Name: 人胰岛自身抗体的电化学发光测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习使用电化学发光法检测人胰岛自身抗体，该方法具有高灵敏度和特异性，可用于预测1型糖尿病。此技术还可应用于其他自身免疫性疾病的诊断研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DK32083和青少年糖尿病研究基金会（JDRF）资助项目2-SRA-2015-51-Q-R支持。

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）：在400 mL去离子蒸馏水（DD水）中加入100 mL 10x PBS，用NaOH调节pH至7.9。</li>
	<li>3 mM生物素（Biotin）：将1 mg生物素溶解于588 µL标记缓冲液中。</li>
	<li>3 mM Sulfo-tag：将150 nmol Sulfo-tag溶解于50 µL标记缓冲液中。</li>
	<li>抗原缓冲液（5% BSA）：在500 mL 1x PBS中加入25 g牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）。</li>
	<li>配制0.5 M乙酸溶液。</li>
	<li>1.0 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）：配制1 M Tris-HCl缓冲液，并用HCl调节pH至9.0。</li>
	<li>包被缓冲液（3% Blocker A）：在500 mL 1x PBS中加入15 g Blocker A。</li>
	<li>洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）：在5000 mL 1x PBS中加入2.5 mL Tween 20。</li>
	<li>读取缓冲液（2x Read Buffer T含表面活性剂）：在500 mL去离子蒸馏水中加入500 mL 4x Read Buffer T含表面活性剂（材料表）。</li>
	<li>将生物素和Sulfo-tag储存于-20 °C冰箱中。 
	注意：生物素和Sulfo-tag溶液应在标记操作前新鲜配制。</li>
</ol>
2. 使用生物素和磺化标记物标记人胰岛自身抗原
注意：为了获得更高效的标记反应，建议使用高浓度的抗原（≥0.5 mg/mL）。
<ol>
	<li>确定人胰岛自身抗原与生物素（Biotin）及磺化标记物（Sulfo-tag）的摩尔比。
	<ol>
		<li>通过将抗原质量除以其分子量，计算抗原的摩尔数。</li>
		<li>对于分子量较小（≤10 kd）的抗原，使用1:5的摩尔比；对于分子量较大（&#62;50 kd）的抗原，使用1:20的摩尔比。</li>
		<li>通过将摩尔数除以其浓度，计算所需生物素或磺化标记物的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照1:5的摩尔比，将人胰岛自身抗原与生物素或磺化标记物混合。 
	注：若蛋白处于Tris或甘氨酸缓冲体系中，应使用尺寸排阻离心柱将其置换至pH 7.9的2x PBS缓冲液中。</li>
	<li>由于生物素和磺化标记物对光敏感，需用铝箔包裹反应管。在室温（RT）下孵育1小时。</li>
	<li>孵育期间，通过向离心柱中加入2x PBS缓冲液三次，对离心柱进行预处理。每次以1000 × g离心2分钟。 
	注：目前标记反应仍通过桥接作用持续进行，需及时终止。</li>
	<li>通过纯化标记后的人胰岛自身抗原来终止标记反应。纯化时，将抗原溶液通过离心柱，并以1000 × g离心2分钟。</li>
	<li>利用抗原蛋白的总量和最终体积，测定标记抗原的浓度（µg/µL）。 
	注：通常情况下，每次通过离心柱后，标记抗原的回收率约为90–95%。</li>
	<li>将标记抗原分装，并于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 确定检测中两种标记抗原的最佳浓度和比例（棋盘滴定法）
<ol>
	<li>准备两个血清样本，一个为强阳性，另一个为阴性，每个样本总体积为 200 µL。</li>
	<li>取 4 µL 血清，加入 1x PBS，使每孔终体积达到 20 µL，用于 96 孔 PCR 板。使用半块板处理强阳性样本，另半块板处理阴性样本，如图 2A所示。</li>
	<li>加入 10 µL 生物素标记抗原和 10 µL Sulfo-tag 标记抗原，并对两种不同标记的抗原进行系列稀释，如图 2A所示。一种标记抗原进行横向系列稀释，另一种标记抗原进行纵向系列稀释。</li>
	<li>继续执行 5.3 至 9.1 节中描述的其余实验步骤。</li>
	<li>计算强阳性样本的信号与阴性样本相应信号之间的比值，如图 2B所示。</li>
	<li>通过选择阳性与阴性信号比值最高或接近最高的点，确定生物素和 Sulfo-tag 标记抗原的最佳浓度。在确定比值时，应考虑阴性样本的低背景信号。 
	注意：实验第 1 天包括第 4 至第 6 步。</li>
</ol>
4. 使用正确浓度的生物素/磺化标记抗原制备抗原缓冲液
<ol>
	<li>根据棋盘式滴定实验选择每种抗原的合理浓度。</li>
	<li>每块板准备 3 mL 抗原溶液，使用生物素/磺化标记抗原的合理浓度溶于抗原缓冲液中。</li>
</ol>
5. 将血清样本与标记抗原孵育
注意：本节包含两种实验方案，一种不包含血清酸处理，另一种包含血清酸处理。除IAA检测外，所有胰岛自身抗体检测均采用从步骤5.1至5.5的常规方案（无血清酸处理）；而IAA检测则跳过这些步骤，采用从步骤5.6至5.9的含血清酸处理方案。
<ol>
	<li>取4 µL血清，加入1x PBS，使每孔终体积为20 µL（适用于96孔PCR板）。</li>
	<li>每孔加入20 µL标记的抗原溶液。</li>
	<li>用封口膜覆盖PCR板，避免光照。</li>
	<li>将PCR板置于摇床上（低速），室温孵育2小时。</li>
	<li>将PCR板放入4 °C冰箱，过夜孵育（18 - 24小时）。 
	注意：以下从步骤5.6到5.9的操作仅适用于IAA检测，其他自身抗体检测无需执行这些步骤。</li>
	<li>每个血清样本取15 µL血清与18 µL 0.5 M乙酸混合，室温孵育45分钟。</li>
	<li>根据方阵滴定实验结果，使用抗原缓冲液配制含有适当浓度Biotin和Sulfo-tag标记抗原的抗原溶液。在新的PCR板中，每孔加入35 µL含Biotin和Sulfo-tag标记抗原的抗原缓冲液。</li>
	<li>在完成45分钟孵育（步骤5.6）之前，向抗原板每孔侧壁加入8.3 µL 1 M Tris pH 9.0缓冲液（即步骤5.6中的抗原板）。注意避免Tris缓冲液与抗原溶液过早混合。立即从步骤5.6中取出25 µL经酸处理的血清转移至各孔，并轻轻振荡混匀。用封口膜覆盖PCR板，避免光照。</li>
	<li>将PCR板置于摇床上（低速），室温孵育2小时，随后放入4 °C冰箱，过夜孵育（18 - 24小时）。</li>
</ol>
6. 准备链霉亲和素包被板
<ol>
	<li>从4 °C冰箱中取出链霉亲和素包被板，使其恢复至室温。</li>
	<li>当链霉亲和素包被板达到室温后，向每孔加入150 µL 3% 封闭液A。</li>
	<li>用密封膜封好PCR板。</li>
	<li>将板置于4 °C冰箱中过夜孵育。 
	注意：检测第2天包括步骤7至步骤9。</li>
</ol>
7. 将血清/抗原孵育液转移至链霉亲和素包被板
<ol>
	<li>第二天，从冰箱中取出链霉亲和素包被板，弃去板中的缓冲液。在实验台上铺一些干燥的纸巾，将板倒扣轻拍，直至孔内无残留缓冲液。</li>
	<li>每孔加入 150 µL PBST，填满空的链霉亲和素板，随后弃去 PBST，共洗涤三次。</li>
	<li>将 30 µL 血清/抗原孵育液转移至链霉亲和素板的每个孔中。</li>
	<li>用铝箔覆盖板以避光，在室温下低速振荡孵育 1 小时。</li>
</ol>
8. 洗涤平板并加入读板缓冲液
<ol>
	<li>弃去孔板中的孵育液。每孔加入 150 µL PBST，弃去孔板中的 PBST，共洗涤三次。</li>
	<li>洗涤后，每孔加入 150 µL 读板缓冲液。 
	注意：必须避免溶液中产生气泡，因为这会影响酶标仪对孔板的读数结果。</li>
</ol>
9. 读取酶标板并分析数据
<ol>
	<li>使用酶标仪对平板进行计数。抗体值以每秒计数（CPS）表示。</li>
	<li>将酶标仪获得的抗体水平转换为相对指数。按以下公式计算指数： 
	指数值 = [样本 CPS - 阴性对照 CPS] / [阳性对照 CPS - 阴性对照 CPS]。</li>
	<li>根据100名健康对照个体（无已知自身免疫性疾病、无糖尿病家族史的非糖尿病个体）第99百分位数确定的阳性临界值，判定抗体结果的阴阳性。</li>
</ol>

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<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胰岛自身抗体目前是1型糖尿病自身免疫最可靠的生物标志物。它们标志着胰岛特异性自身免疫的起始，并可用于判断显性疾病的发病风险。用于检测胰岛自身抗体的电化学发光（ECL）检测法已在多项国家级和国际级1型糖尿病临床试验中得到广泛验证。与当前的“金标准”放射性结合分析法（RBA）相比，该检测法表现出更高的灵敏度和特异性。ECL检测法在区分高亲和力、高风险胰岛自身抗体与RBA检测中产生的低风险、低亲和力信号方面展现出显著优势，从而提高了对疾病的特异性判断能力。这一优势在仅单一胰岛自身抗体阳性且从未进展为1型糖尿病的受试者中尤为明显。大多数此类低亲和力自身抗体在数月到数年的随访检测中被发现消失，表现为“短暂阳性”。如先前假设所述，这些低亲和力的“单一”自身抗体可能源于与胰岛抗原发生交叉反应的分子所引发的免疫反应；而高亲和力、高风险的胰岛自身抗体则更可能由胰岛自身抗原直接引发免疫反应所致。此外，在从出生开始随访至临床糖尿病发病的糖尿病前期儿童中，ECL检测法已被证明能够比现有的标准放射性结合分析法（RBA）提前数年确定“血清转化”的时间点。目前正在进行的一项国际性临床试验——青少年糖尿病环境决定因素研究（The Environmental Determinants of Diabetes in the Young, TEDDY）——依赖于准确的检测手段，以精确定位首个胰岛自身抗体“血清转化”的时间和出现时机，从而标记胰岛自身免疫的最初起点，并用于识别环境触发因素。ECL检测法灵敏度更高的一个可能原因是，该方法能够捕获所有免疫球蛋白类别：IgG、IgM、IgA和IgE，而传统的RBA或ELISA仅依赖于IgG的检测。
在电化学发光（ECL）检测中，对于某些特定的自身抗体（如胰岛素自身抗体IAA），正常人血清中的某些成分似乎会抑制自身抗体与抗原的结合。为了消除或解除这种抑制作用，在血清与抗原孵育前，必须对血清样本进行酸化处理。如图5所示，在ECL-IAA检测中，小鼠胰岛素单克隆抗体以及患者血清中自身抗体与抗原的结合活性均显著增强。在抗体检测中，对血清样本进行酸化处理通常用于解离预先存在的结合复合物。目前尚不清楚IAA信号在人血清样本中被抑制以及通过酸化释放的具体机制，但该方法已被应用于其他基于ECL的检测方法14,15。
在少数情况下，对分子进行标记时，生物素（Biotin）或磺化标签（Sulfo-tag）的标记位点可能位于抗原蛋白分子的关键抗体结合表位处或非常接近该表位，从而干扰抗体的结合活性。这会降低检测的灵敏度，甚至可能导致检测完全失败。在常规标记过程中，通常希望每个抗原蛋白分子的标记达到最大化或饱和，以使每个标记分子产生最大活性或信号，即充分利用所有可能的标记位点。如果抗原上的标记可能干扰抗体结合活性，则应采用非饱和标记策略，通过降低标记分子（生物素和磺化标签）与抗原蛋白的摩尔比来实现。在大多数情况下，采用非饱和标记策略可更好地保留主要表位，从而减轻或消除对抗体结合活性的干扰。
每次检测应包含内部标准强阳性和阴性对照，用于未知样本的指数计算。应包含一个接近检测正常值上限的弱阳性对照，以监测检测的灵敏度。实验室应保存足够量的标准阳性和阴性对照品分装样本以供长期使用，所有分装样本均应储存于 -20 °C。为确保检测质量，每个样本必须进行重复检测，且每个阳性结果均须通过在另一次独立检测中重复样本进行确认。当第二次确证检测结果与第一次不一致时，需进行第三次检测；最终结果以两次一致的检测结果（例如，+,+ 或 -,-）为准，判定为阳性或阴性。
在已建立单重电化学发光（ECL）检测平台的基础上，可进一步拓展为多重检测方法。该方法可在单个孔中仅用微量血清同时检测多达10种不同的自身抗体。目前，在1型糖尿病（T1D）患者亲属及普通人群中，预测进展为T1D风险时，4种胰岛自身抗体——胰岛素自身抗体（IAA）、谷氨酸脱羧酶自身抗体（GADA）、胰岛抗原2自身抗体（IA-2A）和锌转运蛋白8自身抗体（ZnT8A）具有同等重要性。当前采用单一自身抗体检测方法对这4种抗体进行筛查，过程繁琐且效率低下，尤其不适用于大规模人群筛查。更重要的是，高达40%的T1D患者同时伴有其他自身免疫性疾病16,17,18。遗憾的是，目前尚无简便且经济的工具可用于这些疾病的筛查。多重ECL检测不仅能够将现有的4种主要胰岛自身抗体检测整合为一项检测，还可进一步纳入其他相关自身免疫性疾病的更多自身抗体检测项目。这使得在大规模人群中高效地同步开展多种自身免疫性疾病的高通量筛查成为可能。在多重ECL检测中，如[图6]所示，液体相中形成的每种抗体-抗原复合物将被固定在同一孔内的特定连接分子位点上。酶标仪的信号接收器能够识别来自10个不同位点的信号。然而，信号过强的位点可能产生较高的检测背景，并通过串扰干扰邻近位点。因此，每种自身抗体检测的信号上限应控制在20,000计数以下。根据我们的经验，在设计点阵图时，背景较低的自身抗体所对应的位点应相对远离信号较高的位点。对于长期研究中使用多重ECL检测的情况，建议对同一种自身抗体检测始终使用相同的连接分子，以确保检测的一致性。

最近已建立一种分期分类系统，以协助诊断患者1型糖尿病（T1D）的早期阶段。准确检测人胰岛自身抗体在识别和分期无症状期1型糖尿病中具有重要作用，因为胰岛自身抗体的存在表明存在β细胞自身免疫。从β细胞自身免疫初次出现到发展为有症状的糖尿病，其进展速度因胰岛自身抗体的数量和类型而异2,3。
胰岛自身抗体的血清转化年龄、滴度和亲和力可能影响进展为有症状的1型糖尿病的速度4,5,6,7,8,9,10。近年来开发的电化学发光（ECL）检测方法已得到广泛验证，表现出更高的敏感性，并且对疾病更具特异性10,11,12,13。这些检测方法通过更早地检出胰岛自身抗体，提高了糖尿病风险的预测和分期能力。它们能更精确地标记胰岛自身免疫的起始阶段，并排除与糖尿病无关的低亲和力和低风险信号。
在ECL检测中，如果血清中存在自身抗体，这些抗体会在液相中将磺化标记物（Sulfo-tag）偶联的抗原与生物素化的捕获抗原连接起来。连接完成后，生物素连接物被捕获至固相，并通过链霉亲和素包被板上的Sulfo-tag在电化学发光（ECL）中被检测（图1）。
本综述主要采用针对人胰岛自身抗体的单抗体电化学发光（ECL）检测方法。简要而言，将讨论基于单ECL检测的多重抗体检测技术。该多重检测方法可在单个孔中使用15 µL血清，同时鉴定多达10种不同的自身抗体。这种简单且高通量的检测方法可用于在普通人群中同时筛查多种相关自身免疫性疾病的多种自身抗体。

<table><tbody><tr><td>人重组前胰岛素蛋白（PINS）</td><td>AmideBio</td><td>Human Proinsulin, Rec</td><td></td></tr><tr><td>人重组GAD65蛋白</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>人重组IA-2蛋白</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS，pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被板</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba尺寸排阻离心柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link 生物素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>含表面活性剂的4x读板缓冲液T</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-Biotin</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚合酶链式反应（PCR）板</td><td>Fisher brand</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96孔链霉亲和素板</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba离心脱盐柱</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96孔板振荡器</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>带转篮式转子的台式离心机</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

人胰岛自身抗体的电化学发光检测法

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

确定与1型糖尿病（T1D）相关的胰岛自身抗体，是预测和预防该疾病在普通人群中发生的关键。一种新型电化学发光（ECL）检测法是一种非放射性液相检测技术，用于检测胰岛自身抗体，其灵敏度和特异性均高于当前的“金标准”放射性结合检测法（RBA）。ECL检测法能够更精确地界定无症状期T1D的起始阶段，因为它可区分高风险、高亲和力的自身抗体与在RBA及传统酶联免疫吸附试验（ELISA）中产生的低风险、低亲和力自身抗体。本ECL检测中所用的抗原蛋白分别标记了Sulfo-tag和生物素（Biotin）。每种使用特定抗原蛋白的ECL自身抗体检测在用于实验室应用前均需进行优化步骤。该步骤对于确定血清酸处理的条件、以及两种分别标记Sulfo-tag和生物素的抗原的浓度与比例尤为关键。进行检测时，将血清样本与Sulfo-tag偶联及生物素标记的捕获抗原蛋白混合于含5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后在4 °C下孵育过夜。同日，用封闭缓冲液处理链霉亲和素包被板，并在4 °C下孵育过夜。第二天，洗涤链霉亲和素板，然后将血清-抗原混合物转移至板上。将板置于板式振荡器上，调至低速，室温孵育1小时。随后再次洗涤板，并加入读板缓冲液。最后在板式读数仪上进行信号检测。检测结果以指数形式表示，该指数由内部标准阳性和阴性对照血清样本生成。

图2 显示棋盘格图。结果显示，考虑到强阳性对照样本的信号、阴性对照样本作为检测背景的信号以及阳性与阴性信号的比值，该检测中最合理的浓度为 250 ng/mL 生物素和 250 ng/mL 磺化标记抗原。. 在优化了这两种标记抗原的浓度后，采用该检测方法对100例新确诊的1型糖尿病（T1D）患者血清样本和100例健康对照样本进行了检测。以0.023为判定阳性的检测临界值（cut-off），根据所示的受试者工作特征（ROC）曲线，该临界值在患者中具有85%的敏感性，在健康对照中具有99%的特异性。 图 3A对未知样本的检测采用高阳性、低阳性和阴性对照样本作为内部标准。CPS计数结果如图所示。 表 2A。 高阳性对照和低阳性对照的平均CPS以红色标出，分别为17903 [(19940+15866)/2] 和839 [(857+820)/2]，阴性对照以绿色标出，为168 [(170+165)/2]。未知样本的指数通过“(CPS样本-168)/(17903-168)." 表 2B 显示所有样本的计算指数值。指数值大于 0.023 的以红色标出，对应于 CPS 值中同样以红色标出的数据。 表 2A。这些值将被定义为大于99的阳性结果th 健康对照人群的百分位数。当使用不合理的抗原浓度时，该检测会出现较高的背景值，如图所示 表 2C。 低水平的阳性抗体会被遗漏，如以灰色突出显示的 A2、A5、D1 和 H4 的数值所示 表 2D.
<img alt="电化学发光测定示意图；使用ECL标签检测胰岛素自身抗体的方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 单重ECL-IAA测定中二价板捕获的示意图。 血清中的胰岛自身抗体将磺化标记的抗原与生物素化捕获抗原桥接，后者被捕获在链霉亲和素包被板的固相上。通过ECL检测板上捕获的磺化标记抗原。该图改编自Yu, et al.11。 <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="ROC曲线图；灵敏度 vs 1-特异性；分类性能分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：用于确定检测阳性阈值的ROC曲线。 99th 特异性在对应85%灵敏度时的百分位数被选为指标值，表示为0.023。该检测方法的上限值来源于100名健康对照样本。 <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="MSD IAA 检测结果，MoAb 与患者血清，显示 IAA 水平与样本体积关系的图示" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3: 正常人血清阻断ECL-IAA信号示意图 A: 使用胰岛素单克隆抗体（MoAb）进行电化学发光免疫分析（ECL-IAA）时，加入正常人血清后信号被显著抑制。与在PBS中的MoAb相比，当人血清经酸处理后，信号部分恢复。B：对4份患者血清进行酸处理后，ECL-IAA检测信号显著增强。该图已根据Yu的研究修改。 等.11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多重ECL检测示意图，标注了抗原、链霉亲和素连接子和微孔板设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4： 多重电化学发光（ECL）检测示意图。 抗体-抗原复合物在液相中与特异性连接子结合形成。特异性的抗体-抗原-连接子复合物被固定在同一个孔内的各个特异性连接子位点上。酶标仪能够区分来自不同位点的信号，并在10个不同的通道上分别给出每秒计数（CPS）结果。<a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示生物素和SULFO-TAG浓度以及阳性/阴性对照的ELISA检测数据表。" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表 1"> 
表 1：棋盘滴定实验确定生物素标记和Sulfo-tag标记抗原的浓度与比例。 A：棋盘板的原始CPS计数结果，板的一半使用强阳性血清，另一半使用阴性血清。生物素化抗原的浓度沿水平方向梯度稀释，Sulfo-tag标记抗原的浓度沿垂直方向梯度稀释。B：强阳性血清的CPS计数与其对应阴性血清CPS计数的比值。黄色高亮的孔代表B图中阳性与阴性比值最佳的组合。该比值对应于A图中250 ng/mL生物素标记抗原和250 ng/mL Sulfo-tag标记抗原的浓度组合，且阴性血清的CPS计数处于可接受的低水平。<a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本表的高清版本。</a>
<img alt="静态平衡方程；数据分析表；数值数据集比较；教育研究。" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表 2"> 
表 2：检测结果分析。A：来自检测板的原始 CPS 计数，其中标准高阳性和低阳性对照以红色标出，标准阴性对照以绿色标出。每个样本在检测中均设重复。B：根据检测方案所述计算指数值。任何指数值大于 0.023 的结果定义为阳性结果，并以红色标出。C：使用非合理抗原浓度时，同一组样本在检测板上的原始 CPS 计数。这导致背景信号升高，一些通常可检测到的弱阳性结果（如 B 图所示）转变为阴性结果，并在 D 图中以灰色标出。<a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表的高清版本。</a>

本文介绍了使用电化学发光（ECL）检测法检测人胰岛自身抗体的方法。该方案可用于预测1型糖尿病，也可拓展用于检测其他自身免疫性疾病的自身抗体。

精确定位与1型糖尿病（T1D）相关的胰岛自身抗体，是推动在普通人群中预测和预防该疾病的关键。一种新型……

本电化学发光检测方法的总体目标是高灵敏度、高特异性地检测自身免疫性1型糖尿病中的胰岛自身抗体。该方法有助于解答1型糖尿病领域中的关键科学问题，例如胰岛自身免疫反应的起始时间以及1型糖尿病的高风险预测。与目前常规使用的放射性检测方法相比，该技术的主要优势在于灵敏度更高、疾病特异性更强，且不使用放射性物质。该技术的应用意义在于预测和诊断1型糖尿病，因为这些胰岛自身抗体在出现临床症状前数月甚至数年前就已出现。尽管该方法可为1型糖尿病的预测提供重要信息，也可应用于研究其他自身免疫性疾病，例如乳糜泻中的转谷氨酰胺酶自身抗体、自身免疫性甲状腺疾病中的TPO和甲状腺球蛋白自身抗体等。我们最初提出该方法的构想，是源于发现该技术具有高灵敏度且不使用放射性物质。与传统的ELISA方法不同，后者在检测任何胰岛自身抗体时效果均不理想。由于采用血清酸处理的胰岛素自身抗体检测方法难以通过文字描述清楚，因此对该方法的可视化演示至关重要。本实验操作将由我实验室的博士后Yong Gu进行演示。首先，将人胰岛自身抗原与生物素或SULFO-TAG按1:1至1:5的摩尔比在离心管中混合。由于这两种标记物均对光敏感，需用铝箔包裹离心管避光。然后在室温下孵育1小时。与此同时，在孵育进行时，用两倍体积的磷酸盐缓冲液预润 spin 柱。然后，以 1,000 × g 离心 2 分钟，重复一次。接着，将自体抗原标签混合物加入 spin 柱中，以 1,000 × g 离心 2 分钟。然后，分装标记的抗原并将其储存在负80摄氏度条件下。接下来，根据棋盘式滴定实验确定生物素SULFO-TAG标记抗原在抗原缓冲液中的合理浓度，每块96孔板制备三毫升抗原溶液。随后，在每个孔中加入四微升血清，并用一倍磷酸盐缓冲液将终体积调至二十微升。然后，向每个孔中加入 20 µL 标记的抗原溶液。用封板膜盖住板孔以避光。随后，将酶标板置于室温摇床中孵育 2 小时。摇床停止后，将酶标板置于4摄氏度冰箱中静置18至24小时。现在，每份样品中加入15微升血清与18微升0.5摩尔乙酸，混匀，并在室温下孵育45分钟。根据棋盘式滴定实验的结果，采用合理的浓度配制生物素SULFO-TAG标记抗原的抗原溶液。然后，向新的 PCR 板的每个孔中分装 35 微升抗原缓冲液。在血清混合物孵育即将结束前，向抗原板的每个孔中各加入 3.8 微升 pH 9 的 1 摩尔 Tris 缓冲液。孵育结束后，迅速将 25 微升经乙酸处理的血清转移至抗原板的每个孔中，并振荡混合溶液。然后，用密封膜覆盖PCR板以避光，并在室温下置于摇床上孵育两小时。孵育结束后，将PCR板转移至4°C冰箱中，继续孵育18至24小时。从4°C冰箱中取出一片链霉亲和素包被板，使其恢复至室温。待链霉亲和素板恢复至室温后，向每个孔中加入150 µL的3%封闭液A，用封口箔覆盖PCR板，并在冰箱中过夜孵育。第二天，将链霉亲和素板从冰箱中取出，弃去孔中的缓冲液。然后，将板倒置放在纸巾上，吸干残留的缓冲液，使其干燥。然后，加入150微升一倍浓度的PBST缓冲液，连续洗涤三次。接着，将30微升血清抗原加入链霉亲和素包被板的每个孔中，并用铝箔覆盖以避光。随后，将板置于室温下振荡孵育一小时。一小时后，弃去板中的血清抗原孵育液，每孔加入150微升一倍浓度的PBST缓冲液，洗涤三次。洗涤结束后，每孔加入150微升读板缓冲液，用于酶标仪读数。在分析任何未知样本之前，每种自身抗体检测的临界值（cutoff）均通过检测约100例1型糖尿病患者和约100名健康对照样本确定。然后，绘制 ROC 曲线以确定 GADA 检测的正常上限最优指数，该指数为 0.023，以获得最佳的灵敏度和特异性。接着，利用基于高阳性、低阳性和阴性对照标准品推导出的方程计算未知样本的结果。随后，绘制图表以确定在有无酸处理的情况下，将胰岛素单克隆抗体与正常人血清孵育后，在胰岛自身抗体检测中获得的信号值。该图显示，在未进行酸处理的情况下，加入正常血清后信号显著被抑制。相反，当血清在与胰岛素单克隆抗体孵育前经过酸处理时，所获得的信号明显更高。同样绘制了另一幅图，用于确定在有或无酸处理条件下使用外籍患者血清所获得的信号。在与抗体孵育之前，用酸处理患者血清，与未经处理的情况相比，可显著增强胰岛自身抗体检测中的信号。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一天内轻松完成数百个样本的检测。在进行该实验时，重要的是要记住对每种自身抗体检测均进行棋盘式滴定实验，以优化检测条件。该技术问世后，为自身免疫性1型糖尿病领域的研究人员提供了预测和预防的新途径。观看本视频后，您应能充分了解该检测方法的操作简便性。请务必注意，处理血清样本可能存在生物安全风险，且具有传染性。进行此操作时，应始终采取预防措施以避免皮肤直接接触。

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