并加入 2 毫升蛋白酶溶液，并在 37 摄氏度下孵育样品 15 分钟。然后，用 5 至 10 毫升的电镀培养基洗涤海马外植体两次，并加入 5 毫升的电镀培养基。

通过使用带有 1 毫升塑料尖端的移液管产生小涡旋，将海马外植体解离成单细胞。上下移液约 40 次，避免形成氧泡，直到溶液变得浑浊并且没有大块的外植体残留。接下来，以 1， 125 倍重力离心细胞 3 分钟。

去除上清液，将细胞浸没在培养基中，并将细胞重新悬浮在 145 mL 铺板培养基中。然后，每孔向 24 孔板中加入 1 毫升细胞悬液。将细胞在 37 °C 的铺板培养基中孵育 2 至 4 小时。

然后，去除电镀介质并用新鲜的维护介质替换。两天后，用溶解在维持培养基中的两微摩尔 RSC 替换一半的培养基，以抑制成纤维细胞、内皮细胞和神经胶质细胞的生长。然后，将细胞暴露于 RSC 中两天后，用新鲜的维持培养基更换培养基。

为了转染以观察细胞形态，在 Opti-MEM 培养基中以 1 μg/μL 的浓度从原液中稀释构建体并涡旋。然后，在 Opti-MEM 培养基中稀释脂质体介导的转染试剂并涡旋。随后，为每个孔准备一种构建稀释液和一种转染稀释液。

接下来，制备构建体与 Opti-MEM 培养基和转染试剂以及 Opti-MEM 培养基的一对一混合物，然后涡旋。将混合物在室温下孵育 20 分钟。20 分钟后，从每个孔中取出一半的培养基，并将该培养基转移到干净的锥形管中。

将试管保存在培养箱中，然后将 100 微升上一步制备的混合物添加到孔中剩余的培养基中。让细胞在 37 摄氏度下孵育 20 到 30 分钟。在孵育过程中，向锥形管中的培养基中加入一体积的新鲜维持培养基，并将混合物放入同一培养箱中。

孵育后，从孔中取出含有转染溶液的培养基，并在锥形管中用旧维持培养基和新鲜维持培养基的一对一混合物替换。在此过程中，将移液器插入显微作器的螺口以将其固定到位。拧上连接到显微作器臂的金属平顶螺钉，使其将移液器未拉出的一端固定在连接橡胶管的位置上方。

将移液管与包含盖玻片的神经元表面成 45 度角。打开荧光滤镜。打开孔径，确保可以看到透过物镜的荧光点。

使用显微作器，将移液器移动到使吸头与荧光点对齐的位置，然后将移液器降低到刚好高于细胞培养皿高度的位置。就位后，打开透射光并关闭荧光。使用镊子将一个盖玻片，细胞朝向移液管，从细胞培养板转移到室温下含有 2 毫升 Hank 缓冲液的细胞培养皿中。

使用微调旋钮和 20 倍物镜，聚焦在单元上方约 4 整圈的平面上。随后，使用显微作器定位移液器吸头，使其聚焦并在通过目镜看到的平面左中侧。移液器就位后，将显微镜聚焦在包含感兴趣区域的平面上。

在 7 div 的成像中，GFP 转染的小鼠海马神经元在膨化前后出现轴突，以及随后的 10 分钟恢复期。这是同一神经元的延时成像 Kymograph。红色箭头表示从 30 秒开始，190 毫升 H2O 抽吸 150 秒后形成的静脉曲张。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。在此程序之后，可以执行其他方法，如全细胞记录、延时 FRET 和 TIRF 成像以及钙成像，以回答其他问题，例如机械应力对神经和电以及钙信号的影响、蛋白质运输和相互作用。开发后，这项技术为光创伤性脑损伤的研究人员解释了活神经元轴突静脉曲张形成的分子机制铺平了道路。

看完这个视频后，你应该对如何进行实验来研究中枢神经元的机械感觉有了很好的理解。