Name: 微流控装置中组织模型的 Perfusable 血管网 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习使用微流控平台在球状体中构建可灌注血管网络的方法。该技术利用PDMS预聚物铸造和细胞接种，实现体外药物递送模拟，为再生医学中的血管网络研究提供重要工具。

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本研究工作得到了日本科学技术振兴机构（CREST JST）（项目编号 JPMJCR14W4）、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（项目编号 25600060、16K16386）、日本文部科学省（MEXT）与科学技术振兴机构（JST）联合资助的创新中心计划（COI Program）、日本医疗研究开发机构（AMED）“聚焦关键评价技术研发项目”以及水户基金会（Mizuho Foundation for the Promotion of Sciences）的支持。微细加工技术得到了京都大学纳米技术枢纽平台（Kyoto University Nano Technology Hub）的支持。

1. 微流控装置模具的制备
<ol>
	<li>使用市售软件（Clewin5 或 AutoCAD 2016）设计微流控装置的图案， 等等。有关 Clewin5 的功能，请参见用户手册（http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual）。 
	注意：设计文件可在 补充文件 1.</li>
	<li>将设计文件传输至微图形发生器，并将涂有正性光刻胶的铬掩模装入设备中。</li>
	<li>使用微图形发生器在图形区域曝光正性光刻胶。</li>
	<li>使用显影剂显影正性光刻胶（材料表）并用去离子水（DI 水）冲洗掩膜。</li>
	<li>使用铬蚀刻剂（材料表），刻蚀掉正性光刻胶被去除后暴露出的铬层。用去离子水冲洗掩模。</li>
	<li>使用丙酮去除掩模上残留的光刻胶。 
	注意：透明掩膜可作为铬掩膜的替代品。</li>
	<li>准备一块洁净的硅片（4 英寸，P(100)），以 3,000 rpm 的转速旋涂六甲基二硅氮烷（HMDS）30 秒。</li>
	<li>在120 °C下软烘HMDS 5分钟，然后在室温下冷却晶圆5分钟。</li>
	<li>旋涂负性光刻胶（材料表500 转/分钟下振荡 10 秒，随后 1,200 转/分钟下振荡 30 秒。 
	注意：旋涂工艺条件应确保在光刻后晶圆上的光刻胶层厚度约为 100 µm。</li>
	<li>将负性光刻胶在95 °C下预烘45分钟，然后将晶圆在室温下冷却60分钟。</li>
	<li>在每次实验中检查紫外光强度，并计算达到250 mW/cm总曝光能量剂量所需的曝光时间2将光掩模（步骤1.1-1.6）放置在晶圆上，并用紫外光照射。</li>
	<li>将负性光刻胶在65 °C下后烘1分钟，再在95 °C下后烘5分钟。让晶圆在室温下冷却1分钟。</li>
	<li>在第一种显影液中显影负性光刻胶层 15 分钟材料表）中清洗2分钟。将晶圆在第一份异丙醇（IPA）溶液中冲洗10秒，随后在第二份IPA溶液中冲洗10秒。</li>
	<li>将负性光刻胶在200 °C下硬烘焙30分钟，然后将晶圆在室温下冷却5分钟。</li>
	<li>使用表面轮廓仪测量负性光刻胶层的厚度。</li>
	<li>将晶圆置于连接真空泵的干燥器中，加入200 µL硅烷（三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷）。开启真空泵抽气10分钟，然后关闭泵，将晶圆在干燥器中静置4小时。</li>
</ol>
2. PDMS 层的制备步骤与组装
<ol>
	<li>将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物（PDMS基体：固化剂 = 10:1（w/w））浇铸后，在真空腔中脱气2小时。</li>
	<li>在通风烘箱中80°C条件下固化PDMS，过夜。</li>
	<li>将PDMS从硅晶圆上剥离下来。</li>
	<li>打孔1A - 3B（图1）及球形体培养孔。使用直径为2 mm的打孔器处理孔1A - 3B，使用直径为1 mm的打孔器处理球形体培养孔。</li>
	<li>使用胶带通过反复粘贴和剥离的方式清洁PDMS片层和玻璃盖玻片（24 mm × 24 mm）。随后将PDMS片层用空气等离子体处理40秒（40 mW，50 sccm）。</li>
	<li>将PDMS片层键合到玻璃盖玻片上，以排除PDMS片层与盖玻片之间界面的气泡，并在80°C下固化至少12小时。</li>
</ol>
3. 类球体准备
注意：在本研究中，分别使用表达红色荧光蛋白的人脐静脉内皮细胞（RFP-HUVECs）和表达绿色荧光蛋白的 HUVECs（GFP-HUVECs）构建球状体和微通道，以便在形成可灌注血管网络后区分 HUVECs 的来源。如果无需追踪 HUVECs 的来源，则使用未标记的 HUVECs 即可满足实验需求。
<ol>
	<li>解冻RFP-HUVECs（3.0 × 105 个细胞/管）和人肺成纤维细胞（hLF）（1.0 × 106 个细胞/管），并分别加入10 mL内皮细胞和成纤维细胞培养基中（材料表）。在37 °C、5% CO2条件下，于100 mm培养皿中培养2–3天，直至RFP-HUVECs和hLF达到亚融合状态。此制备过程可获得约200个球状体。</li>
	<li>用2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA将RFP-HUVECs和hLF从培养皿中消化下来，并加入4 mL含10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM终止胰酶反应。</li>
	<li>在220 × g条件下离心3分钟，弃去上清液，将RFP-HUVECs和hLF分别重悬于内皮细胞培养基中，最终细胞浓度分别为2.5 × 104 和1.0 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>轻柔地将200 µL细胞悬液（每孔含5,000个RFP-HUVECs和20,000个hLFs）加入超低吸附表面的96孔板中，每孔加一剂。</li>
	<li>将96孔板置于37 °C、5% CO2条件下培养2–4天。 
	注意：由于球状体直径取决于96孔板中的培养时间和初始接种细胞数量，因此可通过这两个参数进行调控。</li>
</ol>
4. 微流控装置中的细胞接种
注意：孔、通道和球状体孔的命名规则如图1所示。我们将细胞接种至微流控装置完成的那一天定义为第0天。实验时间线的示意图见图2。
<ol>
	<li>第-1天）类球体接种 
	注意：以下步骤应在冰上操作，以防止胶原蛋白和纤维蛋白发生凝胶化。
	<ol>
		<li>将纤维蛋白原溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为2.80 mg/mL的溶液。</li>
		<li>根据制造商说明书制备中和的胶原蛋白（3.0 mg/mL，溶于PBS）。</li>
		<li>将每反应 107.2 µL 纤维蛋白原溶液（2.80 mg/mL）、8.0 µL 中和胶原蛋白（3.0 mg/mL）和 3.6 µL 抑肽酶（5 U/mL）加入试管中混合。该溶液标记为 &#34;预混液&#34; （质谱） 
		注意：该体积仅够加载一个球状体。若存在多个球状体，需将各体积乘以球状体的数量。</li>
		<li>将凝血酶溶解于PBS中，使其终浓度为50 U/mL。 
		注意：50 U/mL 凝血酶分装液（20 µL/管）保存于 −30 °C，每次实验前取出融化。</li>
		<li>将含有类球体的96孔板放入生物安全柜中。</li>
		<li>在生物安全柜内准备两个35 mm培养皿，其中一个培养皿置于冰上（1号皿），另一个培养皿置于实验台面上（2号皿）。用移液器将99 µL的MS滴加至1号皿的中央图3a）以形成液滴。</li>
		<li>修剪2个黄色（10–100 µL）和3个透明（1–100 µL）移液枪头尖端，分别用于从96孔板中收集类球体、将凝血酶与基质混合、精确收集类球体、将类球体注入装置以及向装置中注入培养基。枪头孔径应略大于通道1和通道3中孔1A–3B或通道2中类球体孔的直径，以确保紧密贴合。 
		注意：此后除非另有说明，均使用本步骤中切割好的移液器吸头。切割后吸头的照片见于 图4.</li>
		<li>从96孔板中用100 µL培养基收集一个球状体，并加入到2号培养皿中图3a).</li>
		<li>从2号培养皿中吸取含有最小体积培养基的球状体。保持移液器垂直，球状体会因重力作用移向移液枪头底部。将移液枪头接触1号培养皿中微球（MS）液滴的弯月面，排出球状体。图 3a). 
		注意：以下步骤 4.1.10 &amp;#38; 4.1.11 应迅速执行。</li>
		<li>加入1 µL凝血酶（50 U/mL），并用黄色移液器吸头轻轻混匀。</li>
		<li>使用设置为 7 µL 的移液器吸取类球体，并缓慢将其放入类球体孔中（图 3b).</li>
		<li>37 °C 下孵育 15 分钟，使纤维蛋白发生凝胶化。</li>
		<li>从1A和3A孔缓慢注入内皮培养基，将通道1和通道3充满培养基（20~30 µL/通道）。</li>
		<li>将装置置于含湿润Kimwipe的100 mm培养皿中，以防止装置内培养基蒸发图3c).</li>
		<li>将装置置于 37 °C、5% CO₂ 环境中2 孵育24小时，以去除培养基与纤维蛋白界面处的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第0天）HUVECs细胞接种
	<ol>
		<li>解冻GFP-HUVECs（3.0 × 105 细胞/瓶），加入10 mL内皮细胞培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下在100 mm培养皿中培养2 培养2-3天至亚汇合状态。一个亚汇合状态的GFP-HUVECs培养皿足以制备8-10个装置。</li>
		<li>用2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA将GFP-HUVECs从培养皿中消化下来，并加入4 mL含10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM终止胰蛋白酶反应。</li>
		<li>离心（220 × g，3 分钟）后，将 GFP-HUVECs 重悬于内皮细胞培养基中，细胞密度为 5.0 × 106 cells/mL</li>
		<li>通过1B孔将HUVECs细胞悬液注入1号通道（20 µL/通道）。</li>
		<li>将微流控装置倾斜90°，侧放，并在37 °C下孵育30分钟，以确保HUVECs黏附于第2通道中的纤维蛋白。
		<ol>
			<li>确认HUVECs在纤维蛋白上的贴附情况。当凝胶与培养基界面处贴附的HUVECs数量不足时，经过数天的装置培养后，血管结构可能在血管根部发生断裂。图5）。在该方案中，灌注的成功率为 &#62;50%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复步骤 4.2.4 和 4.2.5，用于通道 3。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞培养于含湿润Kimwipe的100 mm培养皿中2 7至14天</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天～ 培养基更换
	<ol>
		<li>每天更换通道1和通道3中一半的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞核染色
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>移除 1 和 3 通道中的培养基，每条通道加入 20 µL 的 4% PFA。为完全更换为 4% PFA 溶液，重复移除装置中的液体并重新加入 4% PFA 三次。</li>
	<li>将装置置于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>从装置中移除 4% PFA，并用 PBS 洗涤通道三次。</li>
	<li>每条通道加入 20 µL 浓度为 10 µg/mL 的荧光染料（材料表）以染色细胞核。为更换装置内的溶液，重复移除液体并加入 10 µg/mL 荧光染料三次。</li>
	<li>将装置在 4 °C 下保存 24 小时。</li>
</ol>
6. 类球体的流体灌注
<ol>
	<li>在37 °C和5% CO2条件下培养超过7天，待形成连续的血管通路后，制备类球体。</li>
	<li>移除1A、1B、3A和3B孔中的培养基。</li>
	<li>向1A和1B孔中加入10 µL含10 µM荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖的PBS溶液。</li>
	<li>在倒置显微镜下观察微珠或FITC染料的流动情况。</li>
</ol>
7. 芽管长度的定量分析
注意：本研究中所有图像分析均使用 ImageJ 版本 1.49 软件进行。
<ol>
	<li>将第0、1、3、5和7天的GFP-HUVECs图像进行叠加。</li>
	<li>用第1、3、5和7天图像中血管尖端的位置减去第0天对应位置。</li>
	<li>确定血管尖端从根部位置的生长情况（图6）。本研究中将血管尖端与根部之间的距离定义为出芽长度（图7b）。</li>
</ol>
8. 血管角度的量化
注意：血管角度定义为血管角度、根部与球体中心所构成的角度（图7c）。
<ol>
	<li>对包含RFP-HUVECs的共培养类球体的荧光图像进行二值化处理，并使用ImageJ中的分析功能测量&#34;centroid&#34;位置。在本研究中，所测得的&#34;centroid&#34;位置被定义为类球体的中心（图6）。</li>
	<li>以与步骤7相同的方法确定血管尖端和根部的位置。</li>
	<li>使用ImageJ软件中的分析功能测量血管角度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

既往研究表明，人肺成纤维细胞（hLFs）可分泌多种促血管生成因子的混合物，例如血管生成素-1、血管生成素、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、肿瘤坏死因子以及某些细胞外基质蛋白29,30。该检测方法依赖于hLFs在共培养球体中的促血管生成因子分泌，这也是该技术的局限性所在。因此，为了实现稳定的血管形成，必须将共培养球体置于孔板底部，以缩短共培养球体与第1和第3通道中HUVECs之间的距离。成纤维细胞诱导的血管长度与内皮细胞和成纤维细胞之间的距离呈反比关系31，因此较短的距离更有利于稳定的血管形成。然而，为了在不损伤第1和第3通道的前提下打开一个直径为1 mm的球体孔，第2通道的最小宽度需为1.5 mm。
尽管类球体沉降在孔板底部，但血管根部偶尔会与微柱或微通道脱离（图5）。在这种情况下，任何试剂都无法通过微通道（通道1或通道3）进入血管腔。尽管我们无法完全解决此问题，但我们推测其原因是纤...

从单层（二维）培养转向三维培养，是出于对能够模拟活体组织细胞功能的培养模型的需求1,2,3。细胞培养中常用的平面且坚硬的塑料基质并不类似于人体内大多数细胞外环境。事实上，许多研究表明，三维培养能够重现组织特异性的结构、力学和生化信号以及细胞间通讯，而这些特征在传统的二维培养中并未观察到4,5,6,7,8。
多细胞聚集体或球状体是实现这种三维培养最有前景的技术之一9,10细胞分泌细胞外基质（ECM），并在球体中与其他细胞相互作用。尽管其他一些生物工程方法11,12,13,14，例如细胞堆叠，虽能成功模拟人体的空间复杂性，但这些方法仅使用两到三种细胞，以便于分析，并且只关注靶器官的单一功能。相比之下，由于球形结构内部营养物质、氧气以及旁分泌和自分泌信号分子的供应存在异质性，位于球形结构不同位置的细胞所处的培养环境也各不相同。这种球形结构的特性在一定程度上模拟了 体内 培养条件，并使球状体中的细胞形成更为复杂且有序的组织结构 体外 比在堆叠组织中培养的细胞9,15,16需要注意的是，即使类球体由单一类型的细胞组成，由于类球体内部微环境的异质性，其中细胞的功能也不均一。近年来，类球体培养技术已使胚胎干细胞（ESCs）、诱导性多能干细胞（iPSCs）或组织驻留干细胞能够模拟 体内 发育序列并重建脑等类器官17肝脏18和肾脏19,20.
尽管类球体培养技术已取得显著进展，但长期培养大型类球体仍然存在困难。在三维组织中，由于氧气和营养物质供应有限，细胞必须位于距血管150–200 µm的范围内21。类球体内部需要形成血管网络，以模拟体内血液与组织之间物质交换的过程。in vivo。为实现这一目标，其他研究团队已尝试将内皮细胞与目标细胞共培养22,23,24，或诱导多能干细胞分化为CD31阳性细胞20。然而，已有报道的类血管结构并未形成开放的管腔末端，无法将氧气和营养物质输送至类球体中心。为了模拟血管在三维培养中为细胞提供营养的功能，必须在类球体中构建具有开放末端且可灌注的血管网络。
在过去的几年中，一些微加工领域的研究团队报道了利用共培养的成纤维细胞分泌的血管生成因子，在微流控装置中自发形成可灌注血管网络的方法。25,26这些血管网络具有与它们相似的形态 体内 对应物，并可受环境因素重塑，使其适用于在球体培养中模拟血管功能。本方案的目的是利用微流控平台在球体中构建可灌注的血管网络27微流控装置是在先前报道的装置基础上进行改进的25 以便整合类球体。通过引导类球体中成纤维细胞分泌的促血管生成因子作用于微通道内的内皮细胞，微通道中长出的血管生成芽与类球体发生吻合，形成可灌注的血管网络。该方法可直接将多种物质（如荧光分子和微米级微珠）递送至类球体内部，为具有血管网络的长期组织培养提供了技术框架。

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>涂覆有 AZP 1350 的铬掩模</td><td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>微图形发生器</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 显影液</td><td>Rohm and Haas 电子材料</td><td>-</td><td>方案 1.4 中的显影剂</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>佐佐木化学</td><td>S-24</td><td>方案 1.5 中的铬蚀刻剂</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>和光</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>东京应化工业</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td>方案 1.9 中的负性光刻胶</td></tr><tr><td>紫外曝光</td><td>纳米计量技术公司</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>方案 1.13 中负性光刻胶的显影剂</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>和光</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>表面轮廓仪</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>（三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>道康宁东丽</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器（1.0 mm）&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器（2.0 mm）&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>等离子体系统</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>松浪玻璃</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>表达 RFP 的人脐静脉内皮细胞</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>正常人肺成纤维细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长培养基试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>和光</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的 0.05 w/v% 胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA&amp;bull;4Na 溶液</td><td>和光</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>宝生物</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>住友电木</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000 µl 吸头</td><td>日本遗传</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200 µl&amp;nbsp;吸头</td><td>日本遗传</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10 µl 吸头</td><td>日本遗传</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>表达 GFP 的人脐静脉内皮细胞</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>来自牛血浆的纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>来自牛肺的抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>来自牛血浆的凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>方案 5.5 中用于细胞核染色的荧光染料</td></tr><tr><td>多聚甲醛溶液</td><td>和光</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>数字 CCD 相机</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描生物显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素-葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

类球体（多细胞聚集体）被认为是模拟人体活体组织的良好模型。尽管类球体培养技术已取得显著进展，但在长期培养过程中，维持和促进其功能（如蛋白质表达和形态发生）仍面临一个关键挑战，即在类球体中构建可灌注的血管网络。本方案介绍了一种在微流控装置中于类球体内整合可灌注血管网络的新方法。为在类球体中诱导可灌注血管网络，利用在类球体内共培养的人肺成纤维细胞所分泌的促血管生成因子，引导血管新生芽体与微通道连接，并延伸至类球体内部。这些新生的血管芽体与类球体中共培养的内皮细胞融合，形成连续的血管网络。该血管网络能够无渗漏地灌注类球体内部。所构建的血管网络可进一步作为营养物质输送和代谢废物清除的通路，模拟血液循环功能

关键词：类球体，血管生成，微流控，三维细胞培养，组织工程，内皮细胞，人肺成纤维细胞，血管网络，灌注 体内该方法为类球体培养提供了一个新平台，可更真实地模拟活体组织。

图1展示了微流控装置的设计图与照片。该装置包含三个平行通道，其中通道2设有类球体培养腔。通道1和通道3用于HUVEC细胞培养，通道2用于放置类球体。各通道之间由梯形微柱分隔，这些微柱在PDMS材料中成型，通过表面张力阻止通道2中的水凝胶渗入通道1和通道3，同时允许类球体与微通道中的HUVEC之间进行物质交换28。
图7a 显示了细胞接种后微流控装置中心区域的情况。第0天拍摄的明场和荧光图像显示，纤维蛋白凝胶仅填充了通道2，未泄漏至通道1和通道3，且人脐静脉内皮细胞（HUVECs）已成功附着于纤维蛋白凝胶的侧壁。明场图像中类球体和微柱均处于清晰对焦状态，表明类球体已正确沉降至装置底部。血管生成芽在第1天开始出现，芽长度随时间逐渐增加（图7b</st...

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。

类球体（多细胞聚集体）被认为是人体活体组织的良好模型。尽管在……方面已取得显著进展

本实验的总体目标是利用微流控平台在多细胞聚集体（即类球体）中构建可灌注的血管网络。该方法有助于解答再生医学领域中一些关键问题，例如血管网络在体内和体外组织模型中的重要作用。该技术的主要优势在于，可通过将药物或补充物直接递送至类球体中的特定区域，在体外模拟药物和补充剂的给药途径。通常，初学者会因难以将细胞导入微流控装置中的目标区域而遇到困难。将PDMS预聚物浇铸后，在真空腔室中脱气两小时，随后在80摄氏度的通风烘箱中过夜固化。次日早晨，将PDMS从硅片上剥离，并使用直径为2毫米的打孔器在指定位置打孔。使用直径为1毫米的打孔器制备球状体培养孔，并使用胶带清洁PDMS切片和24毫米×24毫米的玻璃盖玻片。将清洁后的PDMS切片用空气等离子体处理40秒，然后将PDMS切片键合到盖玻片上。随后，在80摄氏度下固化PDMS至少12小时。在接种微流控装置前两到三天，将三乘十的五次方个新解冻的人肺成纤维细胞（hLF）、表达红色荧光蛋白的脐静脉内皮细胞（RFP-HUVECs）和表达绿色荧光蛋白的脐静脉内皮细胞（GFP-HUVECs）加入至10毫升新鲜内皮细胞培养基中，置于10毫米培养皿内。当hLFs和RFP-HUVECs达到亚汇合状态时，将hLFs和RFP-HUVECs用内皮细胞培养基重悬，最终浓度分别为每毫升1.0×10⁵个细胞和每毫升2.5×10⁴个细胞。悬浮培养两天后，在生物安全柜中，将99 µL新配制的主混合液滴加至置于冰上的35毫米培养皿中央。为加载微流控装置，使用经改造的100微升移液器吸头将一个类球体及100微升培养基转移至第二个室温下的培养皿中。随后，用最少的培养基吸取类球体，并将移液器垂直放置，使类球体在重力作用下移至移液器吸头底部。将移液器吸头接触主混合液滴的弯月面，以排出类球体进入溶液中，此过程无需按压移液器推杆。接下来，迅速向液滴中加入 1 µL 新鲜配制的凝血酶，并轻轻混匀，使凝血酶充分混入溶液中。将移液器调至 7 µL，缓慢地将球状体转移至 PDMS 平板的球状体孔中。该实验步骤中最关键的环节是向球状体注入足量的凝胶，以使其能够沉降至装置底部。加样后，轻轻取下移液器吸头，以防止微柱之间发生泄漏。将球状体在37摄氏度下孵育15分钟。当纤维蛋白凝固后，缓慢向孔1A和孔3A中分别注入20至30微升内皮细胞培养基，以加载通道1和通道3。然后，将装置转移至盛有湿实验擦拭纸的100毫米培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育24小时，以促进去除培养基与纤维蛋白界面处的气泡。次日，向未完全融合的GFP-HUVECs中加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，待细胞完全脱落时，加入4毫升完全培养基终止消化反应。通过离心收集内皮细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜内皮细胞培养基中，调整浓度为5 × 10⁶ 个细胞/毫升。接下来，将20微升HUVECs注入孔B1中以加载通道1，并将装置置于37摄氏度环境中30分钟，倾斜90度角，以确保HUVECs黏附于通道2的纤维蛋白中。以相同方式加载通道3后，将装置放入一个新的含有湿润实验擦拭纸的100毫米培养皿中，在细胞培养箱中孵育7至14天，每天更换通道1和通道3中一半的培养基。这些在HUVEC接种第0天拍摄的代表性图像显示，仅通道2中加载了纤维蛋白凝胶，未向通道1或通道3发生泄漏，且HUVECs已成功附着于纤维蛋白凝胶的侧壁。类球体也可被观察到已正确沉降至装置底部。在此实验中，血管生成 sprouts 从第1天开始出现，最长的 sprout 在第3天到达类球体，大多数血管生成 sprouts 在第7天前到达类球体。理想情况下，在装置中培养4天后，可观察到血液流经血管管腔，血管角度定义为从血管根部指向血管尖端与类球体中心的方向。血管角度随时间推移逐渐减小，表明血管新生芽向类球体迁移。RFP标记的和GFP标记的HUVECs能够协同形成单一血管腔，清晰地展示了来自通道一和通道三的血管新生芽如何与类球体中的RFP-HUVECs发生吻合，从而构建连续的血管网络。此外，注入通道一的FITC-葡聚糖可流入构建的血管网络及类球体内部，并最终到达通道三，表明整合的血管网络能够向类球体输送营养物质并清除代谢废物。该技术问世后，为有机电子领域研究人员探索药物或补充剂在体外组织模型中的功效开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微流控装置中组织模型的 Perfusable 血管网

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

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发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

本方案概述了采用图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建源自血管、具有仿生特性的微流体网络的方法。此类仿生微流体系统可应用于组织工程、组织构建 体外...

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学习使用微流控平台在球状体中构建可灌注血管网络的方法。该技术利用PDMS预聚物铸造和细胞接种，实现体外药物递送模拟，为再生医学中的血管网络研究提供重要工具。

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

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