Name: 由激光蚀刻大师定制的组织培养模具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习使用激光蚀刻技术快速制作聚二甲基硅氧烷模具，用于构建具有精确几何形状的水凝胶工程组织。该方法成本低、操作简便，可应用于心脏组织工程及再生医学研究。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH R00 HL115123）和布朗大学工程学院提供的资金支持。同时感谢布朗设计工作室和Chris Bull在激光切割机使用方面的培训与支持。

1. 创建矢量格式的母版模具设计
<ol>
	<li>使用矢量图形软件（参见材料、设备和软件表）以矢量格式组装所需的模具几何结构。选择文件 | 新建，创建一个具有适当尺寸且采用RGB颜色格式的画布。使用左侧面板中的形状工具创建所需的几何图形：在窗口顶部输入所需的尺寸（如果初始不可见，请点击顶部的变换按钮）以精确定义形状大小。 
	注意：模具几何结构应在最外层特征边缘与切割线之间预留至少6 mm的边距，以便在模具浇铸后修整PDMS弯月面。这将使成品模具能够与培养皿底部完全贴合。此外，模具几何结构的设计应考虑所用激光切割机型号的相关限制，包括切口宽度（kerf width）和最小特征尺寸。本文所述工作中使用的激光切割机（参见材料、设备和软件表）具有0.2 mm的切口宽度和25 µm的最小蚀刻特征尺寸（最大分辨率为1,000 DPI）。模具尺寸可根据所需的培养容器进行选择，例如10 cm培养皿或6孔板、24孔板。</li>
	<li>打开窗口左上角的颜色选择器，并定义与激光切割软件兼容的新颜色样本。 
	注意：我们使用红色（RGB 255, 0, 0）表示切割，蓝色（RGB 0, 0, 255）表示蚀刻。可根据设计需求定义其他颜色样本（例如，若需要多种蚀刻深度）。
	<ol>
		<li>通过选择路径，然后在颜色选择器中为路径颜色选择切割用颜色样本，同时将填充颜色设为[无]，从而将这些颜色样本分配给切割路径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类似地，通过选择对象，然后在颜色选择器中为填充颜色选择蚀刻用颜色样本，同时将路径颜色设为[无]，从而将颜色样本分配给蚀刻路径。</li>
	<li>根据所使用的矢量图形软件和激光切割机的兼容性，将设计保存为.ai或.pdf文件格式（图1A和补充文件）。</li>
</ol>
2. 激光切割丙烯酸模具母版
<ol>
	<li>选择一种负性母模材料。 
	注意：由于¼英寸厚的丙烯酸树脂与激光切割兼容、成本相对较低，且其厚度可支持高达约5.5 mm的结构，因此非常适合本应用。但也可使用满足以下要求的其他材料：(i) 不与PDMS固化反应；(ii) 对固化后的PDMS无孔隙/具有强粘附性；(iii) 可通过激光切割机干净地切割和蚀刻；(iv) 在高达60 °C时仍保持玻璃态；(v) 厚度与所需的最大特征高度相匹配。</li>
	<li>根据制造商的规格准备激光切割机进行切割。确保使用足够的通风，并将工作台高度正确校准至所选负性母模材料的厚度。</li>
	<li>在连接激光切割机的计算机上，使用矢量图形程序打开设计文件，然后点击 文件| 打印。确保已将激光切割机设置为打印机，并在 缩放 下拉菜单中选择&#34;不缩放&#34;，然后点击打印对话框底部的“打印”按钮，以防止设计发生变形。</li>
	<li>在激光切割机打印工具中，点击右下角的 设置 按钮。为先前选定的每种颜色分配功率、速度和每英寸脉冲数（PPI）参数，以设定所有设计特征的切割/蚀刻参数。 
	注意：此处使用配备75 W激光器的激光切割机（参见 材料、设备和软件表），其参数设置如下：100% 功率、1% 速度、1,000 PPI 可干净切割¼英寸丙烯酸树脂；100% 功率、8% 速度、500 PPI 可在丙烯酸树脂中蚀刻至2.75 mm深度；100% 功率、5% 速度、500 PPI 可在丙烯酸树脂中蚀刻至3.50 mm深度。若激光切割机配置或材料的参数未知，可通过试件进行试验和误差法经验确定这些参数。</li>
	<li>点击激光切割软件中的大型绿色按钮，对负性母模进行激光蚀刻和切割。</li>
	<li>通过使用小刷子和/或压缩空气清除残留的切割碎屑，为PDMS浇铸准备负性母模（图1B）。</li>
</ol>
3. 为细胞或组织培养准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具
<ol>
	<li>根据制造商的说明制备PDMS浇铸混合液。每平方厘米准备0.35 mL2 主模具的；这将根据模具的特征和高度而变化。</li>
	<li>在连接至标准实验室真空管线的真空腔室中对制备好的PDMS进行脱气处理&#60;500 mmHg 下持续 1 小时，或直至所有气泡完全消除。</li>
	<li>用乙烯基胶带或美纹纸胶带（彩色标签胶带效果较好）粘贴模具的外边缘，使胶带延伸 &#62;负主模刻蚀面以上3 mm处。将胶带紧紧按压在模具侧面，以防止后续发生泄漏。 
	注意：如果丙烯酸原模具有通孔，可能还需要在模具底部贴上胶带（图1C).</li>
	<li>将脱气后的PDMS倒入负向模具的蚀刻面。 
	注意：目标PDMS厚度取决于具体应用，但过厚的PDMS模具底部可能会影响成像。约1.5 mm的最小厚度在成像效果与模具脱模便利性之间达到了良好平衡。</li>
	<li>将涂有PDMS的负性母模放入真空室，再次抽真空1小时，或直至所有气泡完全消除。</li>
	<li>将脱气后的PDMS涂层阴模放入60 °C烘箱中固化至少6小时。确保烘箱搁板水平。或者，可在37 °C下过夜固化，或在室温下固化约72小时。</li>
	<li>若在同一块负主模具上制备了多个模具，需在这些模具仍附着于负主模具时，使用剃刀片将它们切割分离。随后，将每个PDMS模具从负主模具上小心剥离。收集PDMS模具时应缓慢且谨慎，以防止模具结构在剥离过程中发生撕裂。</li>
	<li>使用剃刀刀片修剪掉铸模中带有弯月面的区域，这些区域会妨碍模具平整放置，同时去除任何多余的材料或碎屑图1D).</li>
	<li>必要时，通过高压灭菌制备用于细胞/组织包埋的模具。</li>
</ol>
4. 制备胶原蛋白和纤维蛋白水凝胶组织
注意：采用适当的无菌操作程序以维持无菌状态。
<ol>
	<li>将模具粘附到所需容器的底部。通过将模具牢固地按压在未经组织培养处理的塑料表面，使新模具粘附于非组织培养处理的培养板底部（由于PDMS具有疏水性）。 
	注意：然而，如果使用经组织培养处理的聚碳酸酯材料，或重复使用的模具（其粘附性通常较弱），可使用天然或合成胶水（如纤维蛋白或经 overnight 固化的硅胶密封剂）以确保固定。</li>
	<li>配制纤维蛋白原、凝血酶和中和后的胶原蛋白浇铸溶液，使每种成分在最终形成的组织中达到所需浓度。胶原蛋白在浇铸前应始终保持在冰上。 
	注意：纤维蛋白原与凝血酶应避免在浇铸前过早混合。如有必要，也可将纤维蛋白原和凝血酶溶液冷藏以延长聚合时间。我们通常使用的终浓度范围为：纤维蛋白原 0–8 mg/mL，凝血酶 10–100 U/mL，胶原蛋白 0.8–2.0 mg/mL（图2）。对于工程化心肌组织，我们常使用心肌细胞浓度为 12 × 106 个细胞/mL，胶原蛋白 1.6 mg/mL，纤维蛋白原 4 mg/mL，凝血酶 20 U/mL（凝血酶在浇铸前立即加入）。最佳浓度（甚至超出上述建议范围）需通过实验确定。</li>
	<li>按照标准操作流程收获细胞，并重悬于适当浓度的溶液中，以达到目标组织中的初始细胞密度。 
	注意：人诱导多能干细胞来源的心肌细胞的收获方法参见 Lian et al.9。收获后的细胞应置于冰上保存。配制细胞悬液时应考虑细胞本身所占体积。我们使用的细胞浓度范围为 9–18 × 106 个细胞/mL，但最佳范围可能因细胞群体不同而有所差异（图2）。</li>
	<li>将纤维蛋白原、中和后的胶原蛋白和细胞悬液混合（参见步骤4.2示例），制备成浇铸混合液。浇铸混合液应始终保持在冰上。 
	注意：纤维蛋白原和凝血酶的温度与浓度将决定其聚合动力学；为防止在浇铸过程中提前聚合，可能需要根据待浇铸结构的数量和体积，分批制备浇铸混合液。</li>
	<li>在浇铸前对模具中将接触浇铸混合液的表面进行处理，以减轻PDMS的疏水性（PDMS的疏水性会增加蛋白质吸附，使浇铸困难）。
	<ol>
		<li>通过氧等离子体处理实现亲水性表面修饰，例如使用手持式高频发生器（例如，Litton Engineering 的 BD-20A）。在浇铸前约5分钟，对模具中所有接触细胞/凝胶混合物的表面进行等离子体处理，时间为3–5秒。</li>
		<li>或者使用表面活性剂处理，如 Pluronic F-127（1% w/v）10。表面处理应尽可能接近浇铸时间进行，因为极性改变会随时间逐渐减弱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在浇铸前立即向浇铸混合液中加入凝血酶，并通过上下吹打充分混匀，注意避免引入气泡。</li>
	<li>迅速操作，用移液器将浇铸混合液注入模具中，注意确保混合液填充至模具的所有角落和缝隙。移液时避免按压移液器至第二档，以防在结构内部形成气泡。</li>
	<li>如有需要，对其他批次的浇铸混合液重复步骤4.6和4.7。</li>
	<li>将组织培养容器放入37 °C培养箱中孵育45分钟。若培养箱湿度不足，应在孵育前在模具周围加入细胞培养基，以防止结构脱水。 
	注意：培养基类型取决于细胞种类，但对于工程化心肌组织结构，我们使用 RPMI 1640 + B27 补充剂。</li>
	<li>45分钟后，将结构移回超净台，并覆盖细胞培养基后重新放回培养箱。</li>
	<li>根据细胞类型和结构类型，每48–72小时更换一次细胞培养基。 
	注意：培养基更换应遵循供应商推荐的操作说明，以确保细胞最佳健康状态。更换培养基时应小心操作，避免扰动结构。我们未观察到结构漂浮的问题，但若发生此情况，可通过在模具设计中增加高于液面的高柱结构来预防。</li>
	<li>使用后，依次用10%次氯酸钠、70%乙醇和蒸馏水清洗模具。然后晾干，并可高压灭菌后重复使用约10次。</li>
</ol>
5. 分析技术：组织压缩
注意：由基质重塑引起的致密化是组织存活性和发育的一个指标，可通过光学显微镜和图像分析轻松测量。
<ol>
	<li>在浇铸后2小时至96小时的不同时间点，采集模具中构建物的光学显微镜图像。 
	注意：由于所需放大倍数较低，配备相机接口的体视显微镜非常适合此应用。</li>
	<li>使用ImageJ（开源软件，imagej.nih.gov/ij/）等图像分析软件勾画出图像中可见的构建物区域。</li>
	<li>分析收缩速率及最终收缩程度（图2）。</li>
</ol>
6. 分析技术：拉伸测试
注意：活性力学（由细胞活动引起的工程化组织自身产生的力或应变）和被动力学（在施加的应变或力作用下产生的力或应变）是许多工程化组织的关键功能特性，对于工程化心肌组织而言尤其如此。用于分析的微力学分析仪详见材料表。其他力学测试装置也可类似使用，前提是其支持水合状态下的测试，并能够在与组织相关的范围内实现长度控制和力的测量，且具备足够的分辨率。对于横截面积约为数平方毫米、刚度约为数十 kPa 的组织，5 mN 的负荷传感器较为合适。更大或更刚硬的材料则需要更大量程的负荷传感器。测试前，应确保力传感器和长度控制器均已正确校准。
<ol>
	<li>打开长度控制器、力传感器、脉冲发生器和温度控制器。</li>
	<li>用Tyrode's溶液（含1.8 mM氯化钙、1.0 mM氯化镁、5.4 mM氯化钾、140 mM氯化钠、0.33 mM磷酸钠、10 mM HEPES和5 mM葡萄糖的ddH2O溶液，pH调至7.4）填充用于工程化心肌组织的机械测试槽。调节热电偶，使浴液温度达到37 °C。</li>
	<li>加载用于采集主动收缩数据的机械测试程序。 
	注：我们采用长度阶跃程序评估主动收缩力学性能，该程序以5%应变递增至30%，每个阶跃维持120秒，以评估应变对收缩力的影响（图3A）。此外，我们还通过以10%应变/分钟的恒定应变率进行拉伸至断裂的程序来评估被动力学性能（图3B）。这两个程序均可作为主动和被动力学分析的良好起点。</li>
	<li>在解剖显微镜下，小心地将工程化组织构建物从PDMS模具上分离，使其自由漂浮。 
	注：已完成组织致密化的细胞化构建物通常已从模具内表面脱离，此类情况下仅需极少操作。
	<ol>
		<li>若致密化未导致构建物释放，则使用镊子轻轻将其从模具侧壁和底部分离，以避免损伤组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子轻轻夹起构建物，并将其转移至机械测试槽中。</li>
	<li>通过解剖显微镜观察构建物，将其两端固定在连接于力传感器和杠杆臂的挂钩上。</li>
	<li>使用显微操作器调节杠杆臂位置，直至构建物处于无施加应变的状态。将长度控制器和力控制器归零。</li>
	<li>通过解剖显微镜对构建物成像，以便通过图像分析测量其尺寸。</li>
	<li>启动主动力测试程序，在程序完成后保存采集的数据（图3）。</li>
	<li>如需同时获取被动力学数据，则再次调节杠杆臂至无施加应变状态。将长度和力控制器归零，并在加载并启动被动力学测试程序前再次对构建物成像（图3）。保存采集的数据。</li>
</ol>
7. 分析技术：石蜡组织学与免疫组织化学
注意：在对工程化组织切片进行成像时，我们发现使用石蜡包埋块的效果最佳，因为这样能最好地保存组织形态。整个流程的每个步骤都必须仔细考虑并根据工程化组织的特点进行优化，包括在无真空或压力条件下处理样本、通过实验确定合适的抗原修复方法，以及对一抗浓度进行滴定。其他技术方法，例如使用冷冻包埋块制备切片，可能耗时更短、成本更低，且根据具体应用需求，亦可获得足够理想的实验结果。
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，使用镊子沿工程化组织构建物与聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具之间的界面轻轻滑动，小心地将构建物从PDMS模具上分离，使其自由悬浮。将这些构建物转移至微量离心管中以进行固定。 
	注意：对于较脆弱的构建物，或需在模具提供的静态应力条件下固定的样本，可通过更换培养孔中的溶液在模具内直接固定，待固定完成后再将构建物从模具中取出。</li>
	<li>立即用4%多聚甲醛（PF）在室温下固定工程化组织10分钟。固定时间建议不超过每1 mm组织厚度1小时；避免过度固定。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织。</li>
	<li>保持组织湿润，滴加一滴伊红染色液使其染成粉红色，染色10–30秒后用70%乙醇冲洗。 
	注意：染成粉红色有助于后续在石蜡包埋块中识别组织位置，该颜色将在脱蜡过程中被洗去。</li>
	<li>用镜头纸包裹组织，并放入组织学包埋盒中。根据需要在包埋盒内使用泡沫垫片以保持组织平整。</li>
	<li>将包埋盒浸入70%乙醇中，并于4 °C保存，直至进行石蜡处理。</li>
	<li>通过梯度乙醇脱水处理组织（依次为70%、95%和100%乙醇，每个浓度处理两次，每次30分钟）。随后将样本依次浸入三缸二甲苯中，每缸30分钟。</li>
	<li>将样本依次浸入三缸石蜡中，每缸30分钟。</li>
	<li>预热包埋盒，小心展开并从镜头纸上取出经伊红染色的组织，将已浸透石蜡的组织包埋于石蜡块中。注意将样本平整地放置于模具底部，以便后续切片操作。</li>
	<li>使用切片机按所需厚度（5–8 µm）对组织进行切片，并采用针对工程化组织优化的标准流程进行染色（图4）。 
	注意：除石蜡切片外，也可选择冷冻切片，但可能影响样本形态学质量。将固定后的构建物置于含30%蔗糖的PBS中3小时，或直至组织充分平衡（例如，过夜）。随后更换为体积比50/50的30%蔗糖与最佳切割温度（OCT）包埋剂混合液，孵育1小时。将构建物置于OCT包埋剂中，使用70%乙醇与干冰混合物在塑料模具中快速冷冻成块。使用恒冷切片机将冷冻块切为10–50 µm厚的切片。</li>
</ol>
8. 分析技术：细胞排列
注意：调控组织形态和内部应力场可以调节细胞排列方向，而细胞排列是许多天然组织的显著特征。
<ol>
	<li>在具有目标几何形状的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中制备工程化组织构建体。</li>
	<li>培养期结束后，用 PBS 清洗构建物，用 4% PF 固定（见步骤 7.2），收集构建物，以备切片和组织学成像（见第 7 节）或整体染色使用。 
	注意：整体染色的步骤与组织学/免疫组织化学类似，但需要更长的孵育时间；染料、抗体以及成像技术（如光线对构建物的穿透深度）的穿透深度需根据构建物的组成通过实验确定。</li>
	<li>将组织切片定位在水平面（与模具底部平面平行），并对目标细胞的标记物进行染色。可使用F-肌动蛋白标记物（如鬼笔环肽）标记大多数细胞类型的肌动蛋白应力纤维，或选择使用特定细胞的标记物。 
	注意：对于工程化心肌组织，通过用α-肌动蛋白素染色的肌节来确定取向。</li>
	<li>手动或使用分析工具评估感兴趣区域内所有细胞或细胞核的长轴例如，ImageJ，MATLAB） 
	注意：根据几何形状（例如 &#34;节点&#34; 和 &#34;束&#34; 呈网状几何结构的区域，或 &#34;核心&#34; 和 &#34;边缘&#34; （呈环形几何结构）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与组织培养兼容的定制化PDMS模具几何结构在调控工程化组织的重要特性（如细胞取向、扩散速率和有效刚度）方面具有重要用途。此外，这些模具在制备需要特定几何形状进行分析应用的组织时也非常有用，例如力学测试16,17。利用激光切割制备的阴模母模来加工这些装置，是一种快速、简便且低成本的方法，尤其相较于传统微加工所需的时间和成本而言更具优势。激光切割还允许更大的最大模具尺寸，仅受限于切割机工作台的尺寸。我们已成功将这些多功能模具应用于多种工程化心肌组织的研究，包括动作电位传播的光学标测、收缩力产生及被动力学特性的评估，以及在心肌梗死大鼠模型中的移植实验13,18。我们认识到，除心血管再生工程这一研究领域外，该技术在组织工程、药物递送和材料研究等领域也具有广泛的应用前景。
尽管模具本身的制备过程在技术上并无太多难点，但构建功能性组织涉及若干关键步骤。如果构建物...

在过去的二十年中，软光刻技术已被广泛用作支持科学研究的一种制造技术，尤其在微流控、材料研究和组织工程领域1,2,3。复制模塑技术通过使用具有所需形状的负向母模来制备相应形状的物体，为制备可用于成型水凝胶的正向PDMS复制品提供了一种方便且低成本的方法。然而，所需的负向母模通常需借助微加工技术制备，这类方法成本高、耗时长、尺寸受限，且需要洁净室空间和精密设备。尽管3D打印提供了一种潜在的替代方案，但其应用仍受到限制：低成本3D打印机的分辨率有限，且常用3D打印聚合物与PDMS之间存在化学相互作用，可能抑制PDMS的固化过程。
近年来，能够切割和蚀刻塑料、木材、玻璃及金属等材料的激光切割系统价格大幅降低，因此在科研工具的制造中变得更加普及。商用级激光切割机能够制造厘米尺度的物体，其最小特征尺寸可小于25 µm，且使用时所需培训、专业知识和时间均极少。尽管此前已有研究利用激光消融聚二甲基硅氧烷（PDMS）来制备微流控器件，但据我们所知，尚无文献描述通过激光切割负向母模来制备毫米和厘米级模具的方法4。
我们主要利用该技术调控工程化组织的形态，以改善营养物质扩散、细胞排列以及机械性能5,6,7。然而，该技术具有广泛的适用性，可应用于任何涉及模制水凝胶的领域，例如药物递送和材料科学研究8。只要有激光切割仪，即可制备几乎任意几何形状的PDMS模具复制品，只要该形状无悬垂结构（否则将难以脱模，除非使用多部件模具，但后者不在本文讨论范围内），且尺寸适配激光切割平台即可。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;项目&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F8630-5G</td><td>构建物</td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T6634-250UN</td><td>构建物</td></tr><tr><td>牛抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>10820-25MG</td><td>构建物</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I，4 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5153-100MG</td><td>构建物</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>构建物</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>构建物</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>构建物</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体</td><td>Corning</td><td>4019862</td><td>PDMS 模具</td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>Fisher</td><td>15-901-5R</td><td>PDMS 模具</td></tr><tr><td>丙烯酸，1/4&quot; 厚</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K356</td><td>PDMS 模具</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液，1 M</td><td>Sigma</td><td>H3537-100ML</td><td>构建物</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，粉末</td><td>Fisher</td><td>31800-089</td><td>构建物</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Fisher</td><td>AC423520250</td><td>构建物</td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Fisher</td><td>M33 500</td><td>构建物</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>构建物</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Sigma</td><td>S9390-500G</td><td>构建物</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G5767-25G</td><td>构建物</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>组织学</td></tr><tr><td>冷冻包埋模具</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>组织学</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Fisher</td><td>3530 1</td><td>组织学</td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td>Fisher</td><td>AC152880250</td><td>组织学</td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Fisher</td><td>AC410530250</td><td>组织学</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td>矢量图形</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>(开源)</td><td></td><td>矢量图形</td></tr><tr><td>UCP（通用控制面板）</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td>激光切割机接口</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS6.75 激光切割机</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td>激光切割机</td></tr><tr><td>微机械分析仪</td><td>Aurora Scientific</td><td>1530A 配 5 mN 负荷传感器</td><td>力学分析</td></tr></tbody></table>

基于激光蚀刻母模定制的组织培养模具

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

随着组织工程领域不断发展并趋于成熟，人们对包括组织形态在内的多种组织参数产生了日益浓厚的兴趣。在微米至厘米尺度上调控组织形态，可引导细胞排列方向，改变有效的力学性能，并解决与营养物质扩散相关的局限性。此外，组织制备所用容器可能对组织施加力学约束，从而产生应力场，进一步影响细胞与基质结构。具有高度可重复尺寸的成型组织在 体外 样品尺寸至关重要的检测，例如整个组织的力学分析。
本文描述了一种利用激光蚀刻丙烯酸材料制备的负性母模的替代性 fabrication 方法：该模具与聚二甲基硅氧烷（PDMS）兼容性良好，可实现厘米尺度的结构设计以及特征尺寸小于25 µm的微细结构，且能够在低成本和无需专业技术的条件下快速设计和制备。由于所需时间和成本极低，可对激光蚀刻模具进行快速迭代，直至确定最优设计，并可轻松调整以适应任何感兴趣的检测方法，包括组织工程领域之外的应用。

激光切割机的光学特性会导致蚀刻区域的尺寸随着蚀刻深度的增加而略微减小，并由于激光束的锥度效应，使模具侧壁形成极轻微的斜面。这有助于脱除浇铸的PDMS模具，但在制作蚀刻较深的负型母模时应予以仔细考虑。&gt;6 mm）是必需的（图1).
在培养过程中，由于基质重塑，细胞化构建体会随时间发生收缩，但其收缩速率和程度取决于支架成分、细胞接种量以及培养条件。
基质重塑可通过周围基质的重新排列和降解（以及新基质的沉积）发生，但通常由于横截面积减小而伴随机械刚度的增加。由1.6 mg/mL胶原和12 x 10⁶6 心肌细胞/mL，我们观察到在浇铸后的四天内，构建物收缩至其初始宽度的19.7 ± 2.8%图2</strong...

本文介绍了一种快速、简便且低成本的方法，用于制备定制的聚二甲基硅氧烷模具，该模具可用于制造具有复杂几何结构的基于水凝胶的工程化组织。我们还描述了采用该技术制备的工程化心肌组织的力学性能和组织学评估结果。

随着组织工程领域不断发展并日趋成熟，人们对组织的各种参数产生了日益广泛的关注，包括组织……

该方法可促进组织工程领域在组织发育、细胞排列以及聚合物和工程组织力学分析方面的研究。该技术的主要优势在于成本低、操作简便且快速高效。我们在实验室中开发该技术，是因为当时领域内尚未实现对工程组织在毫米至厘米尺度上的几何控制，而我们认识到在扩大工程组织尺寸方面亟需进行转化性思考。该技术使我们能够通过使用微柱和多种形状的结构，利用几何队列对细胞生理学和工程化组织带来的优势。该方法有助于深入了解具有可控尺寸、形状和取向排列的工程化组织的构建。此外，该技术还可应用于多种疾病模型、个性化再生医学，以及工程化组织向临床前研究的转化。首先在计算机上打开一个矢量图形软件。为准备所需的模具几何形状和矢量格式，在窗口中以 RGB 色彩模式创建一个具有适当尺寸的新画布。然后，从左侧面板选择形状工具，通过在窗口顶部输入尺寸来创建所需的几何形状，以精确定义形状的大小。设计模具几何结构时，需确保最外侧特征边缘与切割线之间留出至少六毫米的边距，以便在模具浇铸后修整PDMS弯月面。这将使成品模具能够与培养皿底部完全贴合。接下来，打开窗口左上角的颜色选择器，定义与激光切割机软件兼容的新颜色样本。选择每条路径，并从色样中为其分配合适的颜色。完成后，将填充颜色设置为“无”。类似地，通过选择对象，然后从颜色选择器中为填充颜色选择蚀刻路径的色样颜色，路径颜色设置为“无”，从而为蚀刻路径分配色样颜色。根据所使用的矢量图形软件和激光切割机的要求，将设计保存为 ai 或 pdf 文件格式。按照制造商的说明准备激光切割机进行切割，并确保使用足够的通风条件。然后将一块 1/4 英寸厚的丙烯酸板放置在激光切割机的工作台上。调节工作台高度，使其与丙烯酸板正确校准。接着，在连接激光切割机的计算机上打开设计文件，并打开打印菜单。确保将激光切割机设置为打印机，并在“缩放”下拉菜单中选择“不缩放”，以防止设计发生变形。然后，单击打印对话框底部的“打印”按钮。在激光切割机打印工具中，单击设置按钮，为设计中的每个特征设置切割和蚀刻参数。在此处，为之前选定的每种颜色设置功率、速度和每英寸脉冲数参数。输入参数后，点击激光切割软件中的大型绿色按钮。这将启动激光切割机，开始刻蚀并切割负向主模具。最后，使用小刷子或压缩空气清除阴性母模上的任何残留碎屑。这将为PDMS浇铸做好表面准备。根据制造商的说明制备PDMS浇铸混合物。将制备好的PDMS放入连接标准实验室真空管线的真空腔中脱气一小时，或直至所有气泡完全消除。在PDMS脱气过程中，使用乙烯基胶带或遮蔽胶带缠绕模具外缘，使胶带至少高出阴性主模具的蚀刻面三毫米。务必用力将胶带紧贴模具侧面，以防止后续出现泄漏。接下来，将约每平方厘米0.35毫升的PDMS倒入母模中，使PDMS的厚度至少达到1.5毫米。将涂有PDMS的负性母模放入真空腔中，再次抽真空约一小时，或直至所有气泡完全消除。随后，将脱气后的涂有PDMS的负性母模置于60摄氏度烘箱内的水平架子上，至少固化六小时，以完成PDMS的固化。固化后，使用剃刀刀片在仍位于负主模具上的情况下将各个模具切开。然后，缓慢而小心地将每个PDMS模具从负主模具上剥离。修剪掉因浇铸形成的弯月面区域，以免影响模具平整放置，同时去除任何多余的材料或碎屑。最后，使用标准高压灭菌循环对模具进行高压灭菌，以使其达到组织培养的无菌要求。首先，将模具粘附到未经处理的塑料培养板上。按照随附的文字实验方案所述，制备纤维蛋白原、凝血酶和中和后的胶原蛋白溶液，并收获所需细胞。将纤维蛋白原、中和的胶原蛋白和细胞悬液混合，制备浇铸混合液。将浇铸混合液置于冰上保存。接着，使用手持式高频发生器处理模具中将接触浇铸混合液的表面，以降低PDMS的疏水性。在浇铸材料前约五分钟，将表面进行等离子处理3至5秒。在浇铸蛋白细胞混合物之前立即向浇铸混合液中加入凝血酶，并轻轻吹打混匀，避免引入气泡。操作需迅速，用移液器将浇铸混合液小心注入模具中，确保混合液填充至模具的所有角落和缝隙。避免将混合液推出移液器的第一档之外，以防止在构建物内部产生气泡。然后，将样品放入37摄氏度的湿润培养箱中孵育45分钟。45分钟后，将构建物移回生物安全柜中，并用细胞培养基覆盖后再次放回培养箱。根据细胞类型和构建物类型，每 48 至 72 小时更换一次细胞培养基。最后，参照随附的文字实验方案，定量分析构建物的组织收缩程度和拉伸性能，并进行多种染色技术处理，以测量细胞排列情况。随着时间推移和培养过程的进行，含细胞的构建物会因基质重塑而发生收缩。这一过程通过周围基质的重组和降解实现，通常伴随着机械刚度的增加。定向压缩还可诱导组织内部产生应力场，可在含细胞的构建物中加以调控，以促进细胞的定向排列。这两幅图像来自在两端带有支柱的 3 毫米 × 17 毫米矩形模具中培养的心脏组织构建物。这两个图像是无约束条件下培养的心脏组织构建物。而受到约束的两个构建物只能在剩余的两个方向上发生收缩，从而导致应力诱导的细胞定向排列。一旦掌握该技术，可在不到一天的时间内完成定制化组织模具的设计、制备与应用。组织形成后，可进行其他方法，如力学测试和组织学分析，以进一步理解排列对细胞形态和组织功能的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用激光切割的丙烯酸模具母版制备定制的PDMS组织模具。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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