Name: 基于分子印迹的电容生物传感器超灵敏检测生物标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解基于分子印迹的电容生物传感器技术，用于超灵敏检测复杂样本中的低丰度生物标志物。该方法无需标记即可实现实时定量，适用于环境监测、食品安全和医学诊断等领域。

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感谢玛丽亚·鲍姆加滕（Maria Baumgarten，隆德大学感染医学系IQ生物技术平台）进行并提供了扫描电子显微图像。本研究得到了瑞典研究理事会Formas（2017-00100）的资助，该资助属于欧洲第三届抗菌药物耐药性联合规划倡议（JPIAMR）“传播动力学”项目的一部分&#34;。资助方在研究设计、结果解读、论文撰写与准备、投稿决定或发表决定方面均未参与。

1. 玻璃盖玻片的修饰（模板印章）
<ol>
	<li>清洗玻璃盖玻片时，依次将其浸入10 mL的1.0 M HCl、去离子水和1.0 M NaOH中，每步在室温下超声处理10分钟。
	<ol>
		<li>用氮气吹干玻璃盖玻片。 
		&#8203;注意：盖玻片在氮气流下通过蒸发干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将清洗并干燥后的盖玻片浸入10% (v/v)、10 mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）乙醇溶液中，室温下反应1小时，以在盖玻片表面引入氨基。
	<ol>
		<li>用去离子水冲洗盖玻片。</li>
		<li>用氮气吹干盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将经APTES修饰的盖玻片浸入5% (v/v)、10 mL的戊二醛溶液（溶于10 mM磷酸缓冲液，pH 7.4）中，室温下反应2小时，以活化表面的氨基6,15。
	<ol>
		<li>用10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）冲洗盖玻片，以去除表面残留的过量戊二醛。</li>
		<li>用氮气吹干盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）中配制1.0 mL模板（蛋白质/噬菌体）溶液，浓度为0.1 mg/mL。 
	&#8203;注意：将0.1 mg蛋白质溶解于1.0 mL磷酸缓冲液（10 mM，pH 7.4）中。必要时可使用分光光度计（280 nm）测定蛋白质浓度。
	<ol>
		<li>取200 µL该模板溶液滴加至修饰后的盖玻片上，4 °C下孵育过夜。 
		注意：多余的模板溶液可用于制备1–2个额外的模板印模，供表征研究使用。</li>
		<li>用10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）冲洗盖玻片，以去除表面未结合的模板。 
		注意：冲洗电极时，用磷酸缓冲液（10 mM，pH 7.4）洗涤30秒。</li>
		<li>用氮气吹干盖玻片。 
		注意：盖玻片应保存在4 °C，直至用于聚合反应步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 电容性金电极的修饰
<ol>
	<li>清洁电极时，将电极依次浸入盛有以下溶液的小烧杯中：70%乙醇 5 mL、去离子水、丙酮、去离子水、酸性 piranha 溶液（3:1，H2SO4:H2O2，v/v）和去离子水，每步在室温下超声处理 10 分钟。
	<ol>
		<li>用氮气吹干电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行酪胺的电聚合，配制 8 mL 含乙醇（2 mL）的 10 mM 酪胺溶液，溶剂为 10 mM 磷酸缓冲液（pH&#160;7.4）15。 
	&#8203;注意：酪胺溶液的总体积必须为 8 mL，其中包括 2 mL 乙醇。
	<ol>
		<li>使用恒电位仪在此溶液中进行循环伏安扫描（15 个循环），电位范围为 0 - 1.5 V（Ag/AgCl），扫描速率为 50 mV/s30。</li>
		<li>用去离子水冲洗电极。</li>
		<li>用氮气吹干电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将电极浸入含有 30 mM 丙烯酰氯和 30 mM 三甲胺的甲苯溶液中（Vtotal = 5 mL），室温下反应过夜6,15,30。
	<ol>
		<li>用去离子水冲洗电极。 
		注意：为更有效地去除未反应的丙烯酰氯和三甲胺残留物，可在去离子水清洗后用 NaOH 溶液进一步洗涤表面。</li>
		<li>用氮气吹干电极。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 模板印迹电容金电极的制备
<ol>
	<li>噬菌体印迹电容型金电极的制备
	<ol>
		<li>在聚合之前，配制单体溶液：将单体（N-羟甲基丙烯酰胺）与交联剂（聚乙二醇-400-二甲基丙烯酸酯）按1:5（摩尔比）的比例溶于1 mL 10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）中。 
		注：单体与交联剂的比例可根据模板进行优化调整，也可更换不同类型的单体或交联剂以实现特异性相互作用的优化。</li>
		<li>向该溶液中加入1 mg光引发剂。 
		注：若采用紫外光引发聚合，则必须使用光引发剂；若采用自由基聚合，则需更换相应类型的引发剂。</li>
		<li>用移液器将1.5 µL该溶液滴加至修饰金电极的金表面。 
		注：电极的金表面结构示意图见图1。</li>
		<li>将模板印章与金电极表面的单体溶液接触。</li>
		<li>启动紫外光聚合（365 nm，400 W），持续15 min31。 
		注：紫外光聚合在冷却柜内进行，聚合开始前将冷却柜预冷至-25 °C。随后开启紫外光固化系统，聚合反应持续15 min后关闭紫外光固化系统。</li>
		<li>使用镊子将模板印章从表面移除。 
		注：移除模板印章时，表面的聚合物薄膜可能受损，因此应小心、缓慢地操作，避免施加外力。</li>
		<li>用去离子水冲洗电极表面，并用氮气吹干。</li>
		<li>将电极浸入1 mL乙醇中配制的10 mM 1-十二硫醇溶液中，处理20 min，以封闭电极表面的针孔。</li>
		<li>用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹电容型金电极的制备
	<ol>
		<li>在聚合之前，将单体（丙烯酰胺：54 mg；N-羟甲基丙烯酰胺：140 µL；N-异丙基丙烯酰胺：85.6 mg）与交联剂（亚甲基双丙烯酰胺：9.5 mg）溶于820 µL超纯水中，配制成单体溶液30,32。</li>
		<li>用超纯水配制5%（v/v）的N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）溶液。</li>
		<li>向单体溶液中加入20 µL TEMED溶液，并通入氮气5 min。</li>
		<li>用超纯水配制10%（w/v）的过硫酸铵（APS）溶液。</li>
		<li>向单体溶液中加入20 µL APS溶液。</li>
		<li>用移液器将1.5 µL单体溶液滴加至修饰金电极表面。</li>
		<li>将模板印章与经单体处理的表面接触。</li>
		<li>在室温下开始聚合，持续5 h。 
		注：制备蛋白质印迹金电极时，采用APS-TEMED作为引发-催化体系，在室温（25 °C）下进行自由基聚合，而非紫外光聚合。</li>
		<li>使用镊子小心地将模板印章从表面移除。</li>
		<li>用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干。</li>
		<li>将电极浸入1 mL乙醇中配制的10 mM 1-十二硫醇溶液中，处理20 min，以封闭电极表面的针孔。</li>
		<li>用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用扫描电子显微镜（SEM）表征电极表面
<ol>
	<li>使用导电胶带将样品固定在铝制样品台上。</li>
	<li>用10 nm厚的钯/金对电极进行镀膜。</li>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM）观察电极。</li>
</ol>
5. 使用模板压印电容式金电极进行实时电容测量
<ol>
	<li>将印迹电容式金电极插入集成到电容型生物传感器中的电化学流动池。</li>
	<li>配制 100 mL 再生缓冲液（25 mM 甘氨酸-盐酸，pH 2.5，含 50 mM Tween-20）和 1 L 运行缓冲液（用于噬菌体印迹系统：10 mM 磷酸盐，pH 7.4；用于蛋白质印迹系统：50 mM Tris-盐酸，pH 7.4）。</li>
	<li>开始分析时，先注入再生缓冲液以再生系统，再注入运行缓冲液使系统重新平衡 25 分钟。</li>
	<li>在运行缓冲液中配制所需浓度范围的标准模板溶液。 
	注意：首先通过将 0.1 mg 蛋白质或约 108 pfu 噬菌体溶解于 1.0 mL 磷酸盐缓冲液（10 mM 磷酸盐，pH 7.4）中配制模板溶液的储备液。然后，将储备液连续进行十次十倍稀释，制备用于标准曲线的标准溶液。这些溶液将在步骤 5.5 中使用电容型生物传感器进行分析。蛋白质浓度可通过分光光度计（280 nm）测定。为测定噬菌体浓度，可采用双层琼脂法，该方法此前已有详细描述19。</li>
	<li>在最佳条件下（流速：100 µL/min，温度：25 °C），依次向系统中注入 250 µL 上述标准溶液。 
	注意：在本应用中，标准蛋白质溶液的浓度范围为 1.0 x 10-4&#160;–1.0 x 10-14，而噬菌体浓度范围为 1.0 x 101&#160;–1.0 x 105 pfu/mL。将溶液置于进样阀中，通过单个注射泵和多通阀依次进样，每个样品重复进样三次。仪器软件自动监测标准溶液注入后因模板分子与印迹空腔结合所引起的电容下降。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在执行该方法时，遵循方案过程中必须考虑一些关键步骤。其中一个关键步骤是使用酸性piranha溶液进行清洗。步骤2.1的时间不得超过10分钟。步骤1.4中的模板溶液浓度不得超过0.1 mg/mL，因为这些参数此前已优化确定。循环伏安扫描的循环次数不得超过15次，以获得最佳厚度。对于步骤3.1.3，1.5 µL为已优化的数值，针对此类特定电极，该值不得更高。若UV固化系统的功率为400 W，则聚合反应时间最长应控制在10 - 15分钟。在TEMED之后一旦加入APS（引发剂），必须立即快速进行后续操作，以避免发生迅速聚合（步骤3.2.5）。
最关键的步骤之一是在紫外光聚合后从表面移除模板印章。如果此步骤操作不当，可能会导致电极表面的聚合物薄膜随印章一起被剥离。因此，建议在聚合完成后，将电极及其上方的蛋白印章浸入水溶液中，然后非常缓慢而小心地从表面移除印章（步骤 3.1.6）。
根据所用模板，可通过改变所用单体的类型和比例（功能单体与交联剂）来评估其对提高灵敏度的影响，这需要通过实验确定。此外，模板分子的亲和结合通常涉及多种不同的相互作用同时发生，因此可能在再生步骤中引发问题。如果结合的模板未能从表面充分释放，可能会影响电极在后续分析中的重复使用性。这些多点亲和作用也可能源于较弱相互作用的结合，在此类系统中可能发生非特异性结合，从而对系统的选择性产生负面影响16。这些是该方法常见且普遍存在的局限性。
除了这些特定的局限性之外，与现有方法相比，所讨论的方法具有许多显著优势。尽管放射免疫分析法（RIAs）、酶联免疫吸附测定法（ELISAs）和荧光测定法具有很高的灵敏度，但它们都需要使用标记材料（无论是模板还是检测器），而该生物传感器则完全无需标记。这些方法的成本也更高，且耗时更长。采用生物传感器方法可同时快速平行合成不同组成的分子印迹聚合物（MIPs）16。由于制备过程仅需几微升单体溶液，因此在使用昂贵或来源有限的单体时，该方法尤为便捷。此外，单个MIP电极可重复使用约80次，性能无明显下降，远高于其他现有方法30。现有方法在不同程度上还存在灵敏度和选择性较低的问题，而本方法能够以高选择性实现对皮摩尔（pM）浓度范围内分子的检测与定量。
与现有方法相比，由于生物传感器具有成本效益高、仪器操作简便以及能够在短时间内实现实时灵敏检测等优势，因此在野外条件下作为现场即时检测系统极具前景；例如，可用于环境监测以及发展中国家的应用场景。在许多疾病诊断应用中，需要在血清等复杂混合物中对生物标志物进行实时、灵敏、选择性强且快速的检测15,25。在这些方面，生物传感器优于现有方法，尤其得益于其出色的稳健性和灵敏度。在病原微生物检测方面，近年来噬菌体因其对宿主细菌的高度特异性，被视为生物传感器中一种有潜力的替代性生物识别元件33,34,35。使用噬菌体替代抗体极具前景，不仅可进一步降低成本，还能提高检测系统的稳定性36。此类系统还可用于环境中及临床样本中特定噬菌体的检测与定量。鉴于噬菌体的广泛存在及其可将抗生素抗性基因转导至细菌的能力37,38，该方法在研究耐药菌传播方面可能具有重要价值。

生物分子的定量分析在科学界的许多不同研究领域中被广泛应用，常用方法包括放射免疫分析法（RIA）或酶联免疫吸附测定法（ELISA）1。其中一些方法需要使用标记试剂，例如放射性同位素或酶标记的抗体/抗原，导致其实验过程繁琐、耗时且劳动强度大2。此外，这些方法的稳定性、选择性和灵敏度并不足以满足所有分析需求，尤其是在需要检测飞克（attogram）级别而非皮克（pictogram）级别物质时，其性能尤为不足3。为此，生物传感器已引起广泛关注4,5，特别是当其与分子印迹技术结合时，可显著提高检测的稳定性。
分子印迹技术依赖于在模板周围聚合功能单体以形成空穴6，从而构建出与模板结构高度匹配的人工识别位点7。该技术已应用于多个领域，包括药物递送系统和分析分离，同时也被用作生物传感器中的生物识别元件8,9,10。然而，在针对蛋白质和细胞等大分子模板设计分子印迹聚合物（MIPs）时仍存在一些挑战11,12。为此，许多研究人员致力于将模板蛋白直接印迹在基底表面，从而构建出可特异性识别目标蛋白的表面结构12。这种用于大分子及复合物（包括蛋白质）识别空穴构建的表面涂层技术被称为微接触印迹技术13,14。该方法的一般流程依赖于两个表面之间的聚合反应——其中一个表面为吸附了模板的印模，另一个为经单体处理的聚合物基底15,16，两者接触后通过紫外光引发聚合，在基底上形成一层薄聚合物膜。最后去除模板，从而在印迹电极表面留下与模板特异性匹配的空穴。该方法具有一些优势，例如可显著减少印迹分子的活性损失，且所需模板分子用量极少16,17。因此，可在传感器表面构建出成本低、稳定性高、灵敏度高且选择性强的识别层，适用于任意用户指定的模板分子。
该生物传感器可用于检测&#160;单个蛋白质以及&#160;更大的生物大分子，包括病毒。近年来受到广泛关注的一类特定病毒是噬菌体，即能够感染细菌的病毒。在生物技术和生物制药过程中，快速且灵敏地检测噬菌体对于判断细菌培养物是否受到噬菌体感染至关重要18。目前最常用的噬菌体检测生物学方法是双层琼脂法19，但该方法费时且操作繁琐。已有多种尝试致力于开发用于病毒（包括噬菌体）检测的新型诊断工具，例如原子力显微镜（AFM）20、干涉测量法21、电化学技术22以及传感器系统23,24。由于生物传感器具有操作简便、高灵敏度以及可实现实时测量等优势，大量研究工作已集中于此类技术15,25。其中一种特定类型的生物传感器基于电容变化原理。这类电容型生物传感器属于电化学传感器，当分析物与传感器表面的生物识别元件相互作用时，会引起介电性质的变化，从而导致电容降低2,4。电容型生物传感器已被用于检测多种分析物，如抗原、抗体、蛋白质和重金属离子6,26,27,28。此类生物传感器具备诸多优点，包括固有的快速响应、高灵敏度、结构简单、成本低、易于操作以及无需标记即可实现实时测量29。
本文所述方法旨在实现对高度复杂样品中低丰度生物分子的检测与定量，且无需使用任何标记。该技术尤其适用于阿克至皮克范围内的生物分子检测，而在此范围内，其他现有的商用仪器难以对其目标分子进行准确定量。

<table><tbody><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>102222</td><td>蛋白印章</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td>清洗</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068-100ML</td><td>清洗</td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>BRANSONIC M1800- E</td><td>清洗</td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td>修饰</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009836010</td><td>冲洗/清洗</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td>交联剂</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850-1L-M</td><td>清洗</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741-100ML</td><td>piranha 溶液</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td>piranha 溶液</td></tr><tr><td>酪胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T90344-5G</td><td>修饰</td></tr><tr><td>CompactStat</td><td>Ivium Technologies</td><td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td><td>恒电位仪</td></tr><tr><td>铂对电极套件</td><td>Equilabrium</td><td>AFCTR5</td><td>恒电位仪</td></tr><tr><td>参比电极</td><td>Equilabrium</td><td>RREF0021</td><td>恒电位仪</td></tr><tr><td>丙烯酰氯</td><td>EMD Millipore</td><td>8.00826.0100</td><td>修饰</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>EMD Millipore</td><td>8.08352.0100</td><td>修饰</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-100ML</td><td>修饰</td></tr><tr><td>N-羟甲基丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>功能单体</td></tr><tr><td>聚乙二醇-400-二甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409510-250ML</td><td>交联剂</td></tr><tr><td>2-羟基-4&amp;prime;-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-50G</td><td>功能单体</td></tr><tr><td>紫外聚合仪</td><td>Dymax</td><td>Dymax 5000ECE</td><td>紫外聚合</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777-1EA</td><td>耗材</td></tr><tr><td>1-十二烷硫醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471364-100ML</td><td>封闭剂</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td>功能单体</td></tr><tr><td>N-羟甲基丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>功能单体</td></tr><tr><td>N-异丙基丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415324-50G</td><td>功能单体</td></tr><tr><td>亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072-500G</td><td>交联单体</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td>催化剂</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>引发剂</td></tr><tr><td>电容式生物传感器</td><td>CapSenze</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Merck</td><td>1042011000</td><td>再生缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td>再生缓冲液</td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352-1KG</td><td>运行缓冲液</td></tr><tr><td>Na2HPO4&amp;nbsp;&amp;bull; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567547-1KG</td><td>运行缓冲液</td></tr><tr><td>NaH2PO4&amp;nbsp;&amp;bull; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567549-1KG</td><td>运行缓冲液</td></tr><tr><td>DELPHI 相关光镜与电镜系统</td><td>Phenom-World</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>电容式金电极</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>耗材</td></tr><tr><td>2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090-25G</td><td>光引发剂</td></tr><tr><td>CapSenze Smart 软件</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>软件程序</td></tr></tbody></table>

基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

在自然科学领域，检测并定量复杂溶液中的生物分子始终备受关注，该技术可用于生物标志物、污染物及其他目标分子的检测。一种常用的技术是酶联免疫吸附测定（ELISA），该方法通常使用一种针对特定目标分子的抗体，以及另一种带有标记的抗体来检测初级抗体，从而实现对目标生物分子的绝对定量。然而，使用抗体作为识别元件限制了该方法的稳健性，同时依赖标记分子也带来一定局限。为克服这些不足，已引入分子印迹技术，通过构建与模板分子互补的人工识别位点，从而无需使用抗体进行初始结合。此外，为进一步提高灵敏度，可采用基于电容检测目标分子的生物传感器，替代传统的标记二抗。在本实验方案中，我们描述了一种快速、无标记地检测和定量复杂样本中低丰度生物分子（蛋白质和病毒）的方法，其灵敏度显著优于ELISA等常规检测系统。该方法完全基于分子印迹技术与电容生物传感器的结合实现。

按照协议，根据图1中的示意图，将在裸金电极上印制代表生物大分子结构的模板。该电极可用于电容型生物传感器（图2），从而实现模板在电极上的稳定固定，并可在模板结合时测量电容的变化。
电容型生物传感器的示意图如图2所示。图中清晰可见中心泵，其作用是在再生过程中持续向流动池注入运行缓冲液（10 mM 磷酸盐，pH 7.4）和再生缓冲液（25 mM 甘氨酸-盐酸，pH 2.5）。流动池由工作电极、参比电极和对电极组成。进样阀包含标准蛋白/噬菌体溶液，这些溶液首先通过脱气装置，然后依次注入系统。一旦溶液到达插入流动池中的工作电极，即可实时监测反应结果。通过观察计算机屏幕上的传感器图，可记录电容值的变化。
图3 和 图4 显示裸金电极与印迹金电极表面之间的差异。该表征步骤至关重要，用于确认印迹后电极表面存在聚合物空穴，这些空穴在表面呈现为粗糙度。除扫描电镜（SEM）外，其他表征方法还包括原子力显微镜（AFM）、接触角测量和椭圆偏振光谱法 等等。，可用于表征压印后的表面。通过这种方法，可以确保压印过程成功，并在表面形成模板空穴。在这些空穴内，模板能够以高特异性和高亲和力结合。
在将标准溶液注入电容系统后，软件自动计算最后五个读数的平均值，并通过绘制电容变化量与分析物浓度的关系曲线获得校准图。记录到的电容降低源于模板分子的结合。根据电容测量的一般原理，结合到金电极表面的分子越多，总电容的降低幅度越大。 图5 和 图6 表明随着分析物浓度的增加，ΔC 也随之增加，符合预期。动态范围（即系统可用于特异性检测目标物的有效浓度区间）和检测限（LOD）可通过分析这些图谱进行评估。根据 图6，噬菌体印迹电容型生物传感器可在10的浓度范围内检测噬菌体1 - 105 pfu/mL，本研究的检测限（LOD）为10 pfu/mL。两者 图5 和 图6 还需强调应在与模板浓度预期范围相同的区间内测定标准曲线，因为回归的线性关系可能随浓度变化而不同。图5），或具有不同的斜率（图6）。还应注意，由于所用浓度较低，该系统对波动非常敏感（样品浑浊、气流扰动等）。 等等。），因此建议至少进行三次重复实验，以降低纳入离群值的可能性。出于同样原因，对于高度稀释的样本，标准差可能会相当显著，如图中所示。 图6.
<img alt="微接触印迹过程示意图；BSA固定化，金电极上的紫外光聚合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1。微接触印迹方法的示意图。（A）玻璃盖玻片（模板印章）的制备，（B）电容型金电极的制备，（C）通过紫外光聚合将模板微接触印迹到金电极表面，以及（D）从电极表面去除模板（经许可转载自 Ertürk et al., Biotechnology Reports 2014 (3): 65 - 72）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于蛋白质纯化与分析的噬菌体展示方法示意图及色谱装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 电容式生物传感器的示意图。 本研究中所用电容式生物传感器的整体结构（经许可转载自 Ertürk et al., Biotechnology Reports 2014 (3): 65 - 72）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="扫描电子显微分析；图像A：光滑表面，图像B：纤维状结构；5000倍放大。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 蛋白质印迹电极的扫描电子显微镜分析。 SEM图像显示（A）裸金电极（比例尺 = 20 µm），以及（B）蛋白质印迹电容型金电极（比例尺 = 10 µm）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="非晶结构的扫描电镜图像；显微镜结果，材料表面分析，形貌研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 噬菌体印迹电极的扫描电子显微镜观察。 裸金电极的扫描电镜图像（比例尺 = 20 µm）（A），以及不同放大倍数下的噬菌体印迹电容型金电极图像（6600×，比例尺 = 10 µm）（B）和 11,500×，比例尺 = 5 µm）（C）；箭头指示附着的噬菌体。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电容随细菌蛋白浓度变化的图表，含线性回归方程和R²值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 缓冲液组成对校准曲线的影响。 在最佳条件下绘制的校准曲线，显示电容随蛋白浓度的变化（运行缓冲液：50 mM Tris-HCl，pH 7.4；再生缓冲液：25 mM 甘氨酸-HCl，pH 2.5，含50 mM Tween-20；流速：100 µL/min；样品体积：250 µL；温度：25 °C）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电容变化与病毒浓度的关系图；误差棒显示数据变异性；趋势分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 大生物大分子的代表性校准曲线。该校准曲线显示了在最佳条件下电容变化与噬菌体浓度之间的关系（运行缓冲液：10 mM 磷酸盐，pH 7.4；再生缓冲液：25 mM 甘氨酸-盐酸，pH 2.5，含 50 mM Tween-20；流速：100 µL/min；样品体积：250 µL；温度：25 °C）<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用分子印迹技术结合电容型生物传感器检测和定量复杂溶液中低丰度分子的实验方案。

在自然科学领域，检测并定量复杂溶液中的生物分子始终备受关注；该技术被用于……

该技术的总体目标是高灵敏、简便、低成本、快速地检测并定量高度复杂样品中丰度极低的生物分子，且无需使用任何标记。该方法有助于回答生物技术、生物化学和生物医学领域的关键问题，例如环境监测、食品安全、饮用水质量以及医学诊断。该技术的主要优势在于其固有的快速性、简便性、高灵敏度、低成本、易于操作，以及无需使用任何标记试剂即可实现实时检测。该技术由于能够定量检测低丰度生物分子，其应用前景可拓展至疾病诊断。例如，可实时检测不同的生物标志物。清洗玻璃盖玻片时，将盖玻片置于10毫升1.0摩尔HCl溶液中，在室温下超声处理10分钟。然后，在相同条件下将它们浸入去离子水和1.0摩尔的氢氧化钠溶液中。用氮气吹干玻璃盖玻片。随后，将洁净且干燥的盖玻片在室温下浸入10毫升APTES溶液中反应一小时，以在盖玻片表面引入氨基。用去离子水冲洗盖玻片，然后再次用氮气干燥。将经APTES修饰的盖玻片浸入10毫升戊二醛溶液中，在室温下孵育2小时，以活化表面的氨基。孵育结束后，用10毫摩尔磷酸缓冲液冲洗盖玻片，以去除表面残留的过量戊二醛。用氮气吹干盖玻片。接着，在10毫摩尔磷酸盐缓冲液中制备1.0毫升模板溶液，浓度为每毫升0.1毫克。取200微升该模板溶液滴加到修饰后的盖玻片上，于4摄氏度孵育过夜。清洗电极时，首先将电极浸入含有5 mL 70%乙醇的小烧杯中，在室温下使用超声波清洗器清洗10分钟。随后，在相同条件下依次将电极浸入去离子水、丙酮、去离子水、酸性piranha溶液和去离子水中。用氮气吹干电极。为了进行酪胺的电聚合，配制8毫升含有2毫升乙醇的10毫摩尔磷酸盐缓冲液中的10毫摩尔酪胺溶液。使用恒电位仪在此溶液中进行15次循环伏安扫描，电位范围为0至1.5伏，扫描速率为50毫伏每秒。然后，用去离子水冲洗电极，再用氮气干燥电极。将电极浸入含有30毫摩尔丙烯酰氯和30毫摩尔三甲胺的甲苯溶液中，在室温下过夜，然后再次冲洗并干燥电极。在聚合反应前，制备单体溶液，其中包含单体和交联剂，溶于820微升超纯水中。随后，用超纯水配制5%（体积比）的TEMED溶液。向单体溶液中加入 20 微升 TEMED 溶液，并用氮气吹扫五分钟。然后，向单体溶液中加入 20 微升 freshly prepared APS。用移液器将 1.5 微升单体溶液滴加到修饰后的金电极表面。现在，通过将模板印章与单体处理过的表面接触来启动聚合反应，并在室温下保持五小时。聚合完成后，使用镊子小心地从表面取下模板印章。接着，用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干。将电极浸入1毫升乙醇中配制的10毫摩尔十二烷硫醇溶液中20分钟，以覆盖电极表面的针孔。最后，用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干，随后通过扫描电子显微镜表征其表面。将印制的电容性金电极插入集成至电容式生物传感器的电化学流动池中。配制 100 毫升再生缓冲液和 1 升运行缓冲液。分析开始时，先注入再生缓冲液以再生系统，再用运行缓冲液重新平衡系统 25 分钟。用运行缓冲液配制所需浓度范围的标准模板溶液。然后，在最佳条件下依次将 250 微升这些标准溶液注入系统中。通过扫描电子显微镜对金电极的表面特性进行表征。图中显示了裸金表面。图中还展示了不同放大倍数下附着在电极表面的噬菌体。此处显示的是噬菌体通过传感图实时结合到印迹金电极上的过程。在样品注入前，系统经过再生和重新平衡后建立了稳定的基线。电极上具有噬菌体特异性的空腔。当注入诱导性噬菌体样品时，由于目标噬菌体与金电极表面印迹空腔的结合，导致电容降低。校准曲线显示了在噬菌体注入过程中电容变化与蛋白质注入的关系。根据这些图中的方程，可以计算出样品中噬菌体或蛋白质的浓度。观看本视频后，您应能充分理解如何构建一种超灵敏、快速且实时的检测系统。一旦掌握，该技术本身可在五小时三十分钟内完成，但不包括各步骤之间的等待时间。在进行该实验操作时，务必在同一天内新鲜配制所有试剂。按照本方法操作后，还可通过原子力显微镜、扫描电子显微镜、椭偏仪以及量子角测量等其他表征手段，判断聚合或压印是否成功，并检测裸金电极与分子印迹金电极表面之间是否存在显著差异。该技术发展之后，为生物化学、生物技术及生物医学领域的研究人员探索食品质量安全和医学诊断中生物分子的超灵敏检测提供了新的途径。请注意，操作功能单体、交联剂、引发剂及其他试剂可能具有极高危险性。进行此类实验时，必须采取防护措施，例如佩戴手套、穿着实验服，并在通风橱内进行聚合反应实验。

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科研

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Immunology and Infection

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本视频展示了一种利用电容型免疫探针生物传感器检测和定量肽类递质的方法。经过功能化修饰并涂覆有抗体的电极可与目标肽相互作用，引起信号变化，从而实现对肽的精确定量与检测。...

使用电容型免疫探针生物传感器进行靶肽的检测与测定

我们介绍一种基于微流控技术的电化学生物芯片，用于检测DNA杂交。在单链DNA探针功能化之后，通过互补和非互补的单链DNA靶标研究其特异性、灵敏度和检测限。结果表明DNA杂交事件对电化学系统的影响，检测限为3.8...

一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记DNA杂交分析

本方案展示了如何在30分钟内，利用集成于芯片实验室圆盘中的电纺纳米纤维膜，实现10...

全自动离心式微流控装置用于全血中超灵敏蛋白质检测

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。...

基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

本研究描述了一种纳米压印光刻技术，用于制备基于异常光学透射原理的高质量传感阵列。该生物传感器成本低、稳定性好、操作简便，可在临床相关浓度下检测血清中的心肌肌钙蛋白I（99th 百分位数截断值 ∼10–400...

利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

采用低成本干膜光刻胶技术设计并制备了一种微流控生物传感器平台，用于多种分析物的快速、高灵敏度定量检测。该一次性使用系统通过停流技术实现对芯片上固定的酶联检测方法进行电化学读出。...

基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的超灵敏、高通量技术，能够从极微量的生物样品中对蛋白质及其亚型进行详细表征。以下描述了一种自动化和机器人化检测与定量特定蛋白质及其亚型的实验方案。...

通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。该技术通过测量结合有靶标分子的石墨烯生物传感器中的电流变化来实现检测。利用FEB技术评估了Hsp90与Cdc37之间的生物分子相互作用，结果检测到这两种蛋白质之间存在强烈的相互作用。...

利用场效应生物传感技术探究分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

本文介绍了一种利用电容式生物传感器进行新型动态多参数血小板功能检测的实验方案。该方法在半刚性微环境中设计，以增强生理相关性，可提供三个对血小板计数、刺激强度和活化通路敏感的输出参数。...

利用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估

了解基于分子印迹的电容生物传感器技术，用于超灵敏检测复杂样本中的低丰度生物标志物。该方法无需标记即可实现实时定量，适用于环境监测、食品安全和医学诊断等领域。

基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

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