具有离散化销钉侧壁的可重构微流控通道

本实验的总体目标是制备一种侧壁由针阵列构成的可重构微流控装置。该微流控装置的主要优势在于能够应对在通道设计阶段未知的、难以流动的物体或情况。通常，初次接触该方法的研究人员在将微小针体蚀刻成哑铃形状时会遇到困难。

该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过书面方案很难学会如何组装众多的微流控部件并将它们安装到底座上。此照片展示的是带有可重构通道的完整微流控装置。其中，可重构部分位于图像顶部。

爆炸图示意图展示了一些主要组件。特别注意用于重新配置的微通道和插针。第一步，先蚀刻插针。

从不同长度的去脂、厚0.3毫米、L形不锈钢针开始。准备好4毫升10%硝酸，将针浸入其中。然后将容器置于65°C的烘箱中30分钟。

取出针后，用镊子将它们逐个转移至盛有去离子水的容器中。接着，在水中超声处理五分钟。完成后，用纸巾将针擦干。

准备好 0.5 毫升脱模剂，将针浸入其中。两小时后，将针放入去离子水中，超声处理五分钟。后续操作需要使用蚀刻皿。

刻蚀皿由玻璃和硅胶粘合剂制成。开始刻蚀过程时，在皿中分配用于固定针端的硅胶粘合剂。放置针件，使其直端的尖端浸入粘合剂中。

这是在所有针脚就位并准备好进行下一步时的培养皿状态。将蚀刻培养皿转移至已加热至 38 摄氏度的加湿发酵罐中，静置过夜以固化粘合剂。当固化完成后，将带有针脚的蚀刻培养皿放置于 65 摄氏度的加热板上。

将0.8毫升蚀刻酸倒入引脚的未覆盖区域。10分钟后，使用微量移液器将酸转移至烧杯中。然后向培养皿中添加更多蚀刻酸，以重复蚀刻步骤。

蚀刻后，检查蚀刻区域的宽度是否约为 0.2 毫米。若是，则用微量移液器吸取五毫升碳酸氢钠溶液滴加到蚀刻皿中，以中和残留的酸。接着，用镊子沿纵向拉动取出固定用的针。

从一个制备好的模具开始。如本示意图所示，该模具用于制作具有固定侧壁和插针空间的装置。使用光刻技术在玻璃载片上制作该模具。

将制备好的载玻片置于塑料培养皿底部。随后，将PDMS预聚物倒入模具中，厚度为三毫米。将培养皿放入真空干燥器中抽真空10分钟。

之后，将其转移至65°C的烘箱中加热一小时。得到部分固化的板状物。使用解剖刀脱模，用于后续步骤。

将平板放入120摄氏度的烤箱中加热一小时，使其完全固化。现在使用已完全固化的平板，其边缘会沿着引导线图案呈现不规则形状。

使用手术刀精确且整齐地修剪不规则边缘。特别注意用于插入针头的表面，以制作出最佳装置。使用活检打孔器在主腔室的入口/出口及其他位置打孔。

现在，制备一个微通道装置。将清洗液加热至60摄氏度，并取一片4号盖玻片。该盖玻片尺寸为10毫米×20毫米。

将盖玻片浸入溶液中10分钟。将清洗并干燥后的盖玻片与PDMS薄片放置于溅射镀膜仪的下电极上。产生空气真空等离子体30秒。

将取出的部件粘合，使边缘对齐，并确保通过盖玻片能够观察到通道结构。使用无菌容器将粘合后的层转移至层流罩中进行灭菌。完成后，将针插入插槽中。

相邻的针脚应具有不同的长度。这些针脚构成了微腔的另一侧壁。继续在层流罩内操作。

进行下一步操作前，需准备好设备的基底。通过匀浆白色凡士林与聚四氟乙烯粉末的混合物来制备填充间隙材料。将匀浆后的混合物倒入分配用注射器中，并插入活塞。

推动活塞以填充注射器尖端。然后安装针头，并推动活塞直至针头充满。以相同方式准备另一支含有机硅粘合剂的注射器，并将两支注射器分别连接至气动点胶装置。

现在，将硅胶粘合剂涂布于基底上，沿其中一个腔室涂抹。然后，将一块4号盖玻片放置在腔室上，并用力按压使其牢固粘合。

接下来，沿底座的两个外侧槽口挤出硅胶粘合剂，形成约一毫米深的条段。沿中间的另一槽口挤出填缝剂，形成一毫米深的条段。在另一个口袋的边缘处多加一些粘合剂。

将微通道组件放置于凹槽中，并用力按压。再次在底座中部的槽内填入间隙填充材料，随后在相邻的槽内涂上粘合剂。

将装置在无菌操作台中静置一天。固化后，在层流操作台内，将每根针沿其相邻的针向上移动一毫米，以使其从弹性屏障中释放。通过在去离子水中稀释绿色荧光染料，建立荧光渗漏测试。

然后，打开微通道，使其在整个长度上保持一致的宽度。使用微量移液器将染料转移至微通道的一端入口，并用溶液将其充满。在一个大型塑料培养皿中，放入两张用去离子水浸湿的吸水纸，并将装置置于其中。

将培养皿置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度下孵育至少24小时。使用倒置荧光显微镜观察回收的装置，并记录图像。利用这些图像确认针周围无泄漏。

这些图像显示了一个渗漏样本和一个不渗漏样本。另一项测试涉及细胞接种。打开微通道，形成一个宽度为400微米的直通道，并尽可能使侧壁在整个长度上保持平整。

将细胞悬液加入一端的端口以充满通道。找到用于界定细胞培养区域侧壁的针状结构，并将其关闭，以将细胞封闭在该区域内。从靠近该区域的位置开始，依次关闭所有针状结构，以排出通道中的细胞。

从末端端口吸出悬液后，加入培养基。将装置置于含有湿润吸水纸的塑料容器中，在37°C、5% CO₂条件下孵育至少24小时。

观察封闭区域内细胞数量约为每平方英寸10个细胞。然后缓慢回撤针头以扩大培养区域。这些图像是在可重构微通道中培养的COS-7细胞。

在九天的过程中，微通道培养区域不断扩大。所收集的数据可用于绘制细胞数量和密度随时间变化的曲线图。蓝色点和拟合曲线代表细胞数量。

红色符号和拟合曲线代表密度。对于密度，垂直箭头表示在第2、5和6天细胞培养区域的扩展。密度的计算基于相同的培养区域。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何利用细小的针脚制作出无泄漏的微流控通道侧壁。一旦熟练掌握，只要操作得当，该技术可在一周内完成。在尝试此操作过程中，仔细而全面地完成方案中的每一个步骤至关重要。

请务必注意，操作强酸具有极高的危险性，必须采取预防措施，例如准备足量的中和剂。在完成这些步骤后，可引入其他含液体的细胞，以建立更为复杂的细胞培养体系。