Name: 颈动脉介入移植中颈静脉持久性转基因表达的家兔模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 了解家兔颈静脉移植模型中持久性转基因表达技术，用于研究移植静脉病理机制及预防移植失败的基因治疗策略。该方法为血管生物学和基因治疗研究提供稳定可靠的实验平台。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中的关键步骤包括麻醉管理、抗凝处理、动脉/移植静脉的外科操作以及移植静脉的血流动力学测量。在此涉及两次相对较长时间手术（通常双侧静脉移植手术为3-3.5小时，双侧移植物转导手术为1.5-2.5小时）的多次存活手术模型中，麻醉的恰当管理至关重要。我们曾通过鼻罩和经气管插管两种方式给予麻醉，发现插管可提高移植物转导手术后的存活率，可能是因为正压通气可预防肺不张及相关呼吸衰竭。兔的气管插管操作具有挑战性，插管相关的气道创伤可能导致术后喘鸣。然而，与插管相关的困难和并发症，相较于其在消除静脉移植手术围手术期大多数发病率和死亡率方面的益处而言，是较小的代价。
抗凝治疗对于预防移植静脉发生血栓至关重要，此类血栓可能在任一存活手术后出现。血栓形成似乎是一种早期术后事件，因为术后5–7天经皮超声检查显示通畅的静脉移植物，在取材时几乎总是保持通畅。为预防第一次手术后的血栓形成，即，静脉移植）中，在获取第一侧颈外静脉前，经静脉给予肝素。根据肝素在兔体内的血浆半衰期（1–2小时），在获取对侧颈外静脉前追加半剂量的静脉肝素。此外，在单根静脉移植物的动静脉吻合完成前，我们每隔约8分钟...

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是血管壁内脂质积聚和炎症反应，导致血管腔狭窄，进而引发心肌梗死、脑卒中和肢体缺血坏死1,2。经皮介入治疗（例如，血管成形术和支架植入术）和药物治疗（例如，他汀类药物和抗血小板药物）对动脉粥样硬化具有一定的疗效；然而，对于冠状动脉和外周循环中的严重阻塞性病变，这些方法往往效果不佳。利用自体静脉段进行旁路移植术，仍是治疗严重且弥漫性冠状动脉和外周血管疾病患者的常用手段3,4。然而，无论是用于冠状动脉还是外周循环的静脉移植物，其长期通畅率均不理想。在冠状动脉旁路移植术中，约有10%-20%的静脉移植物在术后1年内发生闭塞，至术后10年闭塞率高达50%5,6。在外周循环中，静脉移植物在5年内的失败率约为30%-50%7。
基因治疗是一种预防静脉移植物失效的有吸引力的方法，因为它能够将治疗性基因产物精确地递送至病变部位。因此，已有大量临床前研究测试了静脉移植物基因治疗的效果8,9。然而，这些研究基本上均仅评估了早期时间点（2–12周）的疗效10,11,12,13,14,15,16,17。目前尚无证据表明基因治疗干预能够对通常由新生内膜增生和动脉粥样硬化引起的晚期静脉移植物失效提供持久（数年）的保护作用4。我们开发了一种可在移植静脉中实现持久转基因表达的方法，从而能够对基因治疗干预在晚期以及早期时间点的效果进行检测。为实现持久的转基因表达，该方法采用了HDAd载体和延迟转导策略。HDAd载体由于缺乏病毒基因，可避免免疫系统对转导细胞的识别与清除，因而能够实现长期的转基因表达18,19,20,21。延迟转导（在移植术后28天进行）可防止转导细胞在移植后早期发生的动脉化过程中丢失22。
其他实现静脉移植物管壁治疗性转基因表达的方法依赖于在移植术实施时对静脉移植物进行转导10,11,12,15,16,17。采用该方法时，若进行连续检测，转基因表达在转导后迅速下降22,23。因此，使用该方法的研究通常未考察静脉移植术后12周以上的疗效，大多数研究甚至未评估超过4周的疗效。相比之下，我们的方法所实现的静脉移植物转基因表达可稳定持续至少24周，并且——基于在动脉中开展的类似研究——很可能维持更长时间22,24。据我们所知，目前尚无其他静脉移植物基因治疗干预手段能够实现如此持久的稳定转基因表达。
我们采用兔模型来建立本方法。其他研究者曾使用啮齿类动物、兔或更大的动物来测试静脉移植基因治疗10,11,12,15,16,17,25,26。与啮齿类动物模型相比，兔的成本更高，且受到更严格的监管要求。然而，与较大的动物（e.g.，猪和狗）相比，兔的购买和饲养成本显著更低，且操作更为简便。此外，兔的血管在生理上与人类血管相似27，其尺寸足够大，可用于经皮干预措施的测试28,29，并能提供足够的组织，使得利用单个血管标本即可检测多个终点指标（e.g.，组织学、蛋白质、RNA）22,30。此外，当携带静脉移植物的兔被喂食高脂饮食时，会发展出静脉移植物动脉粥样硬化31,32，而这是冠状动脉旁路移植术中静脉移植物失效的常见原因4,5。这些动脉粥样硬化的兔静脉移植物可作为利用本方法递送基因治疗干预措施的实验基质。所提供的实验方案可帮助研究人员掌握在兔静脉移植物中实现持久外源基因表达所需的技术技能。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;一次性耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器配 24G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309571</td><td>静脉移植手术使用 2 支；基因转导手术使用 2 支&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 注射器配 27G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td>静脉移植手术使用 2 支，基因转导手术使用 5 支</td></tr><tr><td>19G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305187</td><td>基因转导手术</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器，鲁尔锁扣</td><td>Nipro Medical Corp</td><td>JD+20L</td><td></td></tr><tr><td>导管，24G × 3/4&amp;rdquo;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>21G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305165</td><td>基因转导手术及用于 20 mL 生理盐水注射器</td></tr><tr><td>纱布 4&amp;rdquo; × 4&amp;rdquo;</td><td>Dynarex</td><td>3242</td><td>每台手术约需 10–15 块</td></tr><tr><td>3-0 丝线缝合线</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-244</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-182</td><td></td></tr><tr><td>7-0 聚丙烯缝合线</td><td>CP Medical</td><td>8703P</td><td>静脉移植手术</td></tr><tr><td>7-0 聚丙烯缝合线</td><td>CP Medical</td><td>8648P</td><td>基因转导手术</td></tr><tr><td>5-0 聚乙醇酸缝合线</td><td>CP Medical</td><td>421A</td><td></td></tr><tr><td>3-0 聚乙醇酸缝合线</td><td>CP Medical</td><td>398A</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Covidien Ltd.</td><td>6818</td><td>用于静脉通路建立</td></tr><tr><td>导管塞</td><td>Vetoquinol</td><td>411498</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮，100 mg/mL</td><td>Vedco Inc.</td><td>5098916106</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪，100 mg/mL</td><td>Akorn Inc.</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因，20 mg/mL</td><td>Pfizer</td><td>409427702</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因 0.5%</td><td>Pfizer</td><td>409161050</td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia D-Special</td><td>Intervet Inc.</td><td>NDC 00061047305</td><td>仅用于取材手术</td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mL</td><td>Patterson Veterinary</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水静脉输液袋，0.9% 氯化钠</td><td>Baxter</td><td>2B1309</td><td></td></tr><tr><td>肝素&amp;nbsp;（5000 U/mL）</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-047-10</td><td></td></tr><tr><td>罂粟碱（3.5 mg/mL）</td><td>American Reagent Inc.</td><td>NDC 0517-4002-25</td><td>由 30 mg/mL 储备液稀释；最大使用量为 1 mL</td></tr><tr><td>芬太尼透皮贴剂，25 mcg/h</td><td>Apotex Corp.</td><td>NDC 60505-7006-2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>多个供应商</td><td>目录号不可用</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;病毒载体</td><td></td><td></td><td>仅用于基因转导手术</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 持针器，7&quot; 直头</td><td>Roboz</td><td>RS-7900</td><td></td></tr><tr><td>手术剪，6.5&quot; 直头钝-钝</td><td>Roboz</td><td>RS-6828</td><td></td></tr><tr><td>持针器（带缝线剪）</td><td>Miltex</td><td>8-14-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 持针器，5.75&quot; 直头带锁</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td></td></tr><tr><td>Stevens 剪刀，4.25&quot; 弯头钝-钝</td><td>Roboz</td><td>RS-5943</td><td></td></tr><tr><td>Alm 牵开器，4&quot; 4×4，5 mm 钝齿</td><td>Roboz</td><td>RS-6514</td><td>2 个</td></tr><tr><td>Backhaus 手巾钳，3.5&quot;</td><td>Roboz</td><td></td><td>4 个</td></tr><tr><td>微型夹子放置钳，4.75&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-6496</td><td></td></tr><tr><td>微型血管夹，11 mm</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surg-I-Loop</td><td>Scanlan International</td><td>1001-81M</td><td>5 cm 长度</td></tr><tr><td>Bonaccolto 镊子，4&amp;rdquo;（10 cm）长纵向锯齿，尖端交叉锯齿，尖端宽度 1.2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5210</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子，Inox 尖端尺寸 0.17 &amp;times; 0.10 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5042</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子，4&amp;rdquo;（10 cm）长锯齿直头，尖端 0.8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5280</td><td></td></tr><tr><td>Halstead 蚊式钳，&amp;nbsp;5&quot; 直头，1.3 mm 尖端</td><td>Roboz</td><td>RS-7110</td><td>2 个</td></tr><tr><td>Halstead 蚊式钳，&amp;nbsp;5&quot; 弯头，1.3 mm 尖端</td><td>Roboz</td><td>RS-7111</td><td></td></tr><tr><td>Jacobson 蚊式钳，5&quot; 弯头超精细，0.9 mm 尖端</td><td>Roboz</td><td>RS-7117</td><td></td></tr><tr><td>Kantrowitz 镊子，7.25&quot; 90 度精细，1.7 mm 尖端</td><td>Roboz</td><td>RS-7305</td><td></td></tr><tr><td>组织镊，5&quot;，1×2 齿，尖端宽度 2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8162</td><td></td></tr><tr><td>Allis-Baby 镊子，12 cm，4×5 齿，尖端宽度 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11092-12</td><td>2 个</td></tr><tr><td>Adson 镊子，12 cm，锯齿状，直头</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>兽用电动手术手柄及电极</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>HPAC-1; R-F11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术室设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环温水毯及泵</td><td>多个供应商</td><td>目录号不可用</td><td></td></tr><tr><td>Bair hugger 加温系统</td><td>3M</td><td>型号 505</td><td></td></tr><tr><td>静脉输液泵</td><td>Heska</td><td>Vet IV 2.2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发罐及废气清除系统</td><td>多个供应商</td><td>目录号不可用</td><td></td></tr><tr><td>兽用多参数监护仪</td><td>Surgivet</td><td>Surgivet Advisor</td><td></td></tr><tr><td>兽用电动手术系统</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>MV-9</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>D.F. Vasconcellos</td><td>M900</td><td>静脉移植手术使用 25 倍放大；基因转导手术使用 16 倍放大</td></tr></tbody></table>

颈静脉至颈总动脉移植血管中持久外源基因表达的兔模型

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

静脉移植旁路手术是治疗闭塞性动脉疾病的一种常见方法；然而，由于血栓形成、内膜增生和动脉粥样硬化导致的移植物失效，其长期疗效受到限制。本文旨在展示一种在兔体内建立双侧静脉移植段的方法，并通过基因转移载体对移植物进行转导，以实现外源基因的持久表达。该方法可用于研究基因及其蛋白产物在正常静脉移植物稳态中的生物学作用，同时也可用于检测外源基因是否具有预防静脉移植物失效的活性。 例如，无论是在高脂饮食喂养的兔子中，转基因的表达是否能够防止新生内膜增生、减轻血管炎症或减少动脉粥样硬化。在首次存活手术中，切除右侧和左侧颈外静脉段，并以反向端-侧方式双侧移植至颈总动脉作为间置移植物。在28天后进行的第二次存活手术中，使用血管夹将每条移植物从循环中隔离，并通过动脉切口向管腔内注入含有辅助依赖型腺病毒（HDAd）载体的溶液。经过20分钟孵育后，吸除载体溶液，修复动脉切口，恢复血流。根据各自实验方案规定的时间点收获静脉移植物。移植物植入与转导之间28天的间隔是必要的，以确保静脉移植物适应动脉血液循环。这种适应可避免在移植前或移植后立即进行转导时所发生的转基因表达快速丢失。该方法的独特之处在于能够在移植静脉中实现持久且稳定的转基因表达。与其他大型动物静脉移植物模型相比，兔子具有成本低和易于操作的优势；与啮齿类动物静脉移植物模型相比，兔子的血管更大且更易于操作，可提供充足的组织用于分析。

在新操作者使用本方法生成实验数据之前，必须对其技术熟练程度进行验证。新操作者需达到的首个关键指标是在初次静脉移植手术以及后续的延迟转导手术后，均能实现稳定的静脉移植物通畅。每次手术后通畅率超过90%是可实现且理想的目标。通畅情况可通过经皮超声无创评估，我们通常在术后第5至7天进行该检查。在静脉通畅的兔子中，超声检查将显示颈部前侧双侧存在一条较大的血管，并可见快速的尾端向头端血流（图3A）。若任一侧静脉移植物发生闭塞，则在该侧将无法检测到尾端向头端的血流；然而，颈内静脉中仍可检测到头端向尾端的血流（图3B）。
新操作者必须达到的第二个里程碑是高效转导静脉移植物的内皮细胞。在此过程中，使用表达β-半乳糖苷酶的腺病毒载体来评估内皮基因转导的效率。本实验室的一名新操作者采用所...

本方法描述了在兔子体内植入间置静脉移植物、对移植物进行转导以及实现持久的外源基因表达。该技术可用于研究外源基因及其蛋白产物在移植静脉中的生理与病理作用，并可用于静脉移植物疾病基因治疗的测试。

静脉移植旁路手术是治疗闭塞性动脉疾病的一种常见方法；然而，由于血栓形成等原因导致的移植物失效，限制了其长期疗效，……

该方法可解答有关静脉移植物功能障碍发病机制的关键问题。例如，可鉴定导致移植物功能障碍的介质，并验证旨在预防移植物功能障碍的干预策略。该技术的主要优势在于能够在静脉移植物内皮中实现持久且稳定的转基因表达。根据文本方案对兔子进行麻醉后，将动物从胸骨切迹至下颌边缘的毛发剃净。完成手术准备后，使用电灼器沿胸骨切迹至下颌之间的中线切开皮肤，切口长度约为7至9厘米。然后使用巾钳固定切口，使其保持开放状态。沿正中线在筋膜下方钝性分离。然后使用电凝切开已分离的筋膜层，沿正中线切开。接下来，从右侧开始，在覆盖气管的胸骨舌骨肌与胸头肌之间进行分离，以暴露颈总动脉。然后仔细分离出一段4至5厘米长的颈总动脉及其较大的分支，并将其周围组织清除干净。使用5-0丝线结扎颈总动脉的较大分支，然后在结扎线远端切断各分支。在对左侧颈总动脉重复上述分离操作后，使用组织固定镊子暂时闭合皮下组织层。然后从右侧皮肤分离浅筋膜，直至暴露颈外静脉。解剖出一段4至5厘米长的颈外静脉，并将其分支从周围组织中游离出来。使用5-0丝线结扎分支，然后切断这些分支。接下来，在分离出的静脉两端进行结扎，切断颅端，并用肝素化生理盐水冲洗管腔。进行静脉移植时，使用血管夹夹闭右侧颈总动脉分离段的颅端，然后在尾端放置另一个血管夹。现在，在靠近尾侧夹钳的近头端位置进行尾侧动脉切开，切口长度应等于静脉节段头端的直径。然后将连接有肝素化生理盐水注射器的静脉导管经尾侧动脉切口插入，冲洗颈动脉管腔。冲洗液将从动脉切口处流出。返回颈静脉，切除该静脉并将其置于颈动脉旁。使用7-0聚丙烯单针缝线，将尾侧动脉切口的尾端与静脉节段的头端缝合。然后在与第一针相距180度的位置缝第二针，将尾侧动脉切口的头侧边缘与静脉节段的头端缝合。在吻合口外侧距前两针距离相等的位置缝合第三针。然后在吻合口内侧距前两针距离相等且与第三针相对的位置缝合第四针。在第一至第四针之间各插入四针。在远端夹闭处的尾侧进行颅侧动脉切开。颅侧动脉切开的颅端与尾侧动脉切开的尾端之间的距离应与静脉节段的长度相等。颅侧动脉切开的长度等于静脉节段尾端的直径。沿颈动脉从吻合口向头侧延伸，确保静脉无扭曲。然后用肝素化生理盐水通过头侧动脉切口冲洗颈动脉和静脉。接着缝合头侧动脉切口的尾端与静脉段的尾端，打第一个结。然后在与第一针呈180度的位置缝第二针，将颅侧切口的颅端与静脉段的尾端缝合。按照视频前面演示的方法完成吻合。暂时松开颅侧夹，使静脉移植物充满血液，并用干纱布轻轻按压以止住任何出血。重复此步骤，直至吻合口不再出血。然后移除头端和尾端的夹子。使用纱布控制吻合口处任何额外的出血。使用3-0丝线结扎吻合口之间颈总动脉节段的两端。然后在结扎线之间中点处切断颈总动脉。应在静脉移植物中观察到明显的搏动。在左侧重复进行静脉移植物置入。使用5-0 PGA缝线，以连续缝合方式闭合皮下组织。然后使用3-0 PGA缝线，以皮内缝合方式关闭皮肤，并在两端埋藏结。根据文本方案进行术后护理和经皮超声检查。进行基因转导手术时，仔细游离右侧静脉移植物，包括移植物头侧和尾侧邻近的颈动脉各1.5至2厘米。以相同方式在左侧重复解剖操作。使用生理盐水填充右侧手术创口腔，以促进声波传导。将一个2毫米的血管周围血流探头连接至体积流量计，并将探头浸入创口腔内的生理盐水中。将流速调至零。将血流探头置于颈外静脉移植物的尾侧或头侧颈动脉周围，随后使用电子数据采集系统记录血流探头的数据。通过静脉导管向兔体内注射肝素，并用生理盐水冲洗，然后使用血管夹在静脉移植物头端夹闭颈总动脉。然后在颈动脉上距离远端吻合口约10毫米的尾侧位置放置第二个血管夹，以留出动脉切开的空间。接着，在颈动脉上位于静脉移植物尾侧稍远处，松松地绕两根丝线结扎线。随后使用预先准备好的弯曲21号针头，在移植物的尾侧、远端血管夹的头侧稍远处穿刺颈动脉。将针头在管腔内前后推进两次，以确保管腔通畅。然后小心地撤出针头。根据文本方案，用DMEM准备注射器和静脉导管后，将其插入颈总动脉切口至弯曲处，每次注入0.5毫升DMEM，重复两次，以冲洗静脉移植物管腔。使用戴手套的手指轻轻按压移植物的颅端，以去除移植物中的 DMEM。然后小心地将手指沿移植物向尾端滑动，通过动脉切口将管腔内容物冲出。将 DMEM 注射器从导管上取下，导管保留在血管内。连接装有病毒溶液的注射器，确保无空气进入导管。将松散打结的丝线沿动脉向下移动，直至位于导管尖端周围，但不要扎紧。注入 0.03 毫升病毒溶液，以将导管内剩余的 DMEM 完全推出。然后用手指轻轻从头端向尾端方向挤压，将静脉移植物管腔内的所有液体排出。收紧围绕动脉和导管尖端的两根结扎线，以封闭管腔。随后注入病毒溶液，直至静脉扩张。将注射器轻轻放置在纱布垫上。20分钟后，使用一支空注射器轻轻抽吸移除移植物中含病毒的溶液，直至血管塌陷。移除注射器，保留导管原位。然后剪断并解开丝线缝线，将导管从血管中撤出。现在使用7-0聚丙烯缝线以“X”形交叉方式缝合动脉切口。然后轻轻拉紧缝线两端，并用两个方结打结固定。按照文本方案中所述恢复右侧静脉移植物的血流后，重复在左侧进行病毒灌注。为获取转导后的移植物，游离双侧静脉移植物及颈总动脉，并如前所述对左右两侧进行血流测量。使用3-0丝线结扎移植物头侧的右侧颈总动脉。然后使用3-0丝线缝合线在移植物远端结扎颈动脉。通过切断每处结扎线之间以及邻近吻合口处的颈动脉，切除右侧静脉移植物。随后将静脉移植物从兔体内取出，并用生理盐水冲洗管腔。新操作者必须达到的第一个里程碑是在初次静脉移植手术以及随后的延迟转导手术后，均能实现稳定的静脉移植物通畅。当静脉移植物通畅时，超声检查将显示一条较大的血管，并伴有从尾端至头端的快速血流。移植物在转导后三天被取出，切成若干段，并用X-gal染色。对管腔表面进行的平面成像显示，部分静脉移植物转导效率较高，而另一些则转导效率较低。如本图所示，由新手操作者转导的静脉移植物中β-半乳糖苷酶mRNA的表达水平，与由经验丰富的操作者转导的静脉移植物中的β-半乳糖苷酶mRNA水平相比，无显著差异。在执行本方案时，务必注意在吻合前将静脉移植物从头端至尾端方向翻转。这是为了避免静脉推注导致血流受阻。一旦掌握，静脉移植手术约需三小时完成，静脉移植基因转导手术约需两小时，取材手术约需45分钟。请注意，由于本实验方案涉及病毒载体和锐器操作，必须遵循相应的生物安全和锐器操作规范。

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医学

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