Name: 基于 Pin 离散壁的可重构微流控通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习基于针阵列侧壁的可重构微流控装置制造方法，使用不锈钢针、PDMS和硅酮粘合剂进行刻蚀与组装。该技术通过可调节侧壁实现增强的流动控制，适用于处理未知流动条件下的难流动对象。

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本研究由KAKENHI（20800048、23700543）资助。

1. 针脚蚀刻（图2A）
<ol>
	<li>将矩形针浸入丙酮中以去除油脂。</li>
	<li>将针浸入4 mL 10%硝酸中进行钝化处理，然后将溶液置于65 °C烘箱中加热30分钟。</li>
	<li>将针在去离子水中超声处理5分钟以去除残留酸液，并用纸巾擦干。将针浸入0.5 mL脱模剂中2小时。再将针在去离子水中超声处理5分钟。</li>
	<li>制备刻蚀槽（图2C）。
	<ol>
		<li>使用直尺在玻璃载片上绘制或刻划两条间距为4 mm的平行线。</li>
		<li>在两片矩形切割盖玻片的一个表面涂覆耐化学腐蚀且低粘度的粘合剂。</li>
		<li>将两片切割后的盖玻片以4 mm间距粘合在玻璃载片上，以平行线作为对齐参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在刻蚀槽上挤出两条硅胶粘合剂（位置和轮廓尺寸见图2C）。 
	注意：使用3D打印模板（STL模型文件作为补充材料提供）可帮助更轻松、准确地绘制线条。</li>
	<li>将针放置在刻蚀槽上，使其直端2 mm长的尖端浸入粘合剂线条图案中。再次挤出粘合剂，确保针完全被覆盖并形成轮廓。将刻蚀槽转移至38 °C的加湿发酵箱中。&#160;静置过夜以固化粘合剂。</li>
	<li>在玻璃小瓶中，缓慢将0.2 mL 0.5 M硝酸加入0.2 mL 5.0 M盐酸中。 
	警告：该混合液又称王水，具有极强腐蚀性，可能爆炸。操作酸液时必须佩戴耐酸橡胶手套和护目镜，并极度谨慎。切勿储存该溶液。尽可能减少硝酸用量以降低其反应剧烈程度。</li>
	<li>将刻蚀槽置于65 °C加热板上。向针未被覆盖的区域倾倒0.4 mL酸混合液。等待10分钟后，将酸液转移至烧杯中。</li>
	<li>用5 mL 0.8 M碳酸氢钠水溶液中和所有残留酸液，包括针的刻蚀区域。</li>
	<li>用镊子沿纵向从刻蚀槽中取出针。将针在去离子水中超声处理5分钟，随后在丙酮中超声处理5分钟。</li>
	<li>对针的刻蚀区域进行钝化处理，操作同步骤1.2。</li>
	<li>使用带刻度目镜的车间显微镜检测刻蚀后针的宽度。根据1.7步骤所述调整刻蚀时间，使刻蚀区域宽度达到0.2 ± 0.02 mm。</li>
	<li>将针转移至含有5 mL 70%乙醇的玻璃小瓶中。将小瓶移至层流罩内。用工具从瓶中取出针，使其自然干燥。</li>
</ol>
2. 制备带有储液池和插针空间的硅胶板。
<ol>
	<li>通过典型的光刻工艺制备用于插针空间和固定侧壁的模具。
	<ol>
		<li>使用转速为1,000 rpm的旋涂仪，在脱脂的玻璃片上涂覆1 mL负性环氧系光刻胶。在95 °C的热板上干燥光刻胶15分钟。重复此步骤一次。</li>
		<li>在已涂覆光刻胶的玻璃片上，以2,000 rpm的转速旋涂第三层相同的光刻胶。在95 °C热板上干燥光刻胶30分钟。</li>
		<li>通过光绘薄膜，使用紫外点光源对光刻胶层曝光，紫外光波长为365 nm，能量为450 mJ/cm2。将曝光后的光刻胶在95 °C热板上烘烤15分钟。使用手动喷雾器喷洒显影溶剂（2-甲氧基-1-甲基乙基乙酸酯）进行显影，并用氮气吹干。</li>
		<li>将带有图案化光刻胶的玻璃片置于塑料培养皿底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物浇注到模具上，厚度约为3 mm。在-800 kPa的真空干燥器中脱泡10分钟。</li>
	<li>将PDMS预聚物在65 °C烘箱中固化1小时。使用解剖刀将部分固化的PDMS块从模具中取出。再将PDMS在120 °C烘箱中完全固化1小时。</li>
	<li>沿引导图案，使用同一把解剖刀修整PDMS块的不规则边缘。应尽可能进行精确且干净的切割，特别是在定义插针插入槽的表面（见图1A）。</li>
	<li>使用活检打孔器在PDMS块主通道的两端打直径为2 mm的进样/出样孔。同样地，在排气通道的两端打直径为1 mm的孔。通道布局及这些孔的位置参见图1A。</li>
</ol>
3. 原位制备间隙填充物和屏障的装置组装。
<ol>
	<li>制备微通道组件。
	<ol>
		<li>将一块10 × 20 mm的4号盖玻片浸入预热至60 °C的清洗液中，持续10分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗盖玻片两次，并在120 °C下干燥10分钟。</li>
		<li>将PDMS平板与盖玻片进行等离子体键合：
		<ol>
			<li>将PDMS平板（微通道面朝上）和已清洗的10 × 20 mm No. 4盖玻片放入溅射镀膜仪的真空腔室中。</li>
			<li>将腔室抽真空至60 Pa。产生空气真空等离子体（20 mA）30秒。</li>
			<li>立即释放腔室压力。将PDMS切片的通道特征面与盖玻片对齐边缘后进行键合。</li>
			<li>将已粘合的层置于65 °C烘箱中10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将已粘合的层置于无菌容器中，转移至超净工作台，用紫外光照射30分钟进行灭菌。</li>
		<li>在超净工作台中，将针插入槽内，使其末端构成微通道的另一侧壁。相邻的针长度应不同，以避免两个垂直端接触（参见 图1B）。垂直端之间的间距较大为宜。间距为（N-1）×（针宽）是可能的当 N 不同针长的针具种类（L 在 图2A) 进行制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备基底（ 图2B).
	<ol>
		<li>使用CAD/CAM软件创建或读取基座的零件文件，并生成两个数控（NC）文件（包含刀具路径；作为补充材料提供）。第一个补充NC文件使用直径为4 mm的立铣刀，第二个使用直径为1 mm的立铣刀。</li>
		<li>将一块3 mm厚的透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板固定在数控铣床上。</li>
		<li>在计算机数控（CNC）铣床控制器上打开第一个NC文件。将直径4 mm的立铣刀安装至CNC铣床，并通过将铣刀接触PMMA板确定工件零点。运行NC代码以切割板材。 
		注意：偶尔使用压缩空气吹扫立铣刀尖端，以进行冷却和清除切屑。</li>
		<li>使用第二个NC文件和直径1 mm的端铣刀重复步骤3.2.3。</li>
		<li>用洗涤剂对加工零件进行脱脂，并用纸巾擦干。用70%乙醇喷洒零件，然后将其转移至超净工作台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备针隙填充物和弹性屏障： 
	&#8203;注意：步骤 3.3.1 至 3.3.7 应在层流罩内无菌操作条件下进行。
	<ol>
		<li>按2:1的质量比将白凡士林与聚四氟乙烯粉末混合，制备填隙材料。使用超声波均质器将混合物均质化。</li>
		<li>将缝隙填充剂倒入分配器注射器中，插入推杆并推动以填满注射器尖端。安装针头后再次推动推杆，直至针头尖端充满填充剂。同样地，准备另一支带有推杆和针头的分配器注射器，并用硅酮粘合剂填充。</li>
		<li>使用接头管将每个注射器连接至气动点胶机。调节硅酮粘合剂和填料的点胶压力，分别为 250 kPa 和 280 kPa。</li>
		<li>在基底的口袋边缘涂布硅胶粘合剂。将一块10 × 20 mm的4号盖玻片置于口袋上，并用力按压以使其牢固粘合。</li>
		<li>在基底的两个外侧槽内，沿槽施加约1 mm深的硅胶粘合剂，形成两段。在另一个槽内，沿槽施加约1 mm深的间隙填充剂，形成段状。</li>
		<li>在另一个口袋的边缘涂布硅胶粘合剂。将微通道组件（3.1）放置于该口袋上，并用力按压以确保牢固粘合。</li>
		<li>重复步骤 3.3.5，以确保间隙填充剂和硅酮粘合剂完全包埋针脚，且槽口处无任何开口。</li>
		<li>将装置放入无菌容器中，例如带盖的不锈钢盒。将容器转移至预热至38 °C的加湿发酵罐中。在超净工作台中固化&#160;弹性屏障放置一天。</li>
		<li>将每根针沿相邻的针向上移动最多1毫米，以使针从固化的弹性屏障中脱出。</li>
		<li>使用紫外光对设备进行30分钟的灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 微流控装置的评估
<ol>
	<li>使用荧光检测泄漏
	<ol>
		<li>使用精细工具或台式机器人打开微通道。尽量使通道宽度在整个通道中保持一致。</li>
		<li>将绿色荧光染料用去离子水稀释至10 µM，配制荧光溶液。</li>
		<li>用微量移液器将荧光溶液加入微通道的一端端口。此步骤将使溶液充满通道。</li>
		<li>将微流控装置和两片用去离子水润湿的吸水纸放入一个大型塑料培养皿中。在37 °C、5% CO2条件下孵育至少24小时。</li>
		<li>使用倒置荧光显微镜和显微镜相机记录微通道的绿色荧光图像。</li>
		<li>使用适当的图像分析软件打开荧光图像，并确认在填充间隙材料与针脚的界面处无泄漏（无绿色荧光）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至微通道。
	<ol>
		<li>准备一个含有70–80%汇合度细胞的细胞培养容器（根据细胞类型而定）。将细胞从培养表面解离并重悬于生长培养基中。</li>
		<li>离心细胞（转速和时间取决于细胞类型），并吸除上清液。</li>
		<li>用少量培养基重悬细胞。使用细胞计数仪计数细胞，并将细胞密度调整为1.5 × 106 至 1.5 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>使用精细工具或台式机器人打开微通道（图1B），形成一条宽度为400 µm的直线通道。调整针脚位置，使通道侧壁尽可能平整。将细胞悬液加入微通道的一端端口，并充满通道。</li>
		<li>定位定义培养区域侧壁的其中一个针脚。在倒置显微镜下，闭合两个相邻针脚，将细胞封闭在细胞培养区域内。</li>
		<li>从内向外依次闭合所有针脚，以排出通道中所有细胞。轻轻从端口吸除悬液，并向其中加入培养基。</li>
		<li>按照步骤4.1.4所述条件孵育装置。当细胞汇合度达到约70–80%时，缓慢打开一个针脚以扩大培养区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

针式离散微通道是一种功能完备的微流控通道，我们认为，与任何现有的微流控通道相比，它在通道形状上具有明显更高的可重构性。我们提供的这一方案将能够实现具备细胞培养功能的微流控装置，并通过逐步扩大的细胞培养表面积，使细胞培养长时间维持在汇合状态。该装置还可在无需预先在基底上图案化蛋白质、也无需在设计或制造阶段进行其他考虑的情况下，实现通道内的细胞图案化。此外，这种可重构的微流控装置能够轻松产生强烈的通道内位移流，有助于处理那些极少数现有微流控装置难以操控的难流动材料。这意味着，在无需对装置设计进行重大修改的情况下，即可利用该装置评估细胞与其他微生物、气体以及其他非流体物质之间的相互作用。
我们曾考虑将拉普拉斯压力或静水压力施加于通道的一个入口，作为外部流体控制方法。我们不建议在盲端推动液体，因为这会导致液体通过针与通道顶板/底板之间的间隙流向通气通道。许多流体操作并不需要此类针的操作。例如，混合可通过单根针搅拌液体来实现即， 仅移动一根针，前后往复数次）。
该装置最关键的部件是针。针的长度、平行度、垂直度和表面质量必须精确，因为它们需要形成微通道，能够平稳移动，并引导相邻针的运动。因此，我们建议向专注于精密加工的公司订购针，并提交类似于图2A的图纸。某些公司可能要求提供额外的几何尺寸标注以及明确的表面粗糙度要求。然而，只要小心操作，并定期用硝酸进行钝化处理，这些针便可重复使用。
弹性屏障是另一个关键特征，其形成是器件制备过程中最关键的步骤。需要使用精密加工的基底才能获得可重复且可靠的结果。将插针放置在未固化的屏障材料上也是一个关键步骤。插针应保持良好对齐，并嵌入间隙填充材料和屏障中，且不能含有气泡。这些步骤可防止液体从插针处泄漏，而泄漏是此类微流控器件中的常见问题。
使用该装置的其他常见问题包括：a）针脚因摩擦受阻，以及 b）细胞死亡和生长速率低。导致 a）的可能原因包括针脚中部刻蚀不均匀（呈锥形或波浪形）、刻蚀表面质量差，以及针尖高度与用于硅胶板模具的光刻胶层高度之间存在尺寸不匹配。调整刻蚀液配方、温度和搅拌条件可能有助于改善针脚的移动性能。此外，在不使用蜡或粘合剂的情况下进行试装，可为解决问题提供线索。导致 b）的可能因素包括针脚钝化不充分、弹性屏障所用粘合剂选择错误，以及粘合剂固化不完全。某些细胞可能需要在微通道内壁涂覆纤连蛋白或其他促进细胞黏附的蛋白质或聚合物。此外，优化细胞培养操作，如胰酶消化和离心步骤，可减少微通道中的死细胞数量。
本制备方案的一个局限性在于，仅有一侧侧壁实现了离散化。如果两侧侧壁均采用针阵列构建，则通道的可重构性将进一步提升。尽管这需要双倍数量的针以及更长的制备步骤，但从技术上讲是可行的选项。

微流控装置是一类能够控制微量液体及其流动的微型设备，可将生物医学实验流程微型化，集成到&#34;芯片&#34;中，从而提高便携性，且通常更具成本效益。正如近期一篇综述所述1，目前已开发出多种由空腔和凸起结构组成的微流控元件，以实现混合、分离、颗粒捕获或反应等基本且关键的流体功能。
尽管许多微流控装置的行为在设计阶段即已确定，但某些类型的微流控装置允许在制造完成后对其结构或行为进行调整。我们将这一特性称为 &#34;可重构性&#34;微流控系统的可重构性通常能够减少设计设备所需的时间和成本，和/或实现微流控结构或功能随时间的定制化调整。
此前报道的可重构微流控装置可分为以下三类。第一类通过弹性体通道的形变，在使用过程中改变流速和流向。为了实现可重构性，弹性体通道通过多种外部可控力发生形变，例如气压源2、盲文致动器3或压缩密封4。第二类依赖于模块化设计，例如多层流体回路、带有磁性连接结构的模块化通道以及基于管路的微流控系统5。第三类装置本身不可重构，但基于电极阵列的微液滴操控（通常称为数字微流控）6,7和基于悬滴的微流控装置8能够按需切换流体的流动状态或流动路径。
然而，许多此类重构仅限于拓扑结构和宏观层面。例如，许多集成的微流控装置通过在预设区域坍塌微通道来停止流体流动或改变流动方向。然而，这些可坍塌区域的位置和数量无法重新配置。尽管数字微流控技术具有多种流体操控能力，但其可能实现的流体操作在很大程度上受限于每个液滴的体积。此外，当细胞在含有细胞培养基的液滴中培养时，还需额外努力以防止液滴中的蒸发和气体扩散，避免渗透压冲击和pH值的突然变化。
为了实现通道特征层面的可重构性，我们提出了一种具有可移动侧壁的微流控装置，该装置由一系列机械元件阵列构成，可在使用过程中动态地重新配置侧壁结构9。为了形成可变形的侧壁，将多个小型矩形针状结构依次排列，使得每根针的端点共同定义侧壁的一个线段。通过滑动这些针状结构，可实现侧壁的形变，从而在通道内部实现细胞、气泡和颗粒的运输或图案化。为了最小化死体积并最大化可重构性，相邻针状结构之间的间距必须尽可能小。然而，当微通道内外通过针间微小间隙连通时，强烈的毛细作用会导致任何进入针间隙的液体发生泄漏，进而引起培养基蒸发、细菌或细胞毒性污染，最终导致细胞死亡。因此，我们开发出一种无泄漏的离散式侧壁型可重构微流控通道，能够耐受反复的针状结构运动操作，并支持长期的细胞培养10。
本文提供了一种构建具有可重构离散侧壁的微流控细胞培养装置的方案，该侧壁可随细胞培养面积的逐步增加而重新配置。采用荧光成像技术检测离散通道侧壁的密封性。通过片上细胞培养实验评估该装置的细胞培养兼容性及细胞图案化能力。
当无法预先确定合适的通道设计，而必须根据需求进行更改时，该微流控系统尤为适用。例如，该系统可用于根据细胞生长或迁移情况调节通道宽度和流速，操控或捕获在通道中行为不可预期的活性线虫或其他微小物体，或接收在设计时尚未考虑到的各种原始样品或生物产品。

<table><tbody><tr><td>烘箱</td><td>Yonezawa</td><td>MI-100</td><td></td></tr><tr><td>10% 硝酸</td><td>Wako Chemicals</td><td>149-06845</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢针</td><td>Micro Giken</td><td>N/A</td><td>0.3 mm 横截面，316L 级不锈钢，线切割放电加工</td></tr><tr><td>脱模剂</td><td>Fluoro Technology</td><td>FG-5093SH</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Shin-Etsu Chemicals</td><td>KE-106</td><td></td></tr><tr><td>负性环氧光刻胶</td><td>Nippon Kayaku</td><td>SU-8 3050</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（矩形）</td><td>Matsunami Glass</td><td>26 x 60mm No.4</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Kanto Chemicals</td><td>01060-79</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（大尺寸）</td><td>Matsunami Glass</td><td>76 x 52mm No.1</td><td></td></tr><tr><td>硅胶粘合剂</td><td>Shin-Etsu Chemicals</td><td>KE-41</td><td></td></tr><tr><td>白色凡士林</td><td>Nikko Rica</td><td>Sun White P-1</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）粉末</td><td>Power House Accele</td><td>Microfluon II</td><td></td></tr><tr><td>透明丙烯酸板（3 mm 厚）</td><td>Various</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>气动点胶机</td><td>Musashi Engineering</td><td>ML-5000XII</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Kanto Chemicals</td><td>180768-00</td><td></td></tr><tr><td>计算机数控（CNC）铣床</td><td>Pro Spec Tools</td><td>PSF240-CNC</td><td></td></tr><tr><td>端铣刀（4 mm 直径）</td><td>Mitsubishi Materials</td><td>MS2MSD0400</td><td></td></tr><tr><td>端铣刀（1 mm 直径）</td><td>Mitsubishi Materials</td><td>MS2MSD0100</td><td></td></tr><tr><td>粘合剂（耐化学腐蚀且低粘度）</td><td>Cotronics</td><td>Duralco 4460</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃小瓶</td><td>Various</td><td></td><td>用于配制 HNO₃+HCl 溶液（王水）。务必选用硼硅酸盐玻璃。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Kanto Chemicals</td><td>37116-00</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>AS ONE</td><td>AS12GTU</td><td></td></tr><tr><td>超声波钻孔机</td><td>Shinoda Tools</td><td>SOM-121</td><td>用作超声波均质器。</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Active</td><td>ACT-220DII</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>AS ONE</td><td>ND-1</td><td></td></tr><tr><td>光绘胶片（12,700 dpi）</td><td>Unno Giken</td><td>N/A</td><td>绘制 PDMS 块底部凹槽的负像。</td></tr><tr><td>2-甲氧基-1-甲基乙基乙酸酯</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-10505</td><td></td></tr><tr><td>紫外点光源</td><td>Hamamatsu</td><td>L8327</td><td>紫外光源</td></tr><tr><td>氮气</td><td>Various</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器及泵</td><td>AS ONE</td><td>MVD-100, GM-20S</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Various</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器（1.0 mm 和 2.0 mm）</td><td>Kai Medical</td><td>BP-10F(1.0mm), BP-20F(2.0mm)</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刻划笔</td><td>Various</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>清洗液</td><td>Tama Chemicals</td><td>TMSC</td><td>用去离子水按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>San-yu Electron</td><td>SC-708</td><td>用于等离子体键合。</td></tr><tr><td>点胶注射器（5 ml）</td><td>Musashi Engineering</td><td>PSY-5E</td><td></td></tr><tr><td>推杆</td><td>Musashi Engineering</td><td>FLP-5E</td><td></td></tr><tr><td>钝头针（21G）</td><td>Musashi Engineering</td><td>PN-21G-B</td><td></td></tr><tr><td>连接管</td><td>Musashi Engineering</td><td>AT-5E</td><td></td></tr><tr><td>发酵罐</td><td>Japan Kneader</td><td>PF100</td><td></td></tr><tr><td>绿色荧光染料（Alexa Fluor 488 羧酸）</td><td>Thermo Fisher</td><td>A33077</td><td></td></tr><tr><td>大号塑料培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸</td><td>Asahi Kasei</td><td>BEMCOT M-1</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>GE Health Care</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GE Health Care</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S1820</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>FPI</td><td>OC-C-S02</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养容器</td><td>VIOLAMO</td><td>VTC-D100</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>车间显微镜</td><td>PEAK</td><td>2034-20</td><td></td></tr><tr><td>手持喷雾器</td><td>FURUPLA</td><td>No.3530</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（矩形）</td><td>Matsunami Glass</td><td>10 x 20mm No.4</td><td></td></tr><tr><td>CAD/CAM 软件</td><td>Autodesk</td><td>Inventor HSM</td><td></td></tr><tr><td>氮气压力调节器</td><td>AS ONE</td><td>GF1-2506-RN-V</td><td>设定为 0.1 MPa</td></tr></tbody></table>

具有离散化销钉侧壁的可重构微流控通道

Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls

微流控组件需要具备多种形状，以实现混合、分离、颗粒捕获或反应等不同的关键微流控功能。一种在制造后仍可变形但保持通道形状的微流控通道，能够实现高的时空可重构性。这种可重构性对于现有“可重构”或“集成式”微流控系统中难以实现的关键微流控功能至关重要。本文描述了一种具有可变形侧壁的微流控通道的制备方法，其侧壁由一系列矩形针末端横向排列组成。通过沿针的纵向驱动这些针，可改变针端的位置，从而改变离散化通道侧壁的形状。针之间的间隙可能导致不必要的泄漏，或因弯月面力引起相邻针之间的粘附。为封闭针间隙，我们引入了基于烃类-氟聚合物悬浮液的间隙填充材料，并配合使用弹性屏障。这种可重构微流控装置可在通道内按需产生较强的时变位移流，或在通道任意区域停止流动。该特性将便于在需要时对细胞、高粘性液体、气泡以及非流体物质进行操控，即使这些物质在器件制造时其存在或行为尚不明确。

可重构微通道的构建如图1所示。多个矩形销钉被放置在玻璃基底上，并排列成其长边相互接触。一张带有打孔和与销钉高度相同深度凹槽的PDMS片覆盖在销钉末端，形成通道的入口/出口储液池、通道顶壁，以及与由销钉构成的通道侧壁相对的另一侧壁。由销钉、一个壁面（PDMS片的一个面）和玻璃基底所包围的区域构成一个微流控通道。
如前所述，所提出的微流控系统的可重构性是通过大量平行排列的小针实现的，这些小针之间具有非常微小但非零的间隙。此前报道中存在的问题是毛细效应通过这些间隙产生强烈的流动。为解决这一问题，首先使用间隙填充材料将间隙填满。在本方案中，采用了一种由高粘性碳氢化合物和氟聚合物粉末组成的分散混合物作为间隙填充材料。然而，该间隙填充材料本身也会受到毛细效应的影响。因此，如图1所示，最终形成的可重构微通道既包含碳氢化合物/氟聚合物间隙填充材料，又在间隙填充材料的外周形成了一层弹性体屏障。为了容纳足够量的间隙填充材料，从而确保两根针之间弹性体屏障的厚度和强度，需要将针的中部变细。
图2A 展示了用于形成侧壁段的针的示意图。选择316L级不锈钢作为材料，因其具有耐腐蚀性和低溶出特性。然而，需要额外的钝化处理，以使针适用于细胞培养。针的尖端必须为精确的矩形且无毛刺，才能成功形成侧壁段。此外，针必须带有“手柄”，以便通过推动手柄轻松移动针。由于每根针中间较窄，针之间的弹性体厚度足以承受针移动引起的剪切力。与其他构成装置的部件不同，针的加工（除中间变细部分外）应交由专精于电火花加工（EDM）的公司完成，因为这是加工硬质金属小型零件最精确且最具成本效益的方法之一。自行通过蚀刻完成中间变细部分，可降低加工成本，并减少加工过程中弯曲或断裂的风险。
为了确认填充间隙材料、弹性屏障以及可重构微通道的密封性是否正常发挥作用，采用荧光法进行泄漏检测。图3展示了在微通道中注入含荧光示踪染料的水后第3天，弹性屏障边缘附近区域的荧光图像。荧光图像显示，填充通道的液体仅到达弹性屏障可见边缘约200 µm深度处。然而，液体并未到达填充间隙材料。此外，未观察到填充间隙材料穿过弹性屏障发生泄漏。该结果表明，针脚狭窄中部与弹性屏障之间的紧密贴合有效阻止了液体通过间隙迁移。
最后，我们通过逐步扩展可重构微流控装置的侧壁以适应培养区域，进行了长期细胞培养，如图4A所示。在第0天，少量细胞被限制在等于一个针宽的空间内，其余细胞被吸除。在第2天，细胞已贴附于底部表面并开始增殖。此时收回两根针，使所有细胞清晰可见，尽管汇合度仍然较低。在第5天，细胞继续增殖，汇合度增加。在第6天和第9天，再收回另外两根针，以保持细胞处于未完全汇合状态。图4B展示了培养区域逐步扩展的效果。在针收回当天，细胞密度出现突然变化。然而，细胞数量的增长速率保持恒定，而典型细胞培养中的增长速率则呈指数增长。
<img alt="微通道组装与机器人装置示意图；PDMS储液池，PMMA基底，插针，自动化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：具有一个针脚离散侧壁的可重构微流控装置。(A) 可重构微流控装置的部件与结构。该装置包含一条直通道，其一侧侧壁由插入PDMS/玻璃微通道结构中的10根不锈钢针的端部构成。间隙填充物和弹性屏障可防止液体从针间隙泄漏。盖玻片、间隙填充物和弹性屏障均固定于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基底上。(B) 自动化针脚操纵器。由金属片制成的末端执行器固定在三轴台式机器人上。为移动一根针脚，末端执行器推动其垂直端部。不同长度的针脚以三倍针宽的间距排列，该间距确保末端执行器每次仅与一根针脚啮合，并留有足够间隙。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡与蚀刻过程示意图，包含尺寸、玻璃片和硅胶装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：本实验方案中所用加工部件的机械设计图。单位为毫米；R 表示半径尺寸；方块符号（□）表示方形特征；t 表示厚度。（A） 作为侧壁组成部分的316L不锈钢销钉。该销钉可按描述进行订购和加工。销钉中部变细形成类似哑铃形状的结构未在本图中体现，因为该步骤并非加工时直接完成，而是作为本实验方案的一部分后续操作。（B） 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基底，用于固定盖玻片、间隙填充物和弹性屏障，防止其受销钉移动影响。（C） 用于蚀刻销钉中部的蚀刻皿。制作蚀刻皿时，使用硅胶粘合剂将四块玻璃片粘接在一起。在皿上绘制硅胶粘合剂的轮廓图案，然后如图所示将销钉放置于皿中。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控针阵列示意图；弹性体屏障、间隙填充物、300 µm 比例尺、实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过针间隙检测可重构微通道泄漏的荧光成像。 填充可重构微通道的绿色荧光染料的荧光图像叠加在密封结构的相差图像上，该结构由间隙填充物（不透明）和弹性体屏障（半透明）组成。弹性体屏障的边缘以类似弯月面的特征可见，并由上方虚线标示；弹性体屏障与间隙填充物之间的界面表现为接触黑色区域的类似弯月面的特征，由下方虚线指示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移过程；9天内的细胞生长（显微镜图像）及密度随时间变化的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：在可重构微通道中，细胞培养面积可变条件下的渐进且持续的细胞生长。（A）在由可移动侧壁限定的细胞培养区域内，COS-7细胞的生长情况。（B）在可重构微通道中不同大小培养区域（如A图所示）内COS-7细胞的生长曲线及其密度随时间的变化。三条垂直箭头分别表示在第2、5和6天时细胞培养区域的扩展。除细胞数量外，还展示了相同培养区域的细胞密度，分别对每条指数生长曲线进行拟合，并用于估算各图框中所示的局部倍增时间（td [h]）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

具有可变形侧壁的微流控通道可在使用过程中实现流量控制、颗粒操控、通道尺寸定制及其他可重构功能。本文描述了一种制备微流控通道的方法，其侧壁由一组针状结构阵列构成，可实现侧壁形状的改变。

微流控组件需要具有各种不同的形状，以实现混合、分离、颗粒捕获等不同的关键微流控功能，或……

本实验的总体目标是制备一种侧壁由针阵列构成的可重构微流控装置。该微流控装置的主要优势在于能够应对在通道设计阶段未知的、难以流动的物体或情况。通常，初次接触该方法的研究人员在将微小针体蚀刻成哑铃形状时会遇到困难。该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过书面方案很难学会如何组装众多的微流控部件并将它们安装到底座上。此照片展示的是带有可重构通道的完整微流控装置。其中，可重构部分位于图像顶部。爆炸图示意图展示了一些主要组件。特别注意用于重新配置的微通道和插针。第一步，先蚀刻插针。从不同长度的去脂、厚0.3毫米、L形不锈钢针开始。准备好4毫升10%硝酸，将针浸入其中。然后将容器置于65°C的烘箱中30分钟。取出针后，用镊子将它们逐个转移至盛有去离子水的容器中。接着，在水中超声处理五分钟。完成后，用纸巾将针擦干。准备好 0.5 毫升脱模剂，将针浸入其中。两小时后，将针放入去离子水中，超声处理五分钟。后续操作需要使用蚀刻皿。刻蚀皿由玻璃和硅胶粘合剂制成。开始刻蚀过程时，在皿中分配用于固定针端的硅胶粘合剂。放置针件，使其直端的尖端浸入粘合剂中。这是在所有针脚就位并准备好进行下一步时的培养皿状态。将蚀刻培养皿转移至已加热至 38 摄氏度的加湿发酵罐中，静置过夜以固化粘合剂。当固化完成后，将带有针脚的蚀刻培养皿放置于 65 摄氏度的加热板上。将0.8毫升蚀刻酸倒入引脚的未覆盖区域。10分钟后，使用微量移液器将酸转移至烧杯中。然后向培养皿中添加更多蚀刻酸，以重复蚀刻步骤。蚀刻后，检查蚀刻区域的宽度是否约为 0.2 毫米。若是，则用微量移液器吸取五毫升碳酸氢钠溶液滴加到蚀刻皿中，以中和残留的酸。接着，用镊子沿纵向拉动取出固定用的针。从一个制备好的模具开始。如本示意图所示，该模具用于制作具有固定侧壁和插针空间的装置。使用光刻技术在玻璃载片上制作该模具。将制备好的载玻片置于塑料培养皿底部。随后，将PDMS预聚物倒入模具中，厚度为三毫米。将培养皿放入真空干燥器中抽真空10分钟。之后，将其转移至65°C的烘箱中加热一小时。得到部分固化的板状物。使用解剖刀脱模，用于后续步骤。将平板放入120摄氏度的烤箱中加热一小时，使其完全固化。现在使用已完全固化的平板，其边缘会沿着引导线图案呈现不规则形状。使用手术刀精确且整齐地修剪不规则边缘。特别注意用于插入针头的表面，以制作出最佳装置。使用活检打孔器在主腔室的入口/出口及其他位置打孔。现在，制备一个微通道装置。将清洗液加热至60摄氏度，并取一片4号盖玻片。该盖玻片尺寸为10毫米×20毫米。将盖玻片浸入溶液中10分钟。将清洗并干燥后的盖玻片与PDMS薄片放置于溅射镀膜仪的下电极上。产生空气真空等离子体30秒。将取出的部件粘合，使边缘对齐，并确保通过盖玻片能够观察到通道结构。使用无菌容器将粘合后的层转移至层流罩中进行灭菌。完成后，将针插入插槽中。相邻的针脚应具有不同的长度。这些针脚构成了微腔的另一侧壁。继续在层流罩内操作。进行下一步操作前，需准备好设备的基底。通过匀浆白色凡士林与聚四氟乙烯粉末的混合物来制备填充间隙材料。将匀浆后的混合物倒入分配用注射器中，并插入活塞。推动活塞以填充注射器尖端。然后安装针头，并推动活塞直至针头充满。以相同方式准备另一支含有机硅粘合剂的注射器，并将两支注射器分别连接至气动点胶装置。现在，将硅胶粘合剂涂布于基底上，沿其中一个腔室涂抹。然后，将一块4号盖玻片放置在腔室上，并用力按压使其牢固粘合。接下来，沿底座的两个外侧槽口挤出硅胶粘合剂，形成约一毫米深的条段。沿中间的另一槽口挤出填缝剂，形成一毫米深的条段。在另一个口袋的边缘处多加一些粘合剂。将微通道组件放置于凹槽中，并用力按压。再次在底座中部的槽内填入间隙填充材料，随后在相邻的槽内涂上粘合剂。将装置在无菌操作台中静置一天。固化后，在层流操作台内，将每根针沿其相邻的针向上移动一毫米，以使其从弹性屏障中释放。通过在去离子水中稀释绿色荧光染料，建立荧光渗漏测试。然后，打开微通道，使其在整个长度上保持一致的宽度。使用微量移液器将染料转移至微通道的一端入口，并用溶液将其充满。在一个大型塑料培养皿中，放入两张用去离子水浸湿的吸水纸，并将装置置于其中。将培养皿置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度下孵育至少24小时。使用倒置荧光显微镜观察回收的装置，并记录图像。利用这些图像确认针周围无泄漏。这些图像显示了一个渗漏样本和一个不渗漏样本。另一项测试涉及细胞接种。打开微通道，形成一个宽度为400微米的直通道，并尽可能使侧壁在整个长度上保持平整。将细胞悬液加入一端的端口以充满通道。找到用于界定细胞培养区域侧壁的针状结构，并将其关闭，以将细胞封闭在该区域内。从靠近该区域的位置开始，依次关闭所有针状结构，以排出通道中的细胞。从末端端口吸出悬液后，加入培养基。将装置置于含有湿润吸水纸的塑料容器中，在37°C、5% CO₂条件下孵育至少24小时。观察封闭区域内细胞数量约为每平方英寸10个细胞。然后缓慢回撤针头以扩大培养区域。这些图像是在可重构微通道中培养的COS-7细胞。在九天的过程中，微通道培养区域不断扩大。所收集的数据可用于绘制细胞数量和密度随时间变化的曲线图。蓝色点和拟合曲线代表细胞数量。红色符号和拟合曲线代表密度。对于密度，垂直箭头表示在第2、5和6天细胞培养区域的扩展。密度的计算基于相同的培养区域。观看本视频后，您应该能够充分掌握如何利用细小的针脚制作出无泄漏的微流控通道侧壁。一旦熟练掌握，只要操作得当，该技术可在一周内完成。在尝试此操作过程中，仔细而全面地完成方案中的每一个步骤至关重要。请务必注意，操作强酸具有极高的危险性，必须采取预防措施，例如准备足量的中和剂。在完成这些步骤后，可引入其他含液体的细胞，以建立更为复杂的细胞培养体系。

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