微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

本实验的总体目标是利用微流控平台在多细胞聚集体（即类球体）中构建可灌注的血管网络。该方法有助于解答再生医学领域中一些关键问题，例如血管网络在体内和体外组织模型中的重要作用。该技术的主要优势在于，可通过将药物或补充物直接递送至类球体中的特定区域，在体外模拟药物和补充剂的给药途径。

通常，初学者会因难以将细胞导入微流控装置中的目标区域而遇到困难。将PDMS预聚物浇铸后，在真空腔室中脱气两小时，随后在80摄氏度的通风烘箱中过夜固化。次日早晨，将PDMS从硅片上剥离，并使用直径为2毫米的打孔器在指定位置打孔。

使用直径为1毫米的打孔器制备球状体培养孔，并使用胶带清洁PDMS切片和24毫米×24毫米的玻璃盖玻片。将清洁后的PDMS切片用空气等离子体处理40秒，然后将PDMS切片键合到盖玻片上。随后，在80摄氏度下固化PDMS至少12小时。

在接种微流控装置前两到三天，将三乘十的五次方个新解冻的人肺成纤维细胞（hLF）、表达红色荧光蛋白的脐静脉内皮细胞（RFP-HUVECs）和表达绿色荧光蛋白的脐静脉内皮细胞（GFP-HUVECs）加入至10毫升新鲜内皮细胞培养基中，置于10毫米培养皿内。当hLFs和RFP-HUVECs达到亚汇合状态时，将hLFs和RFP-HUVECs用内皮细胞培养基重悬，最终浓度分别为每毫升1.0×10⁵个细胞和每毫升2.5×10⁴个细胞。悬浮培养两天后，在生物安全柜中，将99 µL新配制的主混合液滴加至置于冰上的35毫米培养皿中央。

为加载微流控装置，使用经改造的100微升移液器吸头将一个类球体及100微升培养基转移至第二个室温下的培养皿中。随后，用最少的培养基吸取类球体，并将移液器垂直放置，使类球体在重力作用下移至移液器吸头底部。将移液器吸头接触主混合液滴的弯月面，以排出类球体进入溶液中，此过程无需按压移液器推杆。

接下来，迅速向液滴中加入 1 µL 新鲜配制的凝血酶，并轻轻混匀，使凝血酶充分混入溶液中。将移液器调至 7 µL，缓慢地将球状体转移至 PDMS 平板的球状体孔中。该实验步骤中最关键的环节是向球状体注入足量的凝胶，以使其能够沉降至装置底部。

加样后，轻轻取下移液器吸头，以防止微柱之间发生泄漏。将球状体在37摄氏度下孵育15分钟。当纤维蛋白凝固后，缓慢向孔1A和孔3A中分别注入20至30微升内皮细胞培养基，以加载通道1和通道3。

然后，将装置转移至盛有湿实验擦拭纸的100毫米培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育24小时，以促进去除培养基与纤维蛋白界面处的气泡。次日，向未完全融合的GFP-HUVECs中加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，待细胞完全脱落时，加入4毫升完全培养基终止消化反应。通过离心收集内皮细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜内皮细胞培养基中，调整浓度为5 × 10⁶ 个细胞/毫升。

接下来，将20微升HUVECs注入孔B1中以加载通道1，并将装置置于37摄氏度环境中30分钟，倾斜90度角，以确保HUVECs黏附于通道2的纤维蛋白中。以相同方式加载通道3后，将装置放入一个新的含有湿润实验擦拭纸的100毫米培养皿中，在细胞培养箱中孵育7至14天，每天更换通道1和通道3中一半的培养基。这些在HUVEC接种第0天拍摄的代表性图像显示，仅通道2中加载了纤维蛋白凝胶，未向通道1或通道3发生泄漏，且HUVECs已成功附着于纤维蛋白凝胶的侧壁。

类球体也可被观察到已正确沉降至装置底部。在此实验中，血管生成 sprouts 从第1天开始出现，最长的 sprout 在第3天到达类球体，大多数血管生成 sprouts 在第7天前到达类球体。理想情况下，在装置中培养4天后，可观察到血液流经血管管腔，血管角度定义为从血管根部指向血管尖端与类球体中心的方向。

血管角度随时间推移逐渐减小，表明血管新生芽向类球体迁移。RFP标记的和GFP标记的HUVECs能够协同形成单一血管腔，清晰地展示了来自通道一和通道三的血管新生芽如何与类球体中的RFP-HUVECs发生吻合，从而构建连续的血管网络。此外，注入通道一的FITC-葡聚糖可流入构建的血管网络及类球体内部，并最终到达通道三，表明整合的血管网络能够向类球体输送营养物质并清除代谢废物。

该技术问世后，为有机电子领域研究人员探索药物或补充剂在体外组织模型中的功效开辟了道路。