基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

该技术的总体目标是高灵敏、简便、低成本、快速地检测并定量高度复杂样品中丰度极低的生物分子，且无需使用任何标记。该方法有助于回答生物技术、生物化学和生物医学领域的关键问题，例如环境监测、食品安全、饮用水质量以及医学诊断。该技术的主要优势在于其固有的快速性、简便性、高灵敏度、低成本、易于操作，以及无需使用任何标记试剂即可实现实时检测。

该技术由于能够定量检测低丰度生物分子，其应用前景可拓展至疾病诊断。例如，可实时检测不同的生物标志物。清洗玻璃盖玻片时，将盖玻片置于10毫升1.0摩尔HCl溶液中，在室温下超声处理10分钟。

然后，在相同条件下将它们浸入去离子水和1.0摩尔的氢氧化钠溶液中。用氮气吹干玻璃盖玻片。随后，将洁净且干燥的盖玻片在室温下浸入10毫升APTES溶液中反应一小时，以在盖玻片表面引入氨基。

用去离子水冲洗盖玻片，然后再次用氮气干燥。将经APTES修饰的盖玻片浸入10毫升戊二醛溶液中，在室温下孵育2小时，以活化表面的氨基。孵育结束后，用10毫摩尔磷酸缓冲液冲洗盖玻片，以去除表面残留的过量戊二醛。

用氮气吹干盖玻片。接着，在10毫摩尔磷酸盐缓冲液中制备1.0毫升模板溶液，浓度为每毫升0.1毫克。取200微升该模板溶液滴加到修饰后的盖玻片上，于4摄氏度孵育过夜。

清洗电极时，首先将电极浸入含有5 mL 70%乙醇的小烧杯中，在室温下使用超声波清洗器清洗10分钟。随后，在相同条件下依次将电极浸入去离子水、丙酮、去离子水、酸性piranha溶液和去离子水中。用氮气吹干电极。

为了进行酪胺的电聚合，配制8毫升含有2毫升乙醇的10毫摩尔磷酸盐缓冲液中的10毫摩尔酪胺溶液。使用恒电位仪在此溶液中进行15次循环伏安扫描，电位范围为0至1.5伏，扫描速率为50毫伏每秒。然后，用去离子水冲洗电极，再用氮气干燥电极。

将电极浸入含有30毫摩尔丙烯酰氯和30毫摩尔三甲胺的甲苯溶液中，在室温下过夜，然后再次冲洗并干燥电极。在聚合反应前，制备单体溶液，其中包含单体和交联剂，溶于820微升超纯水中。随后，用超纯水配制5%（体积比）的TEMED溶液。

向单体溶液中加入 20 微升 TEMED 溶液，并用氮气吹扫五分钟。然后，向单体溶液中加入 20 微升 freshly prepared APS。用移液器将 1.5 微升单体溶液滴加到修饰后的金电极表面。

现在，通过将模板印章与单体处理过的表面接触来启动聚合反应，并在室温下保持五小时。聚合完成后，使用镊子小心地从表面取下模板印章。接着，用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干。

将电极浸入1毫升乙醇中配制的10毫摩尔十二烷硫醇溶液中20分钟，以覆盖电极表面的针孔。最后，用去离子水冲洗电极，并用氮气吹干，随后通过扫描电子显微镜表征其表面。将印制的电容性金电极插入集成至电容式生物传感器的电化学流动池中。

配制 100 毫升再生缓冲液和 1 升运行缓冲液。分析开始时，先注入再生缓冲液以再生系统，再用运行缓冲液重新平衡系统 25 分钟。用运行缓冲液配制所需浓度范围的标准模板溶液。

然后，在最佳条件下依次将 250 微升这些标准溶液注入系统中。通过扫描电子显微镜对金电极的表面特性进行表征。图中显示了裸金表面。

图中还展示了不同放大倍数下附着在电极表面的噬菌体。此处显示的是噬菌体通过传感图实时结合到印迹金电极上的过程。在样品注入前，系统经过再生和重新平衡后建立了稳定的基线。

电极上具有噬菌体特异性的空腔。当注入诱导性噬菌体样品时，由于目标噬菌体与金电极表面印迹空腔的结合，导致电容降低。校准曲线显示了在噬菌体注入过程中电容变化与蛋白质注入的关系。

根据这些图中的方程，可以计算出样品中噬菌体或蛋白质的浓度。观看本视频后，您应能充分理解如何构建一种超灵敏、快速且实时的检测系统。一旦掌握，该技术本身可在五小时三十分钟内完成，但不包括各步骤之间的等待时间。

在进行该实验操作时，务必在同一天内新鲜配制所有试剂。按照本方法操作后，还可通过原子力显微镜、扫描电子显微镜、椭偏仪以及量子角测量等其他表征手段，判断聚合或压印是否成功，并检测裸金电极与分子印迹金电极表面之间是否存在显著差异。该技术发展之后，为生物化学、生物技术及生物医学领域的研究人员探索食品质量安全和医学诊断中生物分子的超灵敏检测提供了新的途径。

请注意，操作功能单体、交联剂、引发剂及其他试剂可能具有极高危险性。进行此类实验时，必须采取防护措施，例如佩戴手套、穿着实验服，并在通风橱内进行聚合反应实验。