Name: 光遗传学与人工 microRNAs 相结合对完整神经元回路中基因击倒对突触前功能的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解光遗传学与人工microRNA结合技术，用于研究完整神经元回路中基因敲低对突触前功能的影响。该方法可在急性脑切片中选择性监测突触传递，为神经科学研究提供有效工具。

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感谢 F. Benfenati（意大利技术研究院，IIT）提供的支持，以及 Carmela Vitale 在演示过程中的协助。本工作由 IIT 和 Compagnia San Paolo（资助编号 9734，授予 LAC）提供资金支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

共表达一种光遗传学探针和针对特定突触前基因的miR，为在完整的神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响提供了一种强有力的方法。采用该实验策略时，关键在于鉴定并表征在天然系统中对目标基因具有高效率和高选择性的miR。如果可能，应使用两个或更多针对同一目标mRNA的独立miR，以对照可能存在的脱靶效应。此外，可通过挽救实验（即在系统中重新引入对miR具有抗性的基因）作为特异性对照。
使用相同的载体同时表达光遗传学探针和miR，可实现仅对经过遗传操作的突触前神经元进行光学刺激。而电刺激无法做到这一点，因为它无法区分被感染与未被感染的神经元，从而导致结果混杂且信号被稀释。由于光刺激能够诱发多个动作电位15，因此有必要从日益丰富的光遗传学工具中选择响应速度最快的探针15,19,20,21。此外，必须确保光刺激不会直接引起突触前末梢的去极化，以避免绕过拟研究的突触传递过程中的某些关键步骤22。
本文所述的实验方法能够在较短的时间内（4–6个月）并行评估多个突触前基因的生理相关性。然而，需要注意的是，基因敲低通常很难达到100%的效率。此外，重组腺相关病毒（rAAV）需要至少表达两周，以实现最大程度的基因敲低以及光遗传探针的充分表达，这在研究早期发育过程时可能构成时间上的限制。尽管耗时更长，但局限于突触前神经元的条件性基因敲除小鼠模型通常能够完全去除目标基因，因此是一种有效的互补方法。
miR 技术的一个特定优势在于，它能够从同一个启动子驱动多个 miR 的表达。这一特性主要用于通过插入同一 miR 的多个拷贝或针对同一靶基因的不同 miR 来提高基因沉默效率。然而，该特性也可用于同时沉默多个基因，即表达针对不同靶基因的 miR7,23。这一特性可用于沉默多个突触前蛋白，从而解析突触前信号通路。
在此，我们将光遗传学与人工miR相结合，以表征基因敲降对急性海马脑片中突触前功能的影响。类似的方法也可用于操控和探究神经环路。 体内此外，将人工miR与化学遗传学方法相结合，可实现对神经环路在更长时间尺度上的探究。

本方案描述了一种新方法，用于在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响。在完整神经环路中研究突触前功能具有挑战性，因为许多突触前终扣体积过小且远离胞体，难以同时进行分子和电生理干预。尽管RNA干扰提供了一种强大且灵活的手段来敲低突触蛋白1，但该方法极少被用于研究突触前功能，原因是传统电刺激难以检测敲低效应，无法区分经过操作与未经操作的突触前终扣2。本文中，我们介绍如何将人工微小RNA（miR）介导的RNA干扰与近期发展的光遗传学技术相结合，以实现对急性脑片中经过操作的突触前终扣进行选择性刺激。
虽然条件性基因敲除小鼠结合电生理学技术也可用于研究突触前蛋白的功能3,4，但我们的策略无需建立和维持基因修饰小鼠品系，且可轻松用于敲低基因的特定亚型。与更常用的短发夹RNA（shRNA）相比，本研究采用的人工miR在神经元敲低中具有关键优势。与shRNA不同，人工miR可在RNA聚合酶II启动子的控制下表达1。因此，可利用单一启动子同时驱动miR、光遗传学探针以及荧光报告基因的表达。通过这种方式，可将整个构建体的大小控制在重组腺相关病毒（rAAV）的包装容量之内（图1A）。此外，使用单一构建体和单一启动子可减少实验变异性，因为它能够以固定比例共表达miR、光遗传学探针和荧光报告基因。
我们最近应用该技术研究了海马体中突触前钙通道选择性剪接异构体的作用5。这一策略通常适用于研究任何感兴趣脑回路中其他突触前表达蛋白的生理相关性。

<table><tbody><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma</td><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺，30% 溶液</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>动物体温控制器配加热垫</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>脑片预室</td><td>哈佛仪器</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>基于CCD相机的成像仪</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&amp;trade; MP</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养试剂</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学发光底物</td><td>GE Healthcare</td><td>ECL 蛋白印迹试剂，RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>胞嘧啶 &amp;beta;-D-阿糖呋喃糖苷</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>钻孔</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素软膏</td><td>本地药店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>注射微移液管</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>无机盐 &amp;和去垢剂</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-磷酸肌酸</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>激光</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>膜</td><td>Amersham</td><td>Protran&amp;trade; 0.2 &amp;micro;m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>微移液管夹持器</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>眼部润滑剂</td><td>地方药店</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&amp;trade;无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质凝胶电泳及转印装置</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>Mini-Protean III 电泳槽</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>本地药店</td><td>聚维酮碘</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol裂解试剂</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>QuantiTect 逆转录&lt;br/&gt; 转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

结合光遗传学与人工微小rna技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

本实验方案旨在表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。我们介绍了一种将人工微小RNA（miR）介导的RNA干扰技术与光遗传学相结合的工作流程，以实现对急性脑片中经遗传操作的突触前终末进行选择性光刺激。该实验方法采用单一病毒载体和单一神经元特异性启动子，驱动光遗传学探针及针对突触前基因的人工miR共同表达。当该载体通过立体定位注射至目标脑区后，可在活体组织中特异性地仅对目的基因表达水平降低的神经元进行光刺激。该策略无需构建和维持转基因小鼠品系，原则上可应用于其他生物体系以及任意选定的神经元基因。我们近期已将该方法用于研究突触前P/Q型电压门控钙通道（VGCCs）不同剪接异构体的敲低如何调控急性海马脑片中CA3至CA1兴奋性突触的短时程突触可塑性。类似方法亦可用于操控和探究神经环路功能

关键词：基因敲低，人工miR，RNA干扰，光遗传学，突触前功能，急性脑片，病毒载体，神经环路，电压门控钙通道，剪接异构体，短时程突触可塑性，CA3-CA1突触 体内.

上述步骤提供了一种可靠的方法，用于评估突触前神经元中突触蛋白表达下调对突触传递的影响。以下示例展示了突触前Cav2.1（P/Q型）电压门控钙通道不同剪接异构体表达下调如何调控CA3至CA1兴奋性突触的短期突触可塑性。
Cav2.1（P/Q型）通道是中枢神经系统大多数快速突触中主要的突触前电压门控钙通道（VGCCs）。Cav2.1孔形成α1亚基（α1A）中相互排斥的外显子37a和37b的可变剪接产生了两种主要变体：Cav2.1[EFa]和Cav2.1[EFb]16,17,18。为了确定Cav2.1[EFa]和Cav2.1[EFb]是否在大鼠海马锥体神经元中差异性地调控突触传递和突触可塑性，我们首先开发了亚型特异性的miR，以选择性敲低Cav2.1[EFa]或Cav2.1[EFb]5。尽管外显子37a和37b序列较短（97 bp）且高度相似（核苷酸水平上具有61.86%的一致性），我们仍成功设计出三条针对大鼠Cav2.1[EFa]的miR序列（miR EFa1：TCCTTATAGTGAATGCGGCCG；miR EFa2：ATGTCCTTATAGTGAATGCGG；miR EFa3：TTGCAAGCAACCCTATGAGGA）以及两条针对大鼠Cav2.1[EFb]的miR序列（miR EFb1：ATACATGTCCGGGTAAGGCAT；miR EFb2：ATCTGATACATGTCCGGGTAA），预测其具有高效的敲低效果。作为阴性对照（miR Control），我们使用了pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg质粒，该质粒包含一段不靶向任何已知脊椎动物基因的序列。根据在HEK 293细胞中对异源表达通道的初步筛选结果，我们选定了miR EFa1、miR EFa3和miR EFb2，并将其表达盒克隆至载体pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X的3'非翻译区（3'UTR），该载体用于重组腺相关病毒（rAAV）的制备，其中突触素启动子驱动超快通道视紫红质ChETA、红色荧光蛋白TdTomato以及插入的miR的表达（图1）。此外，我们还将miR EFb2的表达盒重复一次，以提高该miR的敲低效率。
接下来，我们为上述四种构建体准备了rAAV1/2，并使用亚型特异性的qRT-PCR在原代大鼠神经元培养物中定量其敲低效率和选择性。miR EFa1和miR EFa3可将内源性Cav2.1[EFa]的mRNA降低约70%，但对Cav2.1[EFb]的mRNA无影响；而miR EFb可将内源性Cav2.1[EFb]的mRNA降低约60%，但对Cav2.1[EFa]的mRNA无影响（图2）。
随后，我们将四种rAAV1/2病毒立体定位注射至P18大鼠海马CA3区（相对于前囟的坐标A-P/M-L/D-V为−2.6/±2.9/−2.9）（图3A-C）。注射后15至24天，制备rAAV1/2注射大鼠的急性海马脑片，并利用TdTomato荧光确认rAAV的表达与定位情况（图3B）。为了研究在CA3至CA1突触中，突触前Cav2.1[EFa]或Cav2.1[EFb]的敲低是否影响短时程突触可塑性，我们使用短暂的473 nm激光脉冲（持续2 ms）选择性刺激被感染的CA3神经元（图3C），并通过膜片钳记录CA1区域近端至中段通路中的锥体神经元所产生的兴奋性突触后电流（EPSCs）（图3C）。我们发现，Cav2.1剪接异构体的敲低对成对脉冲刺激的反应产生了相反方向的影响：Cav2.1[EFa]（miR EFa1或miR EFa3）的敲低增强了成对脉冲易化（PPF），而Cav2.1[EFb]（miR EFb2）的敲低则消除了该效应（图3D，E）。
<img alt="显示用于基因表达的 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR X 质粒图谱；包含 miRNA 序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：超快光遗传探针 ChETA 与针对 Cav2.1[EFa] 和 Cav2.1[EFb] 亚型特异性 miR 联合表达载体的示意图。(A) rAAV 载体 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X 的图谱，包含突触素启动子（Syn）、与 TdTomato 融合的超快通道视紫红质 ChETA，以及位于近端 3'非翻译区（3'UTR）的 Cav2.1 剪接亚型特异性 miR。图中所示限制性内切酶均为单一切点酶。(B) 上图：表达盒示意图。突触素启动子驱动 ChETA-TdTomato 和亚型特异性 miR 的共同表达。下图：21 个核苷酸靶序列的反向互补序列，构成 miR 表达盒的一部分。对于 miR EFb2，两个相同的 miR 表达盒以头尾相连的方式串联表达。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示Cav2.1 EF mRNA表达（红色/蓝色）、miR处理条件及统计显著性的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 针对Cav2.1[EFa]和Cav2.1[EFb]亚型特异性miR的敲低效率与选择性评估。 对在6 DIV时感染表达靶向Cav2.1[EFa]（miR EFa1和miR EFa3）或Cav2.1[EFb]（miR EFb2）的rAAV的17–18 DIV原代培养物中提取的RNA进行亚型特异性qRT-PCR分析。数据经标准化处理，以阴性对照（miR Control）为基准。miR EFa1和miR EFa3显著且选择性地降低了Cav2.1[EFa]的mRNA水平（分别为n = 8和7个培养样本），而miR EFb显著且选择性地降低了Cav2.1[EFb]的mRNA水平（n = 4个培养样本；***p&lt;0.001；采用单因素方差分析后接Tukey-Kramer多重比较检验）。数据以均值±标准误表示。本图改编自Thalhammer, A. et al.5。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光遗传学刺激装置；突触反应分析；ChETA，光学，miR表达，电生理学" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 评估Ca在其中的作用v2.1[EFa] 和 Cav通过光遗传学靶向刺激敲低神经元，在天然海马体中检测2.1[EFb]。 （A） 用于rAAV载体的表达盒示意图 体内 感染 （B） 海马切片显示 TdTomato 荧光局限于 CA3 区域及其投射纤维。 (C) 实验配置：将激光束照射至CA3锥体细胞胞体，同时对CA1锥体神经元进行膜片钳记录。 (D) 2毫秒长、473 nm蓝色激光脉冲以20 Hz频率照射，可诱发兴奋性突触后电流（EPSCs），其成对脉冲易化（PPF）效应因靶向Ca的miRs而增强v2.1[EFa] 及 miR 对 Ca 的消除作用v2.1[EFb] (E) miR EFa1、miR EFa3 与 miR Control 相比，PPF 增加，而 miR EFb2 则降低（n = 9 - 11 次记录；*p=0.02；**p=0.01；***p&lt;0.0004；协方差分析）。数据以均值 ± 标准误表示。本图改编自 Thalhammer, A. 等5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案提供了一种工作流程，介绍如何将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学技术相结合，以特异性刺激完整神经环路中选择性基因表达降低的突触前终末。

结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

本实验方案的目的是在完整的神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响。我们描述了一种……

将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学相结合，其总体目标是表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。该方法有助于回答突触生理学领域中的关键问题，例如阐明突触前蛋白在完整脑环路中的生理作用。该技术的主要优势在于，能够选择性地监测目标突触前蛋白表达降低的神经元中的突触传递。此外，我们已采用该方法研究急性脑切片中的突触前功能。该方法也可用于在体条件下操控和探究神经元活动。本实验操作将由本实验室的研究生 Carmela Vitale 演示。在设计microRNA并构建用于表达microRNA和光遗传探针的重组载体后，从目标脑区制备原代神经元培养物。为此，请遵循L.A. Cingolani及其团队建立的皮层神经元培养方案，并进行如下修改：首先，使用六孔板，每孔接种50万个神经元，每孔加入2.5毫升贴壁培养基。将培养板孵育4小时后，更换为每孔3.3毫升维持培养基；若观察到星形胶质细胞过度生长，则在3至4天体外培养（DIV）时，每孔加入0.5毫升含7.5 µM AraC的维持培养基。在5至6天体外培养（DIV）时，对每种待检测的microRNA感染三个孔。使用能够感染至少99%神经元的最低感染剂量。将病毒直接加入神经元中，轻轻混匀，然后将培养板放回37摄氏度的培养箱中。在17至18天体外培养（DIV）时，裂解神经元以提取RNA。倾斜培养板，使用玻璃移液管吸出每个孔中的全部培养基。然后，立即向每个孔中加入 700 微升裂解试剂。短暂混匀后，将每个孔中的细胞裂解液转移至不同的 1.5 毫升离心管中。接着，向每份裂解液中加入 140 微升氯仿。迅速盖紧管盖并剧烈振荡15秒，使管内物质乳化。接着，在4°C条件下，以12,000 ×g离心15分钟。然后，小心转移含有RNA的上层水相至新管中。切勿让移液枪头接触有机相。向水相中加入1.5倍体积的100%乙醇，缓慢吹打溶液三次以混匀。然后使用市售试剂盒纯化RNA，并对得率进行定量。每个样本预计至少获得 3.5 微克。蛋白质和有机化合物的纯度比值均应至少达到 1.9。接下来，使用试剂盒将 250、500 或 1,000 纳克 RNA 进行逆转录。然后，通过定量RT-PCR检测目的内源基因的敲低效率。敲低效率应至少达到60%。本方案中使用的动物，需在15天或更早之前，根据A. Cetin及其团队先前发表的方案，向脑内注射了RAAV12。分离脑组织，并使用振动切片机在冰冻且通有混合气体的ACSF中制备急性脑切片。收集目标区域的切片，并尽量减少其暴露于光线下，以避免激活光遗传学探针。将切片置于相同的ACSF中，在37摄氏度下恢复30分钟。使用专为脑切片设计的孵育 chamber。然后，将切片放回室温环境，在此条件下切片可保持健康状态6至8小时。接下来，将一片切片转移至记录室，并以每分钟2毫升的速度用ACFF进行灌流。随后，短暂检查表达的荧光报告基因信号，以确定感染的定位与强度。然后，用细胞内溶液填充记录电极。接着，在红外光照下，对接受来自感染神经元突触输入的神经元建立高阻封接的全细胞记录模式。串联电阻可以不进行补偿，但应保持恒定且较低。例如，如果 CA3 锥体神经元被感染，则对 CA1 区近端至中段通路的锥体神经元进行膜片钳记录。当细胞开始出现皱缩或肿胀，膜片钳操作变得困难，或记录信号不稳定时，说明所选脑片已不够健康，无法继续用于记录。接下来，使用药理学方法分离出待研究的突触电流。例如，如果目的是研究兴奋性突触传递，可通过在浴液中加入荷包牡丹碱来阻断抑制性突触传递。随后，使用波长为473纳米的蓝色激光，耦合至定位在感染神经元胞体上的光纤，诱发突触电流（如兴奋性突触后电流）。切勿将激光直接照射到神经元的轴突上。例如，避免将光线照射到Schaffer侧支上。直接去极化轴突是不可取的。然后，将刺激时长调整至最短，以减少每次光脉冲引发多个动作电位的可能性。接下来，调整激光强度，以诱发微小但可明确检测到的突触电流。例如，在CA3与CA1锥体神经元之间的兴奋性突触传递实验中，调节激光强度，使诱发的突触电流在20至50皮安之间。实验结束时，加入0.5微摩尔的河豚毒素（tetrodotoxin）以阻断钠通道。光诱发电流对河豚毒素的敏感性表明，这些电流是由动作电位驱动的。请持续收集数据，直至在至少三个不同的动物中，每种给定条件下至少记录了八个神经元。这是分析结果所需的最少数据量。利用所述方法，敲低了突触前P/Q型电压门控钙通道的可变剪接异构体。这些通道被认为可调控CA3至CA1兴奋性突触的短期突触可塑性。构建了四种表达异构体特异性microRNA的不同载体；每种载体均与一种超快通道视紫红质以及荧光蛋白Td-Tomato共同表达。首先，使用亚型特异性的定量RT-PCR在原代大鼠神经元培养物中验证每个构建体均具有足够的敲低效率和选择性。接着，将每个构建体注射至P18大鼠的海马体中。最后，通过以473纳米短脉冲光刺激被感染的CA3锥体神经元，并从CA1区锥体神经元进行全细胞记录以获取兴奋性突触后电流（EPSCs），从而研究这些构建体对CA3至CA1突触短期突触可塑性的影响。不同剪接异构体的敲低以相反方向影响了对成对脉冲刺激的反应。A异构体的敲低增强了成对脉冲易化；而B异构体的敲低则消除了该效应。将RNA干扰与光遗传学技术相结合，可使突触生理学领域的研究探索突触前蛋白如何在完整神经环路中调控短时程突触可塑性。观看本视频后，您应能够充分理解如何验证用于RNA干扰的microRNA，并掌握将其与光遗传学技术相结合以研究急性脑片中突触传递的方法。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

光遗传学与人工 microRNAs 相结合对完整神经元回路中基因击倒对突触前功能的影响

本视频展示了小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触电流抑制。CA3神经元被携带表达荧光报告蛋白、光激活膜通道以及可下调电压门控钙通道表达的微小RNA构建体的重组病毒载体感染。将脑片置于记录室中，并用记录电极对CA1神经元进行膜片钳记录后，使用光脉冲刺激光激活通道，引起离子内流并产生动作电位。由于CA3神经元中缺乏电压门控钙通道，神经递质释放受到抑制，从而导致与之突触连接的CA1神经元中兴奋性突触后电流被抑制。...

小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触后电流抑制

microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内...

向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in...

光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

光遗传学已成为行为神经科学研究中的一种强大工具。本方案提供了激光系统设计与搭建的逐步指南，并给出了进行多重且同步实验操作的完整方案 体内...

in vivo 光遗传学刺激啮齿类动物中枢神经系统

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

本文介绍了在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间，对特定类型神经元进行光遗传学操控的方法，并以我们近期关于终纹床核的研究为例进行说明。...

在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

了解光遗传学与人工microRNA结合技术，用于研究完整神经元回路中基因敲低对突触前功能的影响。该方法可在急性脑切片中选择性监测突触传递，为神经科学研究提供有效工具。

结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

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