人胰岛自身抗体的电化学发光测定

在这里, 我们提出了检测人胰岛抗体的方法, 使用电化学发光 (ECL) 测定。该协议, 用于预测1型糖尿病, 可以扩大, 以检测自身抗体的其他自身免疫性疾病。

该电化学发光检测的总体目标是检测自身免疫性 1 型糖尿病中的胰岛抗体，具有高灵敏度和高特异性。这种方法可以帮助回答 1 型糖尿病领域的关键问题，例如胰岛自身免疫开始的时间和 1 型糖尿病的高风险预测。与目前的标准放射性测定相比，该技术的主要优点是更敏感、更具疾病特异性和非放射性。

该技术的含义延伸到预测和诊断 1 型糖尿病，因为这些胰岛自身抗体在有症状的临床疾病之前数月至数年出现。虽然这种方法可以深入了解 1 型糖尿病的预测，但它也可以应用于研究其他自身免疫性疾病，例如乳糜泻的谷氨酰胺转氨酶自身抗体、自身免疫性甲状腺疾病的 TPO 和甲状腺球蛋白等。当我们发现该技术基于高灵敏度和非放射性时，我们首先想到了这种方法。

与传统的 ELISA 方法相比，传统的 ELISA 方法不适用于任何胰岛自身抗体检测。这种方法的视觉演示至关重要，因为血清酸处理的胰岛素自身抗体测定很难用文字描述。演示该程序的是我实验室的博士后 Yong Gu。

首先，将人胰岛自身抗原与生物素或 SULFO-TAG 以 1 比 5 的摩尔比混合在试管中。并用铝箔覆盖管子，因为两个标签都是光敏的。然后，在室温下孵育试管 1 小时。

同时，当孵育进行时，用 2 倍磷酸盐缓冲盐水灌注离心柱。然后，以 1， 000 倍重力离心色谱柱，每次离心 2 分钟。接下来，将离心柱中的自身抗原标签混合物以 1， 000 倍重力离心 2 分钟。

然后，分装并将标记的抗原储存在负 80 摄氏度。接下来，使用基于抗原缓冲液棋盘格测定的生物素 SULFO-TAG 标记抗原的合理浓度，每 96 孔板制备 3 毫升抗原溶液。然后，在每个孔中加入 4 微升血清，并用 1 倍磷酸盐缓冲盐水将最终体积调节至 20 微升。

然后，在每个孔中加入 20 μL 标记的抗原溶液。并用密封箔盖住板，防止光照。然后，将板放在摇床上，在室温下转移 2 小时。

摇床停止后，将板子放在 4 摄氏度的冰箱中 18 到 24 小时。现在，将 15 μL 血清与 18 μL 0.5 摩尔乙酸混合，并在室温下孵育 45 分钟。在棋盘格测定的基础上，使用生物素 SULFO-TAG 标记抗原的合理浓度制备抗原溶液。

然后，在新 PCR 板的每个孔中分装 35 μL 抗原缓冲液。在血清混合物的孵育过程完成之前，在 PH 值为 9 时，沿抗原板上每个孔的旁边加入 3.8 微升 1 摩尔 Tris 缓冲液。孵育结束后，在抗原板的每个孔中快速转移 25 μL 经乙酸处理的血清并搅拌溶液。

然后，用密封膜盖住 PCR 板以避免光线照射，并在室温下放在摇床上 2 小时。完成后，将板在 4 摄氏度下放入冰箱中并孵育 18 至 24 小时。从 4 摄氏度的冰箱中取出链霉亲和素板，让板达到室温。

链霉亲和素板达到室温后，在每个孔中加入 150 微升 3% 阻断剂 A，并用密封箔盖住 PCR 板，并在冰箱中孵育过夜。第二天，从冰箱中取出链霉亲和素板，并从孔中排出缓冲液。然后，将板子倒置在一些纸巾上擦干，让剩余的缓冲液浸泡。

然后，加入 150 微升一倍 PBST 缓冲液，连续洗涤 3 次。接下来，转移 30 μL 血清抗原，在链霉亲和素板的每个孔中孵育，并用箔纸盖住板以避免光线。然后，将板放在摇床上，在室温下转移一小时。

1 小时后，弃去血清抗原，从板中孵育，加入 150 微升一倍 PBST 缓冲液，洗涤孔 3 次。洗涤结束后，向每个孔中加入 150 μL 读数缓冲液，以便在读板器上读取。在分析任何未知样品之前，通过测试大约 100 名 1 型糖尿病患者和大约 100 名健康对照者来确定每种自身抗体检测的检测临界值。

然后，绘制 ROC 曲线以确定 GADA 测定的最佳正常上限指数 0.023，从而获得最佳的敏感性和特异性。然后，使用从高阳性、低阳性和阴性对照标准推导出的方程计算未知样品的结果。接下来，绘制一张图表以确定在存在和不存在酸处理的情况下，胰岛自体抗体与正常人血清孵育时获得的信号。

该图显示，在没有酸处理的情况下，加入正常血清后信号明显受阻。相反，当血清在与胰岛素单克隆抗体孵育之前进行酸处理时，获得的信号相对较高。还绘制了类似的图表，以确定在存在和不存在酸处理的情况下使用外国患者血清获得的信号。

与在没有处理的情况下相比，在与抗体孵育之前用酸处理患者血清显着增加了胰岛自身抗体测定的信号。一旦掌握，如果准备得当，这项技术可以在一天内轻松完成数百个样品。在尝试此程序时，请务必记住对每种自身抗体检测进行棋盘检测，以优化检测条件。

经过开发，这项技术为自身免疫性 1 型糖尿病领域的研究人员铺平了预测和预防的道路。观看此视频后，您应该对如何轻松进行此分析有一个很好的了解。不要忘记，处理血清样品可能具有危险性和传染性。

执行此程序时应始终采取预防措施，避免皮肤直接接触。