Name: 舌细胞外基质的制备与舌鳞癌体外重建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学习利用脱细胞技术制备舌细胞外基质，并通过迷你生物反应器进行三维培养，构建舌鳞癌体外重建模型。该方法能更真实地模拟临床肿瘤组织病理特征，为口腔癌研究提供可靠的实验平台。

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作者感谢国家自然科学基金（31371390）、国家高技术研究发展计划项目（2014AA020702）以及广东省科学技术计划项目（2016B030231001）提供的研究资助。

所有动物实验均依照动物福利法、机构指南进行，并经中山大学实验动物福利与使用委员会批准。
1. 透射电镜样品制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠，并使用无菌手术剪和镊子取出舌头。</li>
	<li>将舌头浸入75%乙醇中3分钟，然后将每条舌头放入含有1 mL 10 mM无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管（EP管）中。 
	注意：后续所有步骤中PBS的浓度均与此步骤相同。</li>
	<li>冻融法细胞裂解：将装有舌头的EP管在-80 °C冷冻1小时，然后在室温下解冻45分钟，重复3个循环。</li>
	<li>使用手术针将每条舌头穿在一段外科缝线上，并用一小块无菌锡箔包裹缝线末端。在含有75%乙醇的3.5 cm或6 cm培养皿中无菌条件下进行操作。 
	注意：每段外科缝线的适宜长度约为20 cm，每块锡箔的适宜尺寸约为0.3 cm2（1 cm × 0.3 cm）。舌头应靠近锡箔端穿入。</li>
	<li>在3.5 cm或6 cm培养皿中用3 mL无菌PBS冲洗每条舌头30秒。该操作需在无菌条件下进行。</li>
	<li>用超纯水洗涤&#160;舌头：向一个盛有250 mL无菌超纯水的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头连同搅拌子一起放入瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。 
	注意：考虑到缝线可能缠绕，每瓶最多可放入5条舌头。缝线末端的锡箔用于防止舌头滑脱。通过调节瓶内缝线长度，使舌头距离瓶底约2 cm。此注意事项同样适用于步骤1.8、1.10、1.12和1.16。</li>
	<li>将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌12小时。</li>
	<li>用NaCl洗涤&#160;舌头：向一个盛有250 mL无菌1 M NaCl的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。</li>
	<li>将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。</li>
	<li>使用Triton X-100进行细胞裂解：向一个盛有250 mL无菌PBS中含2% Triton X-100的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。</li>
	<li>将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌48小时。</li>
	<li>用CaCl2/MgCl2洗涤&#160;舌头：向一个盛有250 mL无菌5 mM CaCl2/MgCl2的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。</li>
	<li>将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。</li>
	<li>DNase消化：向每个EP管中加入1 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS），再分别向HBSS中加入DNase，使其终浓度为300 µM。将每条舌头转移至各自的EP管中，使部分缝线留在管外。该操作需在无菌条件下进行。 
	注意：确保此前步骤中留在瓶内的缝线部分在此步骤中仍留在EP管内，此前留在瓶外的缝线部分也应继续留在管外。</li>
	<li>将装有舌头的EP管在37 °C孵育24小时。</li>
	<li>用PBS洗涤&#160;舌头：向一个盛有250 mL无菌PBS的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。</li>
	<li>将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。</li>
	<li>将制备好的脱细胞舌基质（TEM）保存在无菌PBS中，4 °C储存备用。</li>
</ol>
2. 舌鳞状细胞癌的三维（3D）重建
<ol>
	<li>静态TSCC模型构建
	<ol>
		<li>接种 1.0 × 106 将单个TSCC细胞（Cal27）接种至3.5 cm培养皿中，加入3 mL含10%胎牛血清（FBS）、90 µg/mL氨苄青霉素和90 µg/mL卡那霉素的DMEM/F12培养基。</li>
		<li>在37 °C条件下培养Cal27细胞2至3天，确保细胞覆盖培养皿底部至少60%的面积。</li>
		<li>将TEM加入培养皿中的Cal27单层细胞中。</li>
		<li>将培养皿放入 CO₂ 培养箱中2 37 °C 培养箱中培养 28 天。</li>
		<li>在细胞培养过程中，每天更换一次培养基。CO2 培养箱中的浓度为5%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>搅拌式TSCC模型构建
	<ol>
		<li>自制搅拌式微型生物反应器的制备
		<ol>
			<li>从10 mL注射器中取出活塞芯。</li>
			<li>在杆的下端附近挖一个直径为1厘米的孔，并将搅拌子放入孔中。</li>
			<li>在塑料广口瓶瓶盖中心挖一个直径为0.5 cm的孔，将活塞杆穿过瓶盖。</li>
			<li>将50 mL离心管切去一半，并将其焊接在瓶盖外侧。</li>
			<li>用绑好鱼钩的鱼线缠绕鱼竿，将鱼钩固定在鱼竿上。 
			注意：每根鱼竿最多可安装4个鱼钩。</li>
			<li>使用前将自制的复合物进行高压灭菌。 
			注意：请勿对塑料广口瓶进行高压灭菌。细胞培养时应使用新的无菌塑料广口瓶。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动态细胞培养
	<ol>
		<li>接种 1.0 × 106 在自制的微型生物反应器中加入单个Cal27细胞。加入150 mL含有10%胎牛血清、90 µg/mL氨苄青霉素和90 µg/mL卡那霉素的DF12培养基。</li>
		<li>使用连接在杆上的鱼钩将TEM装载到微型生物反应器上。</li>
		<li>拧紧瓶盖，将迷你生物反应器置于磁力搅拌器上，在 CO₂ 氛围下以 200 rpm 转速启动迷你生物反应器。2 37 °C 培养箱中培养 7 至 14 天。 
		注意：CO的浓度2 在 CO2 培养箱中的二氧化碳浓度为5%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一种成熟的脱细胞ECM制备方案应在几乎完全去除组织中细胞成分的同时，保留天然ECM的组成21。尽管目前报道的脱细胞方案多依赖通过血管灌注以对流方式清除细胞物质，但本研究采用了机械振荡法，这是一种传统上简单且成本较低的方法22,23,24,25,26。此外，由于舌组织富含舌肌而大口径血管较少，因此该方案相较于上述其他方法更适用于舌组织。
此外，该透射电镜样本制备方案采用适当强度的脱细胞处理，避免了高强度脱细胞方法（如十二烷基硫酸钠（SDS）处理）可能引起的基底膜破坏或溶解3。同时，该方案在大鼠和猪的舌组织中也有效（数据未显示），表明该方法可普遍适用于多种物种的舌组织<...

舌头具有多种重要功能，例如吞咽、发音和味觉。因此，舌功能受损会显著影响患者的生活质量1。口腔中最常见的恶性肿瘤是舌鳞状细胞癌（TSCC），通常发生于饮酒或吸烟的人群中2。
近年来，在舌鳞状细胞癌的基础研究方面进展甚微。有效 体外 研究模型仍然是最大的问题之一。因此，细胞外基质（ECM）成为一种潜在的解决方案。由于ECM是由高度有序的基质成分组成的复杂网络结构，具有类似ECM结构和组成的支架材料将适用于癌症研究。去细胞化ECM能够完美地为同源细胞提供微环境 体外，这恰恰是细胞外基质（ECM）最显著的优势。
通过使用去污剂和酶进行脱细胞处理，可去除组织中的细胞成分而保留细胞外基质（ECM）。脱细胞基质中包含多种ECM成分，如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，可为培养的细胞提供类似天然组织的微环境，促进细胞的存活、增殖和分化3。此外，由于ECM中不含细胞成分，其用于移植时的免疫原性可降至最低水平。
迄今为止，脱细胞ECM的制备方法已在多种组织和器官中进行尝试，如心脏4,5,6,7、肝脏8,9,10,11、肺12,13,14,15,16,17和肾脏18,19,20。然而，据我们所知，目前尚未见有关舌组织类似研究的报道。
本研究通过一系列物理、化学和酶处理方法，高效且低成本地制备了脱细胞舌细胞外基质（TEM），并利用该TEM用于重建舌鳞状细胞癌模型 体外，展示了TSCC行为与发展的合适模拟。TEM具有良好的生物相容性，并能引导细胞归巢至组织特异性微环境，表明TEM在TSCC研究中具有重要潜力3该方案为研究舌鳞状细胞癌发病机制或临床治疗的科研人员提供了一种选择。

<table><tbody><tr><td>C57-BL/6J 小鼠</td><td>中山大学实验动物中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>广州化学试剂厂</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>生工生物</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>生工生物</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>广州化学试剂厂</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td><td>生工生物</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL EP 管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 细胞培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 细胞培养皿</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>生工生物</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合线</td><td>上海金环</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 广口瓶</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>湖南平安</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27 细胞</td><td>中国科学院上海细胞库</td><td></td><td>舌鳞状细胞癌细胞系</td></tr><tr><td>U2OS 细胞</td><td>中国科学院上海细胞库</td><td></td><td>人骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 游离酸</td><td>BBI</td><td>A600264</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>海尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯水仪</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

舌部细胞外基质的制备及舌鳞状细胞癌的重建 体外

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

为了构建一种有效且逼真的舌鳞状细胞癌（TSCC）模型 体外，这些方法旨在制备脱细胞舌细胞外基质（TEM），以提供用于舌鳞状细胞癌（TSCC）构建的功能性支架。TEM 提供了一种 体外 细胞生长、分化和迁移的微环境。脱细胞基质中保留的天然细胞外基质（ECM）微结构和生化成分可为细胞锚定提供组织特异性的微环境。通过脱氧核糖核酸酶（DNase）消化结合一系列有机或无机预处理，可实现组织工程基质（TEM）的制备。该方案操作简便，脱细胞效率高。TEM在静态或搅拌培养条件下对TSCC细胞均表现出良好的细胞相容性，可用于构建TSCC模型。实验中还采用自制生物反应器实现持续搅拌条件下的细胞培养。利用TEM重建的TSCC组织表现出与临床TSCC组织病理学特征相似的特性，提示其在TSCC研究中具有应用潜力。

本实验方案在制备透射电镜（TEM）样品方面表现出高效性和适用性。与天然舌组织相比，TEM显示了完美的脱细胞效果。苏木精-伊红（HE）染色结果（图1A-B）证实了脱细胞的有效性。HE染色结果显示，TEM中细胞核染色完全消失（图1B）。此外，根据前期研究中的DNA含量定量分析表明，DNA几乎已从TEM中完全去除3。该方案在去除细胞成分的同时，对组织完整性造成的损伤极少（图1B）。
采用透射电镜（TEM）和自制微型生物反应器对舌鳞状细胞癌（TSCC）进行三维重建（图2<str...

本文展示了一种高效脱细胞化制备舌细胞外基质（TEM）的方法。该TEM可作为功能性支架，用于在静态或搅拌培养条件下构建舌鳞状细胞癌（TSCC）模型。

为了在体外构建一种有效且接近真实的舌鳞状细胞癌（TSCC）模型，建立了以下方法以制备……

该方法有助于解答口腔癌研究领域中的一些关键问题，例如如何在体外构建合适的T辅助细胞模型。该技术的主要优势在于，重建的舌鳞状细胞癌（TSCC）能够表达出与临床TSCC组织病理学特征高度相似的肿瘤特性。当我们意识到二维培养的TSCC细胞无法正确呈现TSCC的天然表型时，首次提出了该方法的设想。此外，我们认识到细胞外基质在肿瘤细胞逃避免疫杀伤及分化过程中的重要性。本方法的可视化演示至关重要，因为舌部细胞外基质的制备以及利用微型生物反应器进行三维培养的技术仅通过文字难以掌握，而通过直观展示则更易于理解。根据文本方案，从安乐死小鼠中分离舌头组织后，将组织浸入75%乙醇中三分钟。然后将每份舌组织转移至含有1毫升10毫摩尔无菌PBS的1.5毫升微量离心管中。为进行细胞裂解，将舌组织在-80摄氏度下冷冻1小时，随后在室温下解冻45分钟。再重复冻融两次。接下来，在一个含有75%乙醇的3.5厘米或6厘米培养皿中，使用外科针将每条舌组织穿到一段外科缝线上。然后用一小块无菌锡箔包裹缝线的末端。在直径3.5厘米或6厘米的培养皿中，用3毫升PBS对每根舌组织冲洗30秒。然后，在广口瓶中，将250毫升无菌超纯水中加入90微克/毫升的氨苄青霉素，并放入一个搅拌子。将最多五根舌组织放入瓶中，使其距离瓶底约2厘米，拧紧瓶盖，使部分缝合线保留在瓶外。将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌12小时。随后，在孵育结束后，配制250毫升含90微克/毫升氨苄青霉素的无菌1摩尔/升氯化钠溶液。将舌片和搅拌子转移至瓶中，并拧紧瓶盖。将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。为进行细胞裂解，配制含有90微克/毫升氨苄青霉素的250毫升无菌PBS缓冲液，其中含2% Triton X-100。将组织样本和搅拌子转移至该瓶子中，并拧紧瓶盖。然后将瓶子搅拌 48 小时。在配制含氨苄青霉素的氯化钙和氯化镁溶液后，将组织和搅拌子转移至瓶中，再将瓶子搅拌 24 小时。为每个舌组织样本准备一个微量离心管，其中加入 1 毫升 HBSS 溶液配制的 300 微摩尔 DNase。将舌组织转移至试管中，保持缝合线的相同部分悬挂在外。随后在37摄氏度下孵育组织24小时。将样本重新转移至含有氨苄青霉素的无菌PBS广口瓶中，并置于搅拌器上搅拌24小时。孵育结束后，将制备好的舌细胞外基质（TEM）保存在无菌 PBS 中，于 4°C 下保存备用。为重建静态的舌鳞状细胞癌（TSCC）模型，将 1 × 10⁶ 个 Cal-27 单细胞接种至 3.5 厘米的培养皿中。加入 3 毫升含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基，其中分别含有 90 微克/毫升的氨苄青霉素和卡那霉素。将细胞在37摄氏度下孵育两到三天，直至达到60%融合度。然后将TEM加入培养皿中的细胞单层。将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育28天。每天更换培养基。取一个10毫升注射器，移除

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舌细胞外基质的制备与舌鳞癌体外重建

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多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

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小鼠舌上皮细胞的分离与培养：一种从小鼠模型中分离和培养舌上皮细胞的操作方法

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由成纤维细胞构建的组织工程天然基质是一种新兴工具，可用于生成支持上皮细胞增殖和分化的间质基底。本文介绍了一种应用该方法评估不同类型间质细胞对肿瘤细胞生物学特性影响的实验方案。...

肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用

本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。...

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

为了理解头颈部肿瘤的发生机制，需要建立具有头颈部癌症患者特定基因突变的小鼠模型。本文介绍了一种利用腺相关病毒-Cas9系统在体外转化小鼠原代舌细胞的实验方案，以构建具有特定基因组改变的小鼠头颈部癌细胞系。...

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从胚胎第12.5天及8周龄小鼠舌上皮与间充质/结缔组织中分离细胞

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由成年小鼠味觉干细胞衍生的舌类器官的生成与培养

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

本文展示了一种针对口腔内建立的口腔鳞状细胞癌肿瘤进行外科切除的独特方法。...

适用于小鼠口腔鳞状细胞癌临床前模型的转化相关性肿瘤切除模型

学习利用脱细胞技术制备舌细胞外基质，并通过迷你生物反应器进行三维培养，构建舌鳞癌体外重建模型。该方法能更真实地模拟临床肿瘤组织病理特征，为口腔癌研究提供可靠的实验平台。

舌部细胞外基质的制备及舌鳞状细胞癌的重建体外

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舌部细胞外基质的制备及舌鳞状细胞癌的重建 体外

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