颈静脉至颈总动脉移植血管中持久外源基因表达的兔模型

该方法可解答有关静脉移植物功能障碍发病机制的关键问题。例如，可鉴定导致移植物功能障碍的介质，并验证旨在预防移植物功能障碍的干预策略。该技术的主要优势在于能够在静脉移植物内皮中实现持久且稳定的转基因表达。

根据文本方案对兔子进行麻醉后，将动物从胸骨切迹至下颌边缘的毛发剃净。完成手术准备后，使用电灼器沿胸骨切迹至下颌之间的中线切开皮肤，切口长度约为7至9厘米。然后使用巾钳固定切口，使其保持开放状态。

沿正中线在筋膜下方钝性分离。然后使用电凝切开已分离的筋膜层，沿正中线切开。接下来，从右侧开始，在覆盖气管的胸骨舌骨肌与胸头肌之间进行分离，以暴露颈总动脉。

然后仔细分离出一段4至5厘米长的颈总动脉及其较大的分支，并将其周围组织清除干净。使用5-0丝线结扎颈总动脉的较大分支，然后在结扎线远端切断各分支。在对左侧颈总动脉重复上述分离操作后，使用组织固定镊子暂时闭合皮下组织层。

然后从右侧皮肤分离浅筋膜，直至暴露颈外静脉。解剖出一段4至5厘米长的颈外静脉，并将其分支从周围组织中游离出来。使用5-0丝线结扎分支，然后切断这些分支。

接下来，在分离出的静脉两端进行结扎，切断颅端，并用肝素化生理盐水冲洗管腔。进行静脉移植时，使用血管夹夹闭右侧颈总动脉分离段的颅端，然后在尾端放置另一个血管夹。

现在，在靠近尾侧夹钳的近头端位置进行尾侧动脉切开，切口长度应等于静脉节段头端的直径。然后将连接有肝素化生理盐水注射器的静脉导管经尾侧动脉切口插入，冲洗颈动脉管腔。冲洗液将从动脉切口处流出。

返回颈静脉，切除该静脉并将其置于颈动脉旁。使用7-0聚丙烯单针缝线，将尾侧动脉切口的尾端与静脉节段的头端缝合。然后在与第一针相距180度的位置缝第二针，将尾侧动脉切口的头侧边缘与静脉节段的头端缝合。

在吻合口外侧距前两针距离相等的位置缝合第三针。然后在吻合口内侧距前两针距离相等且与第三针相对的位置缝合第四针。在第一至第四针之间各插入四针。

在远端夹闭处的尾侧进行颅侧动脉切开。颅侧动脉切开的颅端与尾侧动脉切开的尾端之间的距离应与静脉节段的长度相等。颅侧动脉切开的长度等于静脉节段尾端的直径。

沿颈动脉从吻合口向头侧延伸，确保静脉无扭曲。然后用肝素化生理盐水通过头侧动脉切口冲洗颈动脉和静脉。接着缝合头侧动脉切口的尾端与静脉段的尾端，打第一个结。

然后在与第一针呈180度的位置缝第二针，将颅侧切口的颅端与静脉段的尾端缝合。按照视频前面演示的方法完成吻合。暂时松开颅侧夹，使静脉移植物充满血液，并用干纱布轻轻按压以止住任何出血。

重复此步骤，直至吻合口不再出血。然后移除头端和尾端的夹子。使用纱布控制吻合口处任何额外的出血。

使用3-0丝线结扎吻合口之间颈总动脉节段的两端。然后在结扎线之间中点处切断颈总动脉。应在静脉移植物中观察到明显的搏动。

在左侧重复进行静脉移植物置入。使用5-0 PGA缝线，以连续缝合方式闭合皮下组织。然后使用3-0 PGA缝线，以皮内缝合方式关闭皮肤，并在两端埋藏结。

根据文本方案进行术后护理和经皮超声检查。进行基因转导手术时，仔细游离右侧静脉移植物，包括移植物头侧和尾侧邻近的颈动脉各1.5至2厘米。以相同方式在左侧重复解剖操作。

使用生理盐水填充右侧手术创口腔，以促进声波传导。将一个2毫米的血管周围血流探头连接至体积流量计，并将探头浸入创口腔内的生理盐水中。将流速调至零。

将血流探头置于颈外静脉移植物的尾侧或头侧颈动脉周围，随后使用电子数据采集系统记录血流探头的数据。通过静脉导管向兔体内注射肝素，并用生理盐水冲洗，然后使用血管夹在静脉移植物头端夹闭颈总动脉。

然后在颈动脉上距离远端吻合口约10毫米的尾侧位置放置第二个血管夹，以留出动脉切开的空间。接着，在颈动脉上位于静脉移植物尾侧稍远处，松松地绕两根丝线结扎线。随后使用预先准备好的弯曲21号针头，在移植物的尾侧、远端血管夹的头侧稍远处穿刺颈动脉。

将针头在管腔内前后推进两次，以确保管腔通畅。然后小心地撤出针头。根据文本方案，用DMEM准备注射器和静脉导管后，将其插入颈总动脉切口至弯曲处，每次注入0.5毫升DMEM，重复两次，以冲洗静脉移植物管腔。

使用戴手套的手指轻轻按压移植物的颅端，以去除移植物中的 DMEM。然后小心地将手指沿移植物向尾端滑动，通过动脉切口将管腔内容物冲出。将 DMEM 注射器从导管上取下，导管保留在血管内。

连接装有病毒溶液的注射器，确保无空气进入导管。将松散打结的丝线沿动脉向下移动，直至位于导管尖端周围，但不要扎紧。注入 0.03 毫升病毒溶液，以将导管内剩余的 DMEM 完全推出。

然后用手指轻轻从头端向尾端方向挤压，将静脉移植物管腔内的所有液体排出。收紧围绕动脉和导管尖端的两根结扎线，以封闭管腔。随后注入病毒溶液，直至静脉扩张。

将注射器轻轻放置在纱布垫上。20分钟后，使用一支空注射器轻轻抽吸移除移植物中含病毒的溶液，直至血管塌陷。移除注射器，保留导管原位。

然后剪断并解开丝线缝线，将导管从血管中撤出。现在使用7-0聚丙烯缝线以“X”形交叉方式缝合动脉切口。然后轻轻拉紧缝线两端，并用两个方结打结固定。

按照文本方案中所述恢复右侧静脉移植物的血流后，重复在左侧进行病毒灌注。为获取转导后的移植物，游离双侧静脉移植物及颈总动脉，并如前所述对左右两侧进行血流测量。使用3-0丝线结扎移植物头侧的右侧颈总动脉。

然后使用3-0丝线缝合线在移植物远端结扎颈动脉。通过切断每处结扎线之间以及邻近吻合口处的颈动脉，切除右侧静脉移植物。随后将静脉移植物从兔体内取出，并用生理盐水冲洗管腔。

新操作者必须达到的第一个里程碑是在初次静脉移植手术以及随后的延迟转导手术后，均能实现稳定的静脉移植物通畅。当静脉移植物通畅时，超声检查将显示一条较大的血管，并伴有从尾端至头端的快速血流。移植物在转导后三天被取出，切成若干段，并用X-gal染色。

对管腔表面进行的平面成像显示，部分静脉移植物转导效率较高，而另一些则转导效率较低。如本图所示，由新手操作者转导的静脉移植物中β-半乳糖苷酶mRNA的表达水平，与由经验丰富的操作者转导的静脉移植物中的β-半乳糖苷酶mRNA水平相比，无显著差异。在执行本方案时，务必注意在吻合前将静脉移植物从头端至尾端方向翻转。

这是为了避免静脉推注导致血流受阻。一旦掌握，静脉移植手术约需三小时完成，静脉移植基因转导手术约需两小时，取材手术约需45分钟。请注意，由于本实验方案涉及病毒载体和锐器操作，必须遵循相应的生物安全和锐器操作规范。