腹膜源性肥大细胞的分离及其功能特征的 Ca^{2 +}成像和脱粒测定

这些方法可以帮助回答可兴奋细胞细胞内信号传导领域的关键问题，例如哪些离子通道对免疫细胞活化和介质释放至关重要。这些技术的主要优点是它们相对简单并且可以同时分析大量细胞。在肥大细胞中演示 Fura-2 钙成像的是我实验室的研究生 Kathrin Ohlenschlager。

要开始此过程，请用 70% 乙醇喷洒安乐死的小鼠，并使用针将其固定在泡沫块上，其背面朝下。使用钝刃剪刀去除小鼠腹部的皮肤，避免损坏腹膜腔。接下来，将 27 号针头小心地插入腹膜，在腹膜腔中注射 7 毫升冰冷的 RPMI 培养基。

不要穿孔任何器官，并在附睾脂肪区域使用一个点以降低器官穿孔的风险。注射后，摇动鼠标 1 分钟，将腹膜细胞分离到 RMPI 培养基中。不要用力摇晃鼠标，以免损伤内脏和血液污染腹膜腔。

然后，通过为注射器配备新的 20 号套管来重复使用注射器。倾斜泡沫块并在工作台上轻轻敲击，将内部器官移至一侧，以便更轻松地从另一侧吸取培养基。随后，插入一个 20 号针头斜面，轻柔缓慢地从腹部吸出液体，以避免被内部器官堵塞。

收集尽可能多的液体。然后，从注射器中取出针头，并将收集的细胞悬液转移到冰上的收集管中。如果有明显的血液污染，请丢弃样品管。

将装有干净细胞悬液的试管以 300 g 离心 5 分钟。在无菌罩下，吸出上清液。将样品沉淀重悬于冷 PMC 培养基中，并将细胞悬液转移到 25 平方厘米的细胞培养瓶中。

随后，将生长因子 IL-3 和 SCF 添加至终浓度分别为 10 纳克/毫升和 30 纳克/毫升。将细胞在 37 摄氏度下孵育约 48 小时，直到下一个程序。在第 12 天到第 15 天，如果计划进行任何刺激质糖体 IgE 受体的实验，则在标准培养基中用每毫升 300 纳克的 IgE 抗 DNP 预处理细胞过夜。

为了制备 Fura-2 成像，将 Hura-2、AM 钙 HBSS 中的储备溶液稀释至终浓度为 5 微摩尔，以制备上样缓冲液。然后，将 500 微升上样缓冲液与 500 微升 PMC 细胞悬液混合。将混合物移液到成像室中，在室温下避光孵育细胞 20 至 30 分钟。

根据刺激方案使用不同的解决方案设置重力进料应用系统。接下来，将应用系统安装在倒置显微镜的载物台上。将一小滴浸油放在 40X 高孔径油浸物镜上，准备该物镜。

将装有加载单元的成像室放入应用系统中并固定，以防止在记录过程中移动。然后，打开透射光并聚焦在细胞上。随后，在 Physiotic Acquisition 模式下启动成像采集程序。

打开设置窗口并调整焦距和最佳采集时间。对参考图片进行成像并将单元格标记为 ROI。在没有单元格的区域中标记最后一个 ROI，并将其定义为背景。

然后，完成设置并以 5 秒的采集速率开始测量。接下来，根据实验设计以适当的循环编号添加溶液。为了测量抗原诱导的细胞内钙浓度升高，请在第 20 个周期后使用 syringe-two 溶液，并在第 150 个周期后停止记录。

为了测量化合物 48/80 诱导的细胞内钙浓度升高，请在第 20 个周期后使用注射器-三溶液，并在第 150 个周期后停止记录。为了测量 SOCE 诱发的细胞内钙浓度升高，在第 10 个周期后使用注射器 4 溶液，在第 70 个周期后使用注射器 5 溶液，在第 120 个周期后使用注射器 4 溶液，在第 150 个周期后使用注射器 1 溶液，并在第 220 个周期后停止记录。在采集程序中，连续按下按钮 Start Cutter， Mark All， Convert All， Physiology Measurements， OK，然后再次按下 OK。

将文件保存为表和图像堆栈以供离线分析。为了测量 β-己糖胺酶的释放，每孔将 100 微升细胞悬液转移到 96 孔 V 形底孔板中。向每个孔中加入 25 微升刺激或对照溶液。

然后，将细胞在 45 摄氏度下孵育 37 分钟。然后，将 96 孔板置于冰上 5 分钟以终止反应。然后，将板在 4 摄氏度下以 120 g 离心 4 分钟。

将 120 微升上清液转移到平底 96 孔板中，并将其置于冰上。小心避免接触细胞沉淀，但要完全吸出上清液。接下来，向细胞沉淀中加入 125 μL 裂解缓冲液。

将细胞沉淀在室温下孵育 5 分钟，并在孵育后通过重复移液重新悬浮。在新的平底 96 孔板的所需孔中移液 25 微升 4 毫摩尔 pNAG 溶液。将 25 μL 的每种上清液和 25 μL 的每种细胞裂解物分别添加到制备的 pNAG 溶液中。

将反应批次在 37 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，向每个孔中移取 150 μL 终止液以终止反应。接下来，使用微孔板读数仪在 405 纳米处分析板样品的吸光度，参考 630 纳米以进行自动背景扣除。

在采集程序中，选中 Reference 框，然后在吸光度程序元素菜单中，选择 630 纳米进行自动背景扣除。进行 β-己糖胺酶释放试验，以测试分离的 PMC 在质糖体 IgE 高亲和力受体交联或刺激 Mrg PRB2 受体后发生脱颗粒的能力。将细胞添加到 V 形底 96 孔板中，并根据此方案在 37 摄氏度下刺激 45 分钟。

离心并去除上清液后，裂解沉淀。然后在 37 摄氏度孵育 1 小时期间，通过它们与 pNAG 的反应来分析单个上清液和沉淀裂解物的 β-己糖胺酶含量。比色法检测反应产物的量，并计算释放的 β-己糖胺酶的百分比。

自发释放非常低，而对强脱颗粒刺激的反应，例如 10 μmol 离子霉素和化合物 48/80 在 50 μg/mL，分别超过 40% 和 60%。对 DNP 刺激的脱颗粒反应在 10 至 300 毫克/毫升的浓度范围内是剂量依赖性的。总之，这些数据清楚地表明分离的 PMC 具有良好的功能状态。

使用这种技术，您将在两周内获得来自腹膜的高纯度小鼠成熟结缔组织肥大细胞群。在尝试此程序时，请务必记住在细胞分离和培养过程中保持无菌条件，以避免细菌污染。按照此程序，可以执行其他方法，如电生理膜片钳离子电流测量，以回答有关肥大细胞中钙进入途径的其他问题。

Fura-2 细胞内钙成像技术开发后，为肿块细胞生理学领域的研究人员探索肥大细胞脱颗粒的钙依赖性铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何使用肥大细胞进行 Fura-2 钙成像实验和 β-己糖胺酶脱颗粒测定有很好的了解。不要忘记，使用紫外线辐射可能对眼睛和皮肤有害，因此在执行此程序时应避免不必要的暴露。