移植脂肪组织来源的干细胞片以减少大鼠模型部分结肠切除术后渗漏

由于人们认为ASC片层对组织修复具有促进作用，因此已在多种疾病模型中进行了测试，例如心肌梗死。本实验表明，ASC片层可应用于腹腔内，并可用于肠道。ASC片层的主要优势在于无需使用合成材料。

此外，ASC片移植操作相对简便，仅需少量练习即可掌握。这种新型的ASC片移植应用旨在预防肠切除术后发生渗漏，为开发新的治疗策略迈出了第一步。应用于肠吻合部位的ASC片已被证实具有良好的应用前景，可有效预防渗漏的发生。

ASC片状物也可应用于其他腹腔器官，例如泌尿道。首先使用10号无菌手术刀、Adson-Brown组织镊和Metzenbaum剪刀将人皮下腹部脂肪组织切割成0.5 cm大小的组织块。在无菌玻璃瓶中称量所分离组织的总重量。

每瓶加入 30 ml 分离培养基。将剪碎的脂肪组织在摇床培养箱中于 150 rpm、37 °C 条件下消化 1 小时。消化 1 小时后，将消化后的组织悬液分装至 50 ml 离心管中，在 390 ×g 条件下离心 10 分钟。离心后弃去上清液。

加入培养基重悬细胞沉淀，并添加更多培养基至总体积45 ml。将合并的细胞在390 G下离心5分钟，弃去上清液。用10 ml培养基重悬细胞沉淀。

将细胞悬液通过100微米滤网过滤。取50 µL 3%酸性亚甲蓝溶液加入50 µL细胞悬液中，以裂解红细胞。混匀溶液后，吸取10 µL滴加至血细胞计数板，进行细胞计数。

以每平方厘米40000个细胞的密度将细胞接种于含有培养基的T175培养瓶中。在37°C、含5%CO2的湿润环境中培养24小时。次日，用预热的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，以去除细胞碎片。

然后，更换为含10% FBS的培养基，并新鲜添加抗坏血酸-2-磷酸和人重组成纤维细胞生长因子2。继续培养至细胞融合度达到90%。当脂肪干细胞融合度达到90%时，使用标准的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行传代培养。

用10 ml培养基中和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，作用时间为3至5分钟。将细胞转移至离心管中，在250 ×g条件下离心8分钟。弃去上清液，用1 ml培养基重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞计数后，以每平方厘米8000个细胞的密度将细胞接种于T175培养瓶中。

将剩余的ASCs用含10%二甲基亚砜的培养基重悬后，于液氮中冻存，以备后续使用。使用1 ml胎牛血清预包被直径3.5 cm的温敏性培养皿，然后置于37°C培养箱中，至少孵育30分钟后再进行细胞接种。

为了促进ASC贴附于温敏培养皿，并降低培养过程中ASC片层过早脱落的风险，应在接种细胞前用胎牛血清预先包被温敏培养皿。按照之前的方法对ASC进行胰酶消化；若胰酶消化后存在细胞团块，需在计数前通过100微米滤网过滤细胞。将培养皿从培养箱中取出，转移至37摄氏度的预热板上。

从培养皿中移除FBS。将细胞沉淀用含10% FBS的低糖DMEM重悬并计数后，每培养皿用2 ml培养基稀释3.52 × 10⁶个ASC细胞，使每3.5 cm培养皿的接种密度为每平方厘米400000个细胞。通过轻轻摇晃培养皿，小心地将细胞尽可能均匀地分布。

然后，在37摄氏度、含5% CO2的湿润环境中培养ASC片层48小时。移植当天，在体内移植前40分钟将培养皿冷却至室温，以促进ASC片层的分离。冷却后，移除培养基，并加入1 ml无血清的LG DMEM。

移植细胞片时，用无创镊子轻轻夹住脂肪干细胞（ASC）片的边缘，将ASC片的培养皿侧放置于吻合线之上。轻柔操作细胞片并准确放置，对于确保完整细胞片成功移植至关重要。小心地将ASC片向上和向下延展至吻合线周围约0.25 cm处。

将细胞片包裹在结肠周围，提起结肠，使ASC细胞片包绕结肠背侧。未接受ASC细胞片移植的对照组动物在术后第3天于吻合口附近出现粪便渗漏，如白色箭头所示。而接受ASC细胞片移植的动物（黑色箭头所示）在术后第3天粪便渗漏及脓肿形成均减少。

术后七天观察到了相同的结果。该图像显示了移植动物结直肠吻合部位的代表性H&E染色横截面。在术后最多七天内，仍可在吻合部位识别出片层结构。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数分钟内完成。

ASC片材会自发黏附于结肠的无细胞表面，无需使用胶水或缝线来固定ASC片材。观看本视频后，您应充分了解如何在大鼠结直肠吻合部位制备并移植ASC片材，以预防部分结肠切除术后发生渗漏。