Name: 腹膜源性肥大细胞的分离及其功能特征的 Ca2 +成像和脱粒测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习小鼠腹膜肥大细胞分离培养及功能鉴定方法，包括Fura-2钙离子成像和β-氨基己糖苷酶释放测定。该技术可同步分析大量细胞，为研究免疫细胞激活机制提供可靠工具。

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作者谨此感谢Julia Geminn在肥大细胞制备与培养方面的技术支持。本工作由跨区域合作研究中心（TR-SFB）152资助。

所有动物实验均按照德国关于实验动物护理和使用的法律法规进行（已由卡尔斯鲁厄地区委员会正式批准）。
1. 腹腔灌洗法分离与培养PMC
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>冰</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>10 mL 注射器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>27 G 针头</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>20 G 针头</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>泡沫塑料块和固定针</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>收集管（50 mL 塑料离心管）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>70% 乙醇</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>RPMI 培养基（预冷并置于冰上）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>PMC 培养基：RPMI 培养基 + 20% FCS（胎牛血清）+ 1% 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>杜氏磷酸盐缓冲液 - DPBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>培养瓶（25 cm）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>生长因子储备液（IL-3：1 μg/μL；SCF：2.5 μg/mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>血清移液管（10 mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>无菌移液器吸头（20–200 µL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>血细胞计数板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>台式离心机</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td>剪刀和镊子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>小鼠用 CO2 麻醉室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td>开放式无菌操作台</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>封闭式无菌操作台</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td>细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>移液器（20–200 µL）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：步骤1所需材料。
<ol>
	<li>通过腹腔灌洗分离PMC细胞
	<ol>
		<li>在细胞分离前，准备好表1中列出的材料。</li>
		<li>使用8至14周龄的雄性小鼠进行PMC细胞分离。通过吸入CO2处死小鼠，并通过反射消失确认死亡。用70%乙醇喷洒小鼠体表，然后用针将小鼠固定在泡沫板上（背侧朝下）。使用钝头剪刀去除小鼠腹部皮肤，注意避免损伤腹膜腔。 
		注意：本实验通常使用遗传背景为C57BL/6N品系的小鼠。</li>
		<li>使用配备27 G针头的10 mL注射器，向腹膜腔内注入7 mL冰冻RPMI培养基和5 mL空气。将针头小心插入腹膜，避免刺穿任何器官。建议选择附睾脂肪区域作为穿刺位点，以降低器官穿孔的风险。</li>
		<li>注射后，轻轻摇晃小鼠约1分钟，使腹膜细胞脱落进入RPMI培养基中。摇晃力度不宜过大，以免损伤内脏器官并导致血液污染腹腔液。</li>
		<li>更换为新的20 G套管，重新使用该10 mL注射器。通过倾斜泡沫板并轻敲实验台面，将内脏器官移向一侧，以便从另一侧更方便地吸取液体。插入20 G针头（斜面朝上），缓慢轻柔地抽吸腹腔液体（约0.5 mL/s），避免因内脏堵塞导致吸液不畅。尽可能多地收集液体（通常为5–6 mL）。</li>
		<li>从注射器上取下针头，将收集的细胞悬液转移至预冷的收集管中，并置于冰上。若发现明显血液污染，则弃去该样本管。</li>
		<li>将含有细胞悬液的管子以约300 x g离心5分钟。在无菌操作台中吸除上清液。对每只小鼠的样本沉淀物，加入4 mL冷（4–10 °C）PMC培养基重悬，然后将细胞悬液转移至25 cm2培养瓶中。加入生长因子IL-3和SCF，使其终浓度分别为10 ng/mL和30 ng/mL。将含有细胞的培养瓶放入培养箱（37 °C，5% CO2）中培养约48小时，直至进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PMC细胞培养
	<ol>
		<li>第2天（分离后约48小时）：更换培养基
		<ol>
			<li>为去除上清液及非贴壁细胞（如红细胞和死细胞），将Pasteur移液管尖端置于培养瓶边缘，将培养瓶几乎水平持握，小心吸除培养基。每只小鼠对应加入4 mL预温的PMC培养基。添加生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL）。将含有细胞的培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第9天：细胞传代
		<ol>
			<li>将细胞悬液从培养瓶转移至50 mL塑料离心管中。用10 mL预温（37 °C）的Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗培养瓶三次，并将洗脱液连同脱落的细胞一并收集至同一50 mL塑料离心管中。使用血细胞计数板测定细胞浓度，并计算细胞总数。</li>
			<li>将细胞悬液以约300 x g离心5分钟，吸除上清液。用预温的PMC培养基（37 °C）重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1 × 106 cells/mL。将细胞悬液转移至新的25 cm2培养瓶中。弃去原有培养瓶（底部附着有成纤维细胞）。</li>
			<li>加入生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL），并将含有细胞的培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第12–15天：细胞检测
		<ol>
			<li>若计划进行FcɛRI受体刺激相关实验，需在标准培养基中加入300 ng/mL抗DNP IgE，对细胞进行过夜预处理。随后进行步骤2或步骤3。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PMCs 中细胞内游离钙浓度的荧光测定
<ol>
	<li>在测量之前，准备好 表2 中列出的材料。同时，准备一个成像装置，包括：倒置荧光显微镜；物镜：40X/1.3 油镜；Fura 2 滤光片组；CCD 相机；激发光源；图像采集程序；重力驱动溶液施加系统。</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>PMC（12–15 天龄）1 × 106 个细胞/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Fura-2 AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Pluronic F-127 20% 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>圆形盖玻片；直径 25 mm；1 号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>DNP-HSA（二硝基苯-人血清白蛋白）储备液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>抗 DNP 抗体（IgE）储备液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>平底培养板（12 孔）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Compound 48/80 储备液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Cover Well 成像室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>血细胞计数板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>移液器吸头（20–200 µL）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：第二步所需材料。
<ol start="2">
	<li>Fura-2成像制备
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞浓度调整至 1 x 106 细胞/mL。用1 mL移液枪头轻柔吹打细胞悬液3–5次，以分离原代微囊细胞（PMCs）克隆。</li>
		<li>制备 Ca2+含 HEPES 缓冲盐溶液（Ca2+-HBSS，其成分为 135 mM NaCl、6 mM KCl、2 mM CaCl₂2，1.2 mM MgCl2，10 mM HEPES 和 12 mM 葡萄糖。用 3 M NaOH 将 pH 调至 7.4。</li>
		<li>通过移液将1滴刀豆蛋白A溶液（0.1 mg/mL，溶于H₂O）滴加至载玻片上，制备刀豆蛋白A包被的载玻片。2O)置于无菌操作台中的每个25 mm圆形盖玻片上。将液滴在盖玻片上静置至少1分钟，然后用移液器吸除大部分溶液，并让盖玻片在空气中干燥45分钟。小心地将经刀豆蛋白A处理的盖玻片压在橡胶成像小室上（参见 材料表）直至其贴壁，以获得用于显微成像的培养腔。 
		注意：可使用聚-L-赖氨酸包被的载玻片作为替代。</li>
		<li>溶解荧光 Ca2+ 染料Fura-2 AM（1 mM）溶于二甲基亚砜（DMSO）中。将此溶液避光保存。</li>
		<li>将Fura-2 AM储备液用Ca2+-HBSS 至终浓度为 5 µM 为了配制“上样缓冲液”，需补充 5 µL/mL 20% Pluronic F-127 的 DMSO 溶液</li>
		<li>混合 500 µL “上样缓冲液”的 500 µL 将PMC细胞悬液移入成像室，用移液器轻轻混匀，于室温避光孵育20–30分钟。</li>
		<li>根据刺激方案，使用不同溶液设置重力驱动给药系统。在1号注射器中加入40 mL Ca2+-HBSS 溶液，注射器 2，含 40 mL Ca2+含 100 ng/mL DNP 的 HBSS 溶液，3 号注射器含 40 mL Ca2+含 HBSS 溶液 50 µg/mL 化合物 48/80，4 号注射器含 40 mL 名义上含 Ca2+无钙 HBSS 溶液，以及含有 40 mL 名义上无钙的 HBSS 溶液的注射器 52+无钙镁-HBSS 溶液含 2 µM 毒胡萝卜素</li>
		<li>使用40倍高数值孔径油浸物镜时，先在物镜前端滴加一滴浸油。</li>
		<li>将给药系统安装在倒置显微镜的载物台上。将已接种细胞的成像腔室放入给药系统中，并固定以防止记录过程中发生移动。打开透射光，对细胞进行聚焦。</li>
		<li>用 Ca 洗涤细胞三次2+-HBSS 缓冲液，使用重力驱动加样系统。</li>
		<li>将细胞在 Ca2+-HBSS 中孵育 5 分钟，以完成 Fura-2 AM 的去酯化。</li>
		<li>再次冲洗细胞，以去除任何可能泄漏的荧光染料，然后再开始成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞成像
	<ol>
		<li>启动生理采集模式下的成像采集程序。打开设置窗口，调节焦距和最佳采集时间（340 nm 和 380 nm 激发时应保持一致，通常为 50–150 ms）。 
		注意：应尽量减少Fura-2负载细胞暴露于光线，以避免染料发生光漂白。</li>
		<li>拍摄参考图片，并将细胞标记为感兴趣区域（ROI）。在无细胞区域标记最后一个ROI，并将其定义为背景。</li>
		<li>完成设置后，以5秒的采样速率开始测量。 
		注意：细胞将依次用340 nm和380 nm的激发光照射，并采集发射荧光（&gt;使用CCD相机采集510 nm的荧光信号。F340 nm和F380 nm的荧光信号图像以及比值（F340 nm/F380 nm）将在三个窗口中实时显示。同时，各感兴趣区域（ROI）荧光强度平均值的时间进程曲线也将持续显示。</li>
		<li>根据实验设计，在适当的循环数加入溶液：
		<ol>
			<li>测量抗原诱导的[Ca2+]i，如图所示 图2A，2B在第20个循环后加入注射器2中的溶液，第150个循环后停止记录。</li>
			<li>测量由 Compound 48/80 诱导的 [Ca2+]i,，如图所示 图2C在第20个循环后加入注射器3中的溶液，第150个循环后停止记录。</li>
			<li>为了测量[Ca2+]i 由SOCE诱导，如图所示 图2D在第10个循环后加入注射器4的溶液，第70个循环后加入注射器5的溶液，第120个循环后加入注射器4的溶液，第150个循环后加入注射器1的溶液，第220个循环后停止记录。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量结束后，将结果转换为比率表，其中包含每个感兴趣区域（ROI）和每个测量时间点在两种激发波长下经与未经背景校正的实测强度值，以及相应的经与未经背景校正的比率值。在采集程序中依次点击按钮：“start cutter”、“mark all”、“convert all”、“physiology measurements”、“Ok”、“Ok”。将文件保存为表格和图像序列，用于离线分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肥大细胞中β-己糖胺酶释放量的测定
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>PMC（12–15 天龄）1 × 106 个细胞/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>抗-DNP-抗体（IgE）储存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>DNP-HSA 储存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>化合物 48/80 储存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>离子霉素（Ionomycin）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>96 孔板，V 型底</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>96 孔板，平底</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>塑料离心管（15 mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>血清移液管</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>细胞培养箱（37 °C，5% CO2）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>台式离心机</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>用于光密度测定的酶标仪</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>多通道移液器（20–200 μL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>血细胞计数板</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：步骤3所需材料。
<ol>
	<li>在测量之前，准备好 表3 中列出的材料。 
	注意：肥大细胞（MCs）受到刺激后释放的 β-己糖胺酶可将对硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（pNAG）水解为对硝基苯酚和 N-乙酰-D-葡萄糖胺。样品中 β-己糖胺酶的量与生成的对硝基苯酚的量成正比。在“终止液”的高 pH 环境中，对硝基苯酚以完全去质子化的对硝基苯酚根形式存在，可通过其在 405 nm 处的光吸收进行检测。</li>
	<li>配制 Tyrode's 溶液：含 130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、5.6 mM 葡萄糖和 0.1% BSA。用 3 M NaOH 将 pH 调至 7.4。</li>
	<li>通过向 Tyrode's 溶液中加入 1% 体积的 Triton X-100 来制备裂解液。</li>
	<li>配制由 200 mM 甘氨酸组成的终止液，并用 NaOH 将 pH 调至 10.7。</li>
	<li>将 pNAG 溶解于 0.4 M 柠檬酸中，配制成终浓度为 4 mM 的 pNAG 溶液（4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷）。</li>
	<li>计算实验所需的细胞数量（实验需设复孔）。每孔使用 200,000 个 PMC。每种基因型设置 2 孔阴性对照（不含任何分泌刺激剂如 DNP 或化合物 48/80 的 Tyrode's 溶液）和 2 孔阳性对照（含 10 µM 离子霉素的 Tyrode's 溶液）。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 塑料离心管中，用 Tyrode's 溶液调整体积至 15 mL，在 200 × g 条件下离心 4 分钟。用巴斯德吸管移除上清液，并将细胞重悬于 Tyrode's 溶液中，使细胞浓度为 2 × 106 个/mL。</li>
	<li>将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔 V 型底板的每孔中。向各孔加入 25 µL 刺激液或对照液（根据 图3A 所示加样方案）。将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 分钟。</li>
	<li>将 96 孔板置于冰上 5 分钟以终止反应。然后在 4 °C、120 × g 条件下离心 4 分钟。使用多通道移液器将 120 µL 上清液转移至平底 96 孔板中，并置于冰上。操作时小心避免触碰细胞沉淀，但需完全吸走上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 125 µL 裂解缓冲液。室温孵育 5 分钟，孵育结束后通过反复吹打（约 5 次）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在新的平底 96 孔板的相应孔中加入 25 µL pNAG 溶液（4 mM）。向已准备好的 pNAG 溶液中分别加入 25 µL 各上清液以及 25 µL 各细胞裂解液。</li>
	<li>将反应体系在 37 °C 孵育 1 小时。孵育结束后，向每孔加入 150 µL 终止液以终止反应。</li>
	<li>使用酶标仪在 405 nm 波长下进行检测，参考波长设为 630 nm，以实现自动背景扣除。在采集程序中勾选“参考”选项，并在“吸光度”程序元素菜单中从下拉列表选择“630 nm”。若样品的光密度值过高，应在重新测量前对样品进行适当稀释。</li>
	<li>根据以下公式计算 β-己糖胺酶释放百分比： 
	<img alt="释放计算公式；蛋白质纯化方法，比值；实验结果计算公式。" src="/files/ftp_upload/57222/57222eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	其中，Release [%] 表示特异性 β-己糖胺酶释放百分比，A[上清液] 表示经背景校正后的上清液吸光度，A[裂解液] 表示对应细胞裂解液经背景校正后的吸光度。</li>
</ol>

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<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肥大细胞（MC）模型可成功用于研究肥大细胞脱颗粒、趋化性、黏附性，以及阐明参与肥大细胞活化的细胞内信号转导通路。一些研究人员使用人源肥大细胞模型，例如永生化细胞系（LAD2 和 HMC1）或来源于脐带血前体细胞（CD133+）及外周血前体细胞（CD34+）的人肥大细胞。另一些研究人员则偏好啮齿类动物肥大细胞模型，例如永生化细胞系（大鼠嗜碱性白血病 RBL-2H3 肥大细胞系）或原代培养模型（小鼠骨髓来源肥大细胞 BMMCs、腹腔来源肥大细胞 PMCs）。小鼠原代肥大细胞可用于分析多种&#34;基因敲除&#34;小鼠模型中的肥大细胞功能，这是探索特定基因及其编码蛋白生理功能的金标准方法。由于缺乏具有足够选择性和效力的药理学工具，该方法在研究肥大细胞活化过程中信号转导机制方面尤为有价值18。小鼠 PMCs 具有结缔组织表型，表现出成熟形态和高度颗粒化。它们不仅像 BMMCs 一样对 FcεRI 的抗原交联反应良好，还可被内皮素 1 或化合物 48 等多种其他受体激动剂激活。然而，PMCs 的产量通常显著低于 BMMCs，通常不足以进行 Western 印迹或其他需要大量细胞的技术操作。已有多种...

肥大细胞（MCs）在先天性和获得性免疫反应中发挥重要作用。具体而言，肥大细胞参与杀灭病原体（如细菌和寄生虫），并可降解潜在的有毒内源性肽或毒液成分（综述见Galli et al. 20081）。肥大细胞在先天免疫和适应性免疫中的生理功能目前仍存在激烈争论。因此，针对不同肥大细胞缺陷型小鼠模型的研究中出现的大量数据差异，迫切需要对肥大细胞在过敏反应之外的免疫学功能进行系统性重新评估2。成熟的肥大细胞主要定位于皮肤、肺和肠道等组织和器官中，通常在血液中仅少量存在。肥大细胞起源于造血前体细胞（如肥大细胞祖细胞），并在几乎所有血管化组织的微环境中完成其分化和成熟过程1。T细胞来源的因子白细胞介素（IL）-3可选择性促进小鼠多能性肥大细胞群体从其造血祖细胞存活、增殖和分化3。干细胞因子（SCF）由组织中的结构细胞产生，在肥大细胞的发育、存活、迁移和功能中起关键作用4。单个肥大细胞的特性可能因其合成和储存不同蛋白酶或蛋白聚糖的能力而有所差异。在小鼠中，根据解剖定位、形态以及肝素和蛋白酶含量的不同，可将所谓的结缔组织型肥大细胞与黏膜型肥大细胞区分开来5。
在肥大细胞中，游离胞质Ca²⁺浓度升高2+ ([Ca2+]i对于抗原及多种分泌刺激物诱导的脱颗粒、二十烷酸类物质的产生，以及细胞因子的合成和转录因子的活化而言，是不可或缺的6这些刺激的一个主要下游靶点是磷脂酶C，它将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解为二酰甘油（DAG）和肌醇1,4,5-三磷酸。DAG激活蛋白激酶C，而IP3释放Ca²⁺离子2+ 从内质网中。这些库的耗竭会激活Ca2+ 通过质膜的钙离子内流2+ 通道，从而引发钙库操纵性钙内流（SOCE）。该过程通过Ca2+-传感器、内质网中的基质相互作用分子-1（Stim1）与Orai17 以及通过瞬时受体电位经典型（TRPC）通道蛋白的激活（综述见 Freichel） 等 20148质膜中的）
为了研究这些通道的生理功能，通常采用多种药理学方法（如通道阻断剂的应用）或遗传学方法。在后者中，通过靶向 mRNA（敲低）或对基因组 DNA 进行全局性或组织特异性编辑，实现对蛋白质表达的抑制。9 删除编码通道孔形成亚基的外显子（基因敲除）。目前可用于这些通道且具有足够特异性的阻断剂十分有限。此外，敲低方法需要通过有效性的严格对照来验证其效果， 例如，蛋白质印迹分析，并且在许多情况下受到针对目标通道蛋白的特异性抗体无法获得的限制。因此，基因敲除小鼠模型的使用仍被视为此类分析的金标准。一种优选的 体外 用于研究MC功能的模型是培养可分离的PMCs 离体 完全成熟的细胞群体（相对于正在分化的MCs） 体外 从， 例如（如骨髓细胞）10与常用于研究肥大细胞（MC）功能的骨髓来源肥大细胞（BMMCs）相比 体外，FcεRI 的刺激以及 β-己糖胺酶的释放分别在肥大细胞中增加了 8 倍和 100 倍。本文中，我们描述了一种小鼠肥大细胞的分离与培养方法，该方法能够获得&#160;培养2周后，可获得大量纯化的结缔组织型肥大细胞（MCs），足以用于后续分析。
尽管基因编码的钙指示剂在开发和应用方面已取得最新进展，但其使用仍受限于将基因递送至靶细胞的困难，尤其是在原代培养的肥大细胞（MCs）等高度特化的细胞中。此外，用于细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）检测的这类荧光指示剂仍缺乏具有高动态范围的比率型染料。因此，目前进行比率型[Ca2+]i检测的首选方法仍然是使用荧光染料 &#34;Fura-2&#34;11。
目前，评估肥大细胞（MC）活化和脱颗粒最常用的方法是检测β-己糖胺酶活性。β-己糖胺酶是一种过敏介质，是肥大细胞颗粒成分之一，与组胺以恒定比例从肥大细胞中共释放12。通过该酶与特异性底物的反应，可简便而准确地测定β-己糖胺酶活性，该反应生成可定量的显色产物，可在微孔板比色法中轻松检测。本文报道了该技术在分析原代肥大细胞（PMC）对多种刺激物产生脱颗粒反应中的应用。
高亲和力质膜IgE受体（FcɛRI）的聚集可激活肥大细胞（MCs）中一条多功能的细胞内信号通路，导致分泌颗粒内容物释放到周围的细胞外空间。除特异性抗原外，许多其他刺激物也可激活肥大细胞，释放多种免疫调节介质，例如补体过敏毒素（例如，C3a和C5a）13、血管收缩肽内皮素1（ET1）14，以及多种阳离子物质和可引发假性过敏反应的药物（例如，艾替班特）15，这些物质通过与MRGPRX2结合而发挥作用16。相较于FcɛRI介导的细胞内信号通路，MRGPR诱导肥大细胞脱颗粒所涉及的细胞内信号通路尚不明确；直到最近几年，在该受体被鉴定之后16，相关通路才开始受到深入研究17。目前，MRGPRX2激活后介导钙离子内流的质膜离子通道仍不清楚。因此，本文还重点探讨由MRGPR激动剂刺激所引发的肥大细胞内钙信号转导及其脱颗粒过程。

<table><tbody><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNP 抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Penstrep）</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>化合物 48/80&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-&amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>CoverWell 成像腔室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，V 型底&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，平底</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>配备 &quot;i-control&quot; 软件&amp;nbsp;的酶标仪</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>平底板&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 塑料离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶（25 cm²）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片；&amp;oslash; 25 mm；No. 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Fluar 40x/1.3 油镜物镜</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC Fura 2 滤光片组&amp;nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>单色光源系统</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>成像采集程序</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>重力供液式溶液施加系统</td><td>定制</td><td>4 通道</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 塑料离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

腹膜来源肥大细胞的分离及其通过ca2+-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

肥大细胞（MCs）作为免疫系统的一部分，在抵御多种病原体以及启动过敏免疫反应中发挥关键作用。通过高亲和力IgE受体（FcεRI）与表面结合的IgE发生交联，以及其他多个受体的刺激，可激活肥大细胞，引发细胞内游离Ca2+水平（[Ca2+]i）升高，从而促进炎症和过敏介质的释放。鉴定参与这些信号通路的分子组分，对于理解肥大细胞功能的调控机制至关重要。本文描述了一种通过腹腔灌洗分离小鼠结缔组织型肥大细胞并培养腹腔肥大细胞（PMCs）的实验方案。利用该方法培养来自不同基因敲除小鼠模型的肥大细胞，是鉴定参与肥大细胞信号通路蛋白的有效途径。此外，我们还介绍了一种单细胞Fura-2成像技术的实验方案，该技术是定量检测肥大细胞中Ca2+信号的重要方法。基于荧光的[Ca2+]i监测是一种可靠且常用的技术，可用于研究包括钙库操纵性钙内流在内的Ca2+信号事件，后者对肥大细胞的活化尤为重要。在肥大细胞脱颗粒分析方面，我们描述了一种β-己糖苷酶释放检测法。释放到培养基中的β-己糖苷酶含量被视为肥大细胞中三种不同分泌亚群的脱颗粒标志物。通过微孔板比色法，利用显色底物与β-己糖苷酶发生反应，可方便地定量检测其含量。该技术高度可重复、成本低廉，且无需特殊设备。总体而言，本方案可获得高产量的肥大细胞，这些细胞表达典型的肥大细胞表面标志物，具有典型的形态学和表型特征，并在Ca2+成像和脱颗粒实验中对分泌刺激剂表现出高度可重复的反应。

通过腹腔灌洗法从3只野生型小鼠（C57BL/6N）中分离出肥大细胞（PMCs），并在补充有20% FCS和1%青霉素-链霉素、并添加生长因子（含10 ng/mL IL-3和30 ng/mL SCF）的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO2的无菌湿润条件下继续培养。在细胞分离后的第2天和第9天更换培养基。采用透射光DIC成像技术分析细胞形态（见图1A, B）。细胞对比度和颗粒性显示细胞活力良好。在此条件下培养2周后，获得数量为1.5 × 107的均一细胞群体。对细胞进行FITC标记的抗IgE抗体和PE标记的抗c-Kit抗体共染色后，流式细胞术分析显示，98.6%的细胞为FITC阳性，99.8%的细胞为PE阳性（图1C）。98.5%的培养细胞同时表达FITC和PE（图1<strong...

本文介绍了一种分离和培养小鼠腹腔肥大细胞的实验方案。同时，我们还描述了两种用于其功能表征的方法：一种是通过荧光成像检测细胞内游离Ca2+浓度的变化，另一种是基于比色法定量释放的β-己糖胺酶来评估脱颗粒反应的实验方法。

腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca2+-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

肥大细胞（MCs）作为免疫系统的一部分，在抵御多种病原体以及启动过敏反应中发挥关键作用……

这些方法有助于回答可兴奋细胞内信号传导领域中的关键问题，例如哪些离子通道对免疫细胞的活化及介质释放至关重要。这些技术的主要优势在于其相对简便性以及能够同时分析大量细胞。接下来将由本实验室的研究生 Kathrin Ohlenschlager 演示在肥大细胞中进行 Fura-2 钙离子成像的实验。开始此操作时，用70%乙醇喷洒已处死的小鼠，并用针将其固定在泡沫板上，腹面朝下。使用钝头剪刀去除小鼠腹部的皮肤，注意避免损伤腹膜腔。接着，将27号针头小心插入腹膜，向腹膜腔内注射7毫升冰冻的RPMI培养基。切勿刺穿任何器官，应选择附睾脂肪区域的部位进行注射，以降低器官穿孔的风险。注射后，轻轻摇晃小鼠一分钟，使腹膜细胞脱落至RMPI培养基中。摇晃时力度不宜过大，以免损伤内脏器官，并防止血液污染腹腔。然后，更换新的20号针头，重复使用该注射器。通过倾斜泡沫块并轻轻在实验台上敲击，将内脏器官移至一侧，以便从另一侧更方便地吸取培养基。随后，将20号针头斜面向上插入，从腹部缓慢轻柔地吸取液体，避免因接触内脏器官而造成堵塞。尽可能收集多的液体。然后，将针头从注射器上取下，将收集到的细胞悬液转移至预冷的收集管中，置于冰上。若样本管中可见血液污染，则弃用该样本管。将含有纯净细胞悬液的离心管在300 g条件下离心5分钟。在无菌操作台内，吸除上清液。用冷的PMC培养基重悬样品沉淀，并将细胞悬液转移至25平方厘米的细胞培养瓶中。随后，将生长因子 IL-3 和 SCF 分别加入至终浓度为 10 纳克/毫升和 30 纳克/毫升。将细胞在 37 摄氏度下孵育约 48 小时，直至进行下一步操作。在第 12 至 15 天，若计划进行质膜 IgE 受体刺激实验，则需在标准培养基中用 300 纳克/毫升的抗-DNP IgE 抗体对细胞进行过夜预处理。为了准备Fura-2成像，将Fura-2 AM储存液用钙离子HBSS稀释至终浓度为5 µM，以制备负载缓冲液。然后，将500 µL负载缓冲液与500 µL PMC细胞悬液混合。将混合液移入成像室，并在室温避光条件下孵育20至30分钟。根据刺激方案，使用不同的溶液设置重力驱动的给药系统。然后，将给药系统安装在倒置显微镜的载物台上。通过在高数值孔径的40倍油镜上放置一小滴浸油，完成物镜的准备工作。将载有细胞的成像室放入应用系统中，并固定以防止记录过程中发生移动。然后，打开透射光并聚焦于细胞。随后，在生理学采集模式下启动成像采集程序。打开设置窗口，调节焦距和最佳采集时间。拍摄参考图像，并将细胞标记为感兴趣区域（ROI）。在无细胞区域标记最后一个ROI，并将其定义为背景。然后，完成设置并以每5秒一次的采集速率开始测量。接下来，根据实验设计在相应的循环次数时加入溶液。为检测抗原诱导的细胞内钙离子浓度升高，在第20个循环后加入2号注射器中的溶液，并在第150个循环后停止记录。为了检测化合物48/80诱导的细胞内钙离子浓度升高，在第20个循环后加入注射器三中的溶液，并在第150个循环后停止记录。为了检测由SOCE引发的细胞内钙离子浓度升高，在第10个循环后加入注射器四中的溶液，在第70个循环后加入注射器五中的溶液，在第120个循环后再次加入注射器四中的溶液，在第150个循环后加入注射器一中的溶液，并在第220个循环后停止记录。在数据采集程序中，依次点击按钮：Start Cutter、Mark All、Convert All、Physiology Measurements、OK，然后再次点击OK。将文件保存为表格和图像堆栈，以便进行离线分析。为检测β-己糖胺酶的释放，每孔加入100 µL细胞悬液至96孔V型底板中。向每孔加入25 µL刺激液或对照溶液。然后，在37摄氏度下孵育细胞45分钟。之后，将96孔板置于冰上5分钟以终止反应。接着，在4摄氏度下以120 ×g离心4分钟。将120微升上清液转移至平底96孔板中，并置于冰上。操作时需小心避免触碰细胞沉淀，但要彻底吸走上清液。接着，向细胞沉淀中加入125微升裂解缓冲液。将细胞沉淀在室温下孵育五分钟，孵育结束后通过反复吹打重悬细胞。在新的平底96孔板的相应孔中加入25微升4毫摩尔的pNAG溶液。分别取25微升各上清液和25微升各细胞裂解液，加入已准备好的pNAG溶液中。将反应体系在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，用移液器向每孔加入150微升终止液以终止反应。随后，使用酶标仪在405纳米波长下检测各孔样品的吸光度，参考波长设为630纳米，以实现自动背景校正。在采集程序中，勾选参考（Reference）选项，并在吸光度程序元素菜单中选择 630 纳米以进行自动背景扣除。通过β-己糖胺酶释放实验检测分离得到的肥大细胞在质膜IgE高亲和力受体交联或MrgPRB2受体刺激后发生脱颗粒的能力。将细胞加入V型底96孔板中，按照此方案在37摄氏度下刺激45分钟。离心并去除上清液后，裂解沉淀物。随后通过各个上清液及沉淀裂解液在37摄氏度下与pNAG孵育1小时的反应，分析其中β-己糖胺酶的含量。反应产物的量通过比色法检测，并计算释放的β-己糖胺酶百分比。自发释放水平非常低，而对强效脱颗粒刺激物的反应，如10微摩尔离子霉素和50微克/毫升的化合物48/80，分别超过40%和60%。对DNP刺激的脱颗粒反应在10至300毫克/毫升的浓度范围内呈剂量依赖性。综上，这些数据明确表明分离得到的PMC具有良好的功能状态。利用该技术，您可在两周内获得高纯度的小鼠成熟结缔组织肥大细胞，这些细胞来源于腹膜。在进行该操作时，重要的是要注意在细胞分离和培养过程中保持无菌条件，以避免细菌污染。在完成该操作后，还可采用其他方法，如电生理膜片钳离子电流检测，以进一步探究肥大细胞中钙离子内流途径的相关问题。在Fura-2细胞内钙成像技术发展之后，该技术为从事群体细胞生理学研究的科研人员探索肥大细胞脱颗粒的钙依赖性提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用肥大细胞开展Fura-2钙成像实验以及β-己糖胺酶脱颗粒检测。请注意，紫外辐射可能对眼睛和皮肤造成危害，在进行本实验操作时应避免不必要的暴露。

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