高通量鉴定协同药物组合的Overlap²方法

本方法的总体目标是通过高通量筛选，鉴定出具有协同作用的分子，即联合使用时可相互增强活性的分子。协同作用的药物组合是应对耐药性感染的一种有前景的策略，但这类组合难以发现。该方法可用于鉴定与现有抗感染药物相互作用的分子，这些药物常用于治疗传染性疾病。

从长远来看，这些组合可进入临床前评估阶段，并最终改善患者治疗。该技术的主要优势在于，它可以针对任何感兴趣的生物体，并结合任何小分子文库进行。该技术的应用前景广泛，可拓展至多种传染病的治疗，因为它适用于任何感兴趣的生物体。

使用标准电子表格计算所有突变株在添加特定浓度小分子条件下的平均生长评分及标准差。随后，计算每个小分子浓度对应的 Z 分数。然后，标出具有显著 Z 分数的基因突变株。

首先，在M9最小培养基中于37摄氏度下培养大肠杆菌（E.coli）过夜。然后，将小分子溶解于二甲基亚砜中，浓度高于每毫升10毫克。接着，向96孔板的每个孔中加入100微升M9培养基。

在第一列中再加入100微升M9培养基，使该列中的总体积达到200微升。然后，在第一列中加入约10微升浓缩的小分子溶液。加入小分子后，开始沿培养板的X轴方向进行梯度稀释。

继续稀释，直至第11列中剩余100微升。混匀第11列后，弃去该列中的100微升。第12列中仅保留培养基，用于数据归一化。

接着，测定在M9最小培养基中过夜培养的菌液在600纳米处的光密度值。然后，向每个孔中加入2 µL菌液，使每孔细胞数量达到1000个。

然后，轻轻摇动培养板。记录零小时时间点在600纳米处的光密度读数。记录读数后，将培养板在37摄氏度下孵育一天。

再次测量24小时时间点在600纳米处的光密度值。为进行棋盘式实验，将大肠杆菌（E.coli）培养物在M9最低培养基中于37摄氏度过夜培养。然后，向96孔板的每个孔中加入100微升M9培养基，并在第一列的每个孔中额外加入100微升相同的培养基。

接下来，在第一列的每个孔中加入待测小分子，并在 A1 孔中加入两倍浓度的小分子。然后，通过从第一列向第二列转移 100 微升，沿 X 轴建立梯度稀释。继续稀释过程，直至在第 11 列中加入 100 微升。

混合第11列后，弃去该列100微升液体，并使第12列仅保留不含任何药物的培养基。为第二种药物稀释创建另一个梯度。具体操作为：在A行加入100微升含有两倍最小抑菌浓度目标分子的培养基。然后，将100微升液体从A行转移至B行。继续进行梯度稀释，直至在G行加入100微升液体。混合G行后，弃去该孔中的100微升液体。

然后将两微升培养物接种到每个孔中，使每孔含有1000个细胞。接着，在零小时时间点测定600纳米处的光密度读数。

记录读数后，将培养板在37摄氏度下孵育24小时。然后，测定24小时时间点在600纳米处的光密度值。为进行高通量筛选以寻找协同药物，需在M9最小培养基中同时培养野生型和协同作用预测突变型细胞。

然后，将文库中的药物加入培养基中。接着，用野生型细菌接种一个含药物文库的平板，另用协同作用预测突变型细菌接种另一个平板。该平板代表用于研究药物协同作用的棋盘式实验。

在此平板中，F9 孔的 FICI 分值最低，为 0.07，表明该小分子组合具有协同作用。此平板代表棋盘格实验，用于研究无相互作用的药物组合。在此平板中，C3 孔的 FICI 分值最低，为 1.0，表明该小分子组合之间无相互作用。

该平板表示用于研究拮抗性药物组合的棋盘式稀释法实验。在此平板中，A1 孔的 FICI 分数最低，为 8.0，表明药物分子之间的相互作用具有拮抗性。接下来，使用氟康唑中的小分子药物布雷菲德菌素 A（Befeldin A）来研究 C 和 U 型 formin 蛋白的生长。

该图显示，野生型和协同作用预测突变体的生长均受到轻微且程度相同的抑制。这表明Befeldin A与Fluconazole并非协同作用的药物组合。相反，在Refromisyn和Fluconazole存在的情况下，C型和U型Formin的协同作用预测突变体的生长受到显著抑制。

表明这两种药物具有协同作用。有趣的是，野生型的生长完全未受到抑制。此处观察到最大的生长差异，出现在接种后32至49小时之间。

一旦掌握，该技术可缩短鉴定协同药物相互作用所需的时间。在进行此操作时，需注意切勿在棋盘格实验的最后一行和最后一列中混合药物。完成此操作后，还可采用其他协同分子鉴定方法，以进一步识别更多的协同药物相互作用。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用 O2M 方法识别潜在的协同作用标志物，从而在您感兴趣的生物体中发现协同药物相互作用。请务必注意，某些小分子的操作可能存在危险性，在执行本实验方案时，应严格遵守材料安全数据表（MSDS）中的所有安全预防措施。