结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学相结合，其总体目标是表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。该方法有助于回答突触生理学领域中的关键问题，例如阐明突触前蛋白在完整脑环路中的生理作用。该技术的主要优势在于，能够选择性地监测目标突触前蛋白表达降低的神经元中的突触传递。

此外，我们已采用该方法研究急性脑切片中的突触前功能。该方法也可用于在体条件下操控和探究神经元活动。本实验操作将由本实验室的研究生 Carmela Vitale 演示。

在设计microRNA并构建用于表达microRNA和光遗传探针的重组载体后，从目标脑区制备原代神经元培养物。为此，请遵循L.A. Cingolani及其团队建立的皮层神经元培养方案，并进行如下修改：首先，使用六孔板，每孔接种50万个神经元，每孔加入2.5毫升贴壁培养基。

将培养板孵育4小时后，更换为每孔3.3毫升维持培养基；若观察到星形胶质细胞过度生长，则在3至4天体外培养（DIV）时，每孔加入0.5毫升含7.5 µM AraC的维持培养基。在5至6天体外培养（DIV）时，对每种待检测的microRNA感染三个孔。使用能够感染至少99%神经元的最低感染剂量。

将病毒直接加入神经元中，轻轻混匀，然后将培养板放回37摄氏度的培养箱中。在17至18天体外培养（DIV）时，裂解神经元以提取RNA。倾斜培养板，使用玻璃移液管吸出每个孔中的全部培养基。

然后，立即向每个孔中加入 700 微升裂解试剂。短暂混匀后，将每个孔中的细胞裂解液转移至不同的 1.5 毫升离心管中。接着，向每份裂解液中加入 140 微升氯仿。

迅速盖紧管盖并剧烈振荡15秒，使管内物质乳化。接着，在4°C条件下，以12,000 ×g离心15分钟。然后，小心转移含有RNA的上层水相至新管中。

切勿让移液枪头接触有机相。向水相中加入1.5倍体积的100%乙醇，缓慢吹打溶液三次以混匀。然后使用市售试剂盒纯化RNA，并对得率进行定量。

每个样本预计至少获得 3.5 微克。蛋白质和有机化合物的纯度比值均应至少达到 1.9。接下来，使用试剂盒将 250、500 或 1,000 纳克 RNA 进行逆转录。

然后，通过定量RT-PCR检测目的内源基因的敲低效率。敲低效率应至少达到60%。本方案中使用的动物，需在15天或更早之前，根据A. Cetin及其团队先前发表的方案，向脑内注射了RAAV12。分离脑组织，并使用振动切片机在冰冻且通有混合气体的ACSF中制备急性脑切片。

收集目标区域的切片，并尽量减少其暴露于光线下，以避免激活光遗传学探针。将切片置于相同的ACSF中，在37摄氏度下恢复30分钟。使用专为脑切片设计的孵育 chamber。

然后，将切片放回室温环境，在此条件下切片可保持健康状态6至8小时。接下来，将一片切片转移至记录室，并以每分钟2毫升的速度用ACFF进行灌流。随后，短暂检查表达的荧光报告基因信号，以确定感染的定位与强度。

然后，用细胞内溶液填充记录电极。接着，在红外光照下，对接受来自感染神经元突触输入的神经元建立高阻封接的全细胞记录模式。串联电阻可以不进行补偿，但应保持恒定且较低。

例如，如果 CA3 锥体神经元被感染，则对 CA1 区近端至中段通路的锥体神经元进行膜片钳记录。当细胞开始出现皱缩或肿胀，膜片钳操作变得困难，或记录信号不稳定时，说明所选脑片已不够健康，无法继续用于记录。接下来，使用药理学方法分离出待研究的突触电流。

例如，如果目的是研究兴奋性突触传递，可通过在浴液中加入荷包牡丹碱来阻断抑制性突触传递。随后，使用波长为473纳米的蓝色激光，耦合至定位在感染神经元胞体上的光纤，诱发突触电流（如兴奋性突触后电流）。切勿将激光直接照射到神经元的轴突上。

例如，避免将光线照射到Schaffer侧支上。直接去极化轴突是不可取的。然后，将刺激时长调整至最短，以减少每次光脉冲引发多个动作电位的可能性。

接下来，调整激光强度，以诱发微小但可明确检测到的突触电流。例如，在CA3与CA1锥体神经元之间的兴奋性突触传递实验中，调节激光强度，使诱发的突触电流在20至50皮安之间。实验结束时，加入0.5微摩尔的河豚毒素（tetrodotoxin）以阻断钠通道。

光诱发电流对河豚毒素的敏感性表明，这些电流是由动作电位驱动的。请持续收集数据，直至在至少三个不同的动物中，每种给定条件下至少记录了八个神经元。这是分析结果所需的最少数据量。

利用所述方法，敲低了突触前P/Q型电压门控钙通道的可变剪接异构体。这些通道被认为可调控CA3至CA1兴奋性突触的短期突触可塑性。构建了四种表达异构体特异性microRNA的不同载体；每种载体均与一种超快通道视紫红质以及荧光蛋白Td-Tomato共同表达。

首先，使用亚型特异性的定量RT-PCR在原代大鼠神经元培养物中验证每个构建体均具有足够的敲低效率和选择性。接着，将每个构建体注射至P18大鼠的海马体中。最后，通过以473纳米短脉冲光刺激被感染的CA3锥体神经元，并从CA1区锥体神经元进行全细胞记录以获取兴奋性突触后电流（EPSCs），从而研究这些构建体对CA3至CA1突触短期突触可塑性的影响。

不同剪接异构体的敲低以相反方向影响了对成对脉冲刺激的反应。A异构体的敲低增强了成对脉冲易化；而B异构体的敲低则消除了该效应。将RNA干扰与光遗传学技术相结合，可使突触生理学领域的研究探索突触前蛋白如何在完整神经环路中调控短时程突触可塑性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何验证用于RNA干扰的microRNA，并掌握将其与光遗传学技术相结合以研究急性脑片中突触传递的方法。