微流控装置中组织模型的 Perfusable 血管网
April 4th, 2018
该协议描述了如何在球体中设计一个 perfusable 的血管网。球体周围的微环境被设计来诱导血管生成, 并将球体连接到微流控装置中的微。该方法允许球状的灌注, 这是一个期待已久的技术在三维文化。
该程序的总体目标是使用微流体平台在多细胞聚集体或球状体中构建可灌注的血管网络。这种方法可以帮助解决再生医学领域替代形式中的关键问题，例如血管网络在体内和体外组织模型中的重要性。该技术的主要优点是可以通过将感兴趣区域直接递送到球状体中，在体外模拟药物和补充剂给药的途径。
通常，由于难以将细胞引入微流体设备中的目标区域，不熟悉这种方法的人会很挣扎。浇注 PDMS 预聚物后，在真空室中对材料脱气 2 小时，然后在通风箱中以 80 摄氏度固化过夜。第二天早上，从硅晶片上剥离 PDMS，并使用直径为 2 毫米的打孔器在材料上的指定位置打孔。
使用直径为 1 毫米的冲头创建球体，并使用胶带清洁 PDMS 板和 24 x 24 毫米的玻璃盖玻片。用空气等离子体处理干净的板坯 40 秒，然后将 PDMS 板片粘合到盖玻片上。然后，在 80 摄氏度下固化 PDMS 至少 12 小时。
在接种微流控装置前 2 到 3 天，将 3 乘以 10 添加到第五个新鲜解冻的 hLF、RFP-HUVEC 和 GFP-HUVEC 中，加入 10 毫米培养皿中的 10 毫升新鲜内皮培养基中。当 hLF 和 RFP-HUVEC 达到亚汇合时，将 hLF 和 RFP-HUVEC 悬浮在内皮培养基中至最终浓度，分别为 1.0 倍 10 至第 5 个细胞和 2.5 倍 10 至第 4 个细胞/毫米。悬浮培养两天后，在生物安全柜中，将 99 微升新鲜制备的预混液液滴加入冰上 35 毫米培养皿的中心。
要加载微流体装置，请使用改良的 100 微升微量移液器吸头将球状体和 100 微升培养基转移到第二个室温培养皿中。然后，在最少量的培养基中吸出球体，并直立转动移液器，使球体在重力作用下移动到移液器吸头的底部。将移液器吸头接触预混液液滴的弯液面，将球体喷射到溶液中，而不会按下移液器柱塞。
接下来，向液滴中快速加入 1 微升新鲜制备的凝血酶，然后将凝血酶轻轻混合到溶液中。将移液管设置为 7 微升，将球体缓慢转移到 PDMS 板的球体孔中。该程序最关键的步骤是向球状体注射足够的凝胶，以使球状体沉淀在装置的底部。
加载后，轻轻取下移液器吸头，以防止微柱之间泄漏。将球体在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。当纤维蛋白凝固后，将 20 至 30 微升内皮培养基缓慢注入孔 1 A 和 3 A，分别加载通道 1 和 3。
然后，将设备转移到 100 毫米培养皿中的湿实验室抹布上，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育设备 24 小时，以促进去除培养基和纤维蛋白之间界面处的任何气泡。第二天，向亚汇合的 GFP-HUVEC 中加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并在细胞完全分离时用 4 毫升完全培养基终止胰蛋白酶反应。通过离心收集内皮细胞，并以每毫升浓度的 5 倍 10 至 6 个细胞将沉淀重悬于新鲜的内皮培养基中。
接下来，将 20 微升 HUVEC 注入孔 1 B 以加载通道 1，并将设备置于 37 摄氏度下 30 分钟，倾斜 90 度角以确保 HUVEC 粘附在通道 2 中的纤维蛋白上。以相同的方式加载通道 3 后，将设备放入细胞培养箱中含有湿实验室湿巾的新 100 毫米培养皿中 7 至 14 天，每天更换通道 1 和 3 中的一半培养基。这些在 HUVEC 上样第 0 天拍摄的代表性图像显示，纤维蛋白凝胶仅上样到通道 2 中，没有任何泄漏到通道 1 或 3 中，并且 HUVEC 成功连接到纤维蛋白凝胶的侧壁。
还可以观察到球体正确沉降在设备底部。从第 1 天开始观察到血管生成芽，在该实验中，最长的芽在第 3 天到达球状体，大多数血管生成芽在第 7 天到达球状体。最佳情况下，在设备中 4 天后，可以观察到流经血管腔的血流，血管角度定义为血管尖端的方向和球体中心从血管根部开始。
维管角以时间依赖性方式减小，表明血管生成芽向球体迁移。RFP 和 GFP-HUVEC 可以协调形成单个维管腔，清楚地表明血管生成如何从通道 1 和 3 吻合口发芽到球状体中的 RFP-HUVEC 以形成连续的血管网络。此外，注入通道 1 的 FITC-葡聚糖流入构建的血管网络和球体内部，最终到达通道 3，这意味着整合的血管网络可以为球体提供营养并从球体中去除废物。
开发后，这项技术为有机电场的研究人员在体外组织模型中探索感兴趣的药物或补充剂的疗效铺平了道路。
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概述
本协议概述了在微流控平台上构建球体内的可灌流血管网络的工程。该方法便于模拟直接向球体内输送药物，解决了组织模型中的重要问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 血管生物学
- 组织工程
背景
- 了解血管网络对于体内和体外组织模型至关重要。
- 三维培养中的灌流一直是一个备受期待的技术。
- 该方法增强了对药物和补充剂给药途径的研究。
- 在微流控装置中引入细胞存在挑战。
研究目的
- 在多细胞聚集体中构建可灌流的血管网络。
- 在体外模拟药物输送。
- 提高对再生医学中血管网络的理解。
使用的方法
- 利用微流控平台进行网络构建。
- PDMS预聚物浇铸和固化。
- 在真空室中脱气。
- 在PDMS中创建细胞引入孔。
主要结果
- 该方法成功创建了可灌流的血管网络。
- 可以在球体中有效模拟药物输送。
- 确定并解决了细胞引入的挑战。
- 该技术增强了体外模型的相关性。
结论
- 该协议为研究血管网络提供了宝贵的工具。
- 它为再生医学研究开辟了新的途径。
- 进一步优化可能改进细胞引入技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating a perfusable vascular network within spheroid tissue models addresses a critical barrier in recapitulating in vivo-like nutrient and waste exchange for drug discovery and tissue engineering. This microfluidic approach enables simulation of physiological perfusion, supporting predictive confidence in compound delivery and tissue response studies. The platform enhances translational relevance for early-stage screening and mechanistic de-risking in regenerative medicine and biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascularization's role in tissue function and drug response.
- Supports mechanistic de-risking by modeling nutrient and waste exchange in 3D systems.
- Improves predictive confidence for target validation in complex tissue environments.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of physiologically relevant, perfusable spheroid models for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of drug delivery and distribution within tissue constructs.
- Supports reproducible assay development by standardizing vascular integration in microfluidic devices.
Translational & Preclinical Research
- Provides a platform for disease-relevant modeling of vascularized tissues in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by mimicking in vivo perfusion.
- Reduces translational risk by aligning in vitro models with physiological tissue architecture.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic vascularization method fits from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on vascular function and tissue viability in engineered models.
- Screening: Delivers assay-ready, perfusable spheroids for robust compound screening.
- Analytics: Provides quantitative perfusion and distribution readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo studies by replicating physiological perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform adaptable to diverse tissue and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based assays.
- Operational Value: Standardizes vascularized tissue model preparation for scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on more predictive in vitro models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cell culture, and tissue engineering.
- Needs access to microfabrication tools and imaging infrastructure for monitoring perfusion.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in device preparation and cell loading.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Critical steps include precise cell introduction and gel handling to prevent leakage and ensure network integrity.
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