Name: 猪生物医学模型生物库组织样品的取样策略与处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: 学习猪生物医学模型生物库组织样品的取样策略与处理方法，掌握浸没法估算器官体积和定向仪技术生成随机各向同性切片，为神经科学研究提供可靠的定量形态学分析技术。

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作者感谢 Lisa Pichl 提供出色的技术支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从猪动物模型中建立生物样本库样本集，需要采用可靠的技术和方案，以准确测定器官/组织体积，可重复地生成适用于多种不同分析方法的具有代表性且冗余的组织样本，并实现样本切片方向的随机化，以满足定量体视学分析的要求。本文所述方法针对猪器官和组织的尺寸特点而优化设计，旨在有效满足上述需求2,7。这些方法基于广泛认可的方法学原则，并已在多项已发表的研究中验证其可行性与实用性2,7,12,21。所介绍的方法对于各类组织/器官样本研究具有重要意义，因其为获取代表性样本以及多种原本无法测定的参数提供了基础。这些方法操作快速、简便，且几乎兼容所有类型的下游分析。因此，不仅适用于猪动物模型的生物样本库项目，也可广泛应用于其他大型动物模型物种（例如，绵羊）组织样本的定量组织...

在转化医学中，猪作为大型动物模型的应用日益普遍1,2,3,4,5，这主要得益于猪与人类在解剖学和生理学上的多种有利相似性，以及已有成熟的分子生物学方法，可构建针对多种疾病状态的定制化基因修饰猪模型1,4。
然而，与啮齿类动物模型相比，任一特定猪模型在任何时间点可供实验使用的动物数量均有限。这主要是由于猪的世代间隔约为一年，且猪模型的制备以及动物饲养需要耗费大量的资金和时间。因此，猪模型的每一只个体及其所能获取的样本都极为珍贵，尤其是在老年个体中研究基因修饰猪模型和/或长期实验问题（例如，慢性疾病的晚期并发症）时尤为如此2,6,7。
在任何研究过程中，后续可能发现需要进行最初实验设计中未计划的额外分析，例如，为解答先前意外发现所引发的新问题。若缺乏适用于此类额外实验的合适样本，则可能需要耗费极高的成本和大量时间来重新培育实验猪并采集组织样本。为应对这类情况，建立生物样本库，保存数量充足、质量合格的多种器官、组织或生物液体的备用样本，以满足后续多种分析需求，被认为是一种重要策略2,6,7。充分利用猪类动物模型的优势，充足的生物样本库资源还提供了独特的机会，可在同一批个体动物中，在多器官层面上对完全相同的样本材料应用多种不同的分析方法，例如，通过将样本分发给研究网络中不同课题组的科研人员来实现2,6,7。此外，生物样本库所采用的“前瞻性”采样策略也有助于减少研究中所需动物的总数。猪模型生物样本库的优势已在最近一项多器官、多组学研究中得到证实，该研究利用慕尼黑MIDY猪生物样本库的样本，探索了长期糖尿病转基因猪模型中的器官间相互作用2。
生物样本库样本通常必须满足一些强制性要求，以确保后续分析结果的可靠性和可解释性。样本必须能够被重复制备，并且必须具有代表性。 即，充分反映了所取样组织/器官感兴趣的形态学和分子特征7为了适用于多种下游分析类型，必须采集足量的样本，并根据不同的分析方法（包括时间与温度条件）进行处理，这些分析方法包括描述性组织病理学分析，如冷冻组织学、石蜡组织学和塑料组织学，以及免疫组织化学。 原位 杂交、超微结构电子显微镜分析、临床实验室诊断分析，以及对DNA、RNA、蛋白质和代谢物的分子分析。
为通过定量体视学分析评估不同组织结构的各种定量形态学参数（如数量、体积、长度或表面积），需制备相应器官/组织样本的随机组织学切面7,8,9,10,11在定量形态学研究中，需精确定量所取样本的组织、器官或器官分室的总体积，即，参考空间）至关重要7,9,12 用于计算特定器官、组织或生物体内目标参数的绝对量。最终，还需确定并考虑组织学切片制备过程中因包埋所致的组织收缩效应13因此，定量体视学分析，尤其是对存档样本（固定组织样本、包埋组织块、组织学切片）的分析 等等。) 来自先前研究的结果有时受到严重限制，甚至无法获取12尤其是当未对相应器官/组织进行体积测定、未采用适当的取样设计以确保样本具有代表性、可用的单个样本数量或量不足，或样本处理方式不适合目标定量形态学参数的估算时。由于存在多种可能的影响因素，档案样本材料是否适用于特定定量形态学参数的分析无法一概而论，而需根据每个具体情况进行审慎评估。
因此，由于样本的取材位置、大小、数量、处理方式、修剪方向和取向都可能影响后续分析的结果，这些因素极为重要，必须在任何研究的实验设计中予以充分考虑。针对这些方面以及猪解剖结构的特殊性，近期已制定出适用于猪动物模型的全面、详细且大规模的取样指南，为从50多种不同的猪器官和组织中标准化、可重复且高效地获取冗余、处理得当的高质量样本提供了可靠参考6,7。
本文提供的方法学描述及视频教程以图文并茂、清晰易懂的方式，逐步详细展示了多种体积测量、猪组织与器官取样以及组织样本处理技术的实际操作流程，以适用于不同的下游分析方法。所介绍的技术包括基于阿基米德原理和卡瓦列里原理测定器官/组织体积与密度的方法。9，包括测定不同包埋介质中组织三维收缩的尺寸变化14 在进行组织学检查处理过程中，应用可行的体积加权系统随机抽样方法，以及对所采组织样本进行不同后续分析的处理7,8,9,15以及为潜在的定量体视学分析生成方向适当且经过适当处理的样本7,8,9,10,11除了在猪类生物样本库项目中的应用外，所展示的方法普遍适用于所有研究器官/组织定量组织形态学特性的研究。此外，系统性随机抽样设计在采用分子分析方法检测特定分子丰度变化的实验中，对于生成具有代表性的样本尤为有益， 例如各种器官和组织中的RNA、蛋白质或代谢物。
接下来的段落将简要介绍这些方法，而其实际操作性能将在实验方案部分进行描述。
器官/组织体积的测定 
在多种实验条件下，测定器官重量和体积具有重要意义，因为这些参数可能提示某些变化，而这些变化可能与实验中关注的因素相关。为了从体视学估算的数值体积密度（即每单位组织体积内的细胞数量）计算出绝对定量参数（例如，总细胞数），通常也需要知道器官/组织的总体积7,12。除了使用计算机断层扫描等复杂设备的技术外，目前常用的方法主要有三种，可用于测定器官或组织的绝对体积。根据阿基米德原理，可通过&#34;直接体积测量法&#34;来测定器官的体积，即将器官完全浸入水中或生理盐水中，测量其所排开液体的体积。然而，对于相对较大的猪源性器官，该方法不切实际且容易产生误差，因其需要非常大的容量瓶或量具。更便捷的方法是根据器官/组织的重量和密度来计算其体积7,12,16，而密度可通过&#34;浸没法&#34;7,12,16（实验步骤1.1）高效测定。此外，也可采用基于&#34;卡瓦列里原理&#34;（1598–1647）的体积测量法来估算器官/组织的体积7,12,15。简而言之，卡瓦列里原理指出：若两个物体被平行于某一基面的平面所截切，并且在距基面相同距离处所截得的两个截面轮廓面积相等，则这两个物体的体积相等。因此，任意形状物体的体积可估算为：在平行且等距的切片平面上的截面轮廓面积与切片间距的乘积。以下类比有助于理解该原理：设想并列放置两堆数量相同的相同硬币，其中一堆硬币整齐叠放，形成圆柱形；另一堆硬币则每枚均偏心放置（图3A）。尽管两堆硬币的外形不同，但它们的体积相同，因为在对应高度上两堆硬币的截面面积（即距基面等距离处平行切面所截得的轮廓面积）完全一致。使用卡瓦列里原理估算猪源性器官和组织体积的方法详见步骤1.2。
组织学包埋相关组织收缩程度的测定 
在分析组织切片中多个定量形态学参数时，必须确定并考虑组织处理过程中因包埋所导致的组织收缩效应。包埋相关的组织收缩程度可能存在差异，其大小取决于组织类型、处理方式以及包埋介质8,13,17,18,19。通常情况下，包埋引起的组织样本体积变化（即，主要是收缩）在三维空间中均会发生，因此会影响通过定量体视学分析所估算的所有维度参数8。原则上，包埋相关组织收缩的程度可表示为线性组织收缩因子（fS），其估算方法如步骤1.3所示，并可用于校正那些对收缩敏感的定量形态学参数14。
器官/组织的体积加权系统性随机取样 
为建立猪器官/组织样本的生物样本库，体积加权系统性随机取样方法（如步骤2所述）已被证明是实用、省时且高效的策略，可用于获取具有代表性、适用于多种用途的组织样本7,8,9,15。
用于定量体视学分析的各向同性均匀随机切片与垂直均匀随机切片的制备 
生物样本库的组织样本必须适用于多种不同的定量体视学分析方法，以最大限度地估计各类参数，而这些参数若无适当制备的样本则无法测定。几乎所有定量体视学参数均可通过&#34;各向同性（独立）均匀随机（IUR）切片&#34;8,9进行测定。在IUR切片中，组织样本的切面平面三维方向是随机化的。这可通过随机化组织样本相对于切面位置的空间取向来实现，例如采用&#34;Isector&#34;方法11（实验步骤3.1）；也可通过随机化切面相对于组织样本的方向来实现，例如&#34;Orientator&#34;方法10（实验步骤3.2）。对于具有天然存在或定义明确且可准确识别的垂直轴的组织样本（如皮肤或黏膜标本），制备严格限定在垂直轴平面内的&#34;垂直均匀随机（VUR）切片&#34;（实验步骤3.3）具有优势8,20。关于IUR/VUR取样的理论基础以及潜在的下游定量体视学分析的全面讨论，建议读者参考生命科学领域定量体视学的教科书8,9。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>卡尔·罗斯特有限公司，德国</td><td>琼脂（粉末），货号：5210.3</td><td>将约1 g琼脂溶于10 ml冷水中，置于玻璃或塑料烧杯中，于700 W微波炉中加热，剧烈搅拌下煮沸两次。趁热倒入模具，静置凝固。注意：操作热液态琼脂时，需佩戴防护眼镜和手套。</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Hornbach 建材市场有限公司，博恩海姆，德国</td><td>铬/镍涂层刮刀 120 mm 货号：3664902</td><td>任何类型的卡尺（机械或电子）均可使用。</td></tr><tr><td>铸造模具（金属）</td><td>恩格尔布雷希特医疗 &amp;amp; 实验技术，Ederm&amp;uuml;德国</td><td>包埋切片&amp;auml;不锈钢冰盒，14 × 24 × 5 mm，货号：14302b</td><td>任何其他用于石蜡包埋的金属铸模也可使用。</td></tr><tr><td>复制十字网格模板（5毫米 - 6厘米）</td><td>无</td><td>未提供</td><td>提供了交叉网格（5 mm - 6 cm）的复制模板，详见补充数据文件 &lt;强&gt;阿尔布尔等&lt;/strong&gt;&amp;nbsp; 毒理病理学杂志. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td></tr><tr><td>等角圆与余弦加权圆的模板复制</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td>等角和余弦加权圆的复制模板已提供 &lt;强&gt;Nyengaard &amp;和 Gundersen&lt;/strong&gt;. 欧洲呼吸评论。15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) 以及在 &lt;强&gt;Gundersen 等人&lt;/strong&gt; 毒理病理学家的体视学原理与取样步骤。载于：哈舍克与鲁索&amp;acute;毒理病理学手册。第3版，215-286页，ISBN: 9780124157590 (2013)。</td></tr><tr><td>折叠式夹子（YIHAI 文件夹夹，15 mm 和 19 mm）</td><td>中国宁波天虹文具有限公司</td><td>Y10006 和 Y10005</td><td>其他类型的普通办公用回折夹也同样适用。</td></tr><tr><td>手术镊（解剖用）</td><td>NeoLab Migge GmbH，德国海德堡</td><td>neoLab 标准镊子 - 130 mm，解剖型，圆形，货号：1-1811</td><td>任何类型的解剖镊均可。</td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>SAV-Liquid Produktion GmbH，德国弗林茨巴赫</td><td>甲醛 37/40 %，货号：1000411525005</td><td>从浓缩液稀释至4%。用缓冲液调节至中性pH。佩戴适当的眼部、手部和呼吸防护装备。在通风橱内处理经甲醛溶液固定的组织样本，并佩戴防护眼镜和实验室手套。</td></tr><tr><td>坐标纸（用于校准）</td><td>B&amp;uuml;romarkt B&amp;ouml;ttcher AG，耶拿，德国。www.bueromarkt-ag.de</td><td>A4 毫米坐标纸，货号：2514</td><td>任何类型的毫米刻度坐标纸均可使用。</td></tr><tr><td>实验室烧杯（5 ml，10 ml，50 ml，100 ml）</td><td>NeoLab Migge GmbH，德国海德堡</td><td>SIMAX烧杯&amp;reg; ，矮型，硼硅酸盐玻璃 3.3，货号：E-1031、E-1032、E-1035、E-1036</td><td>任何种类的5毫升玻璃或塑料烧杯 &amp;ndash; 100 ml 体积即可。</td></tr><tr><td>实验室天平</td><td>梅特勒-托利多有限公司，吉&amp;szlig;德国</td><td>PM6000</td><td>任何标准实验室天平，其量程范围分别为 0.1 mg 至约 20 g，或 100 mg 至约 500 g，均可使用</td></tr><tr><td></td><td>萨托里乌斯 AG，G&amp;ouml;德国哥廷根</td><td>BP61S</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Engelbrecht 医学 &amp;amp; 实验室技术，Ederm&amp;uuml;德国</td><td>FEATHER 切片刀 S35，货号：14700</td><td>任何类型的单次使用切片机刀片均可。</td></tr><tr><td>形态测量学/平面测量软件/系统</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>ImageJ</td><td>从 https://www.imagej.nih.gov/ij/（1997）下载。</td></tr><tr><td>蔡司-康特龙，埃兴，德国</td><td>VideoplanTM 图像分析系统</td><td>缺货</td><td></td></tr><tr><td>照相机</td><td>尼康</td><td>D40</td><td>任何可安装在三脚架上的数码照相机&amp;nbsp; 好的。</td></tr><tr><td>塑料透明胶片</td><td>Avery Zweckform GmbH，德国奥伯兰登</td><td>A4 激光透明胶片 产品编号：&amp;nbsp; 3562</td><td>任何可（激光）打印的塑料胶片均可使用。</td></tr><tr><td>随机数字表</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td>使用随机数生成器（例如：https://www.random.org/）可以方便地生成随机数表（包含指定数量的随机数，并处于指定区间内）。</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Plano GmbH，德国韦茨拉尔</td><td>T5016</td><td>任何类型的剃须刀片均可使用。</td></tr><tr><td>尺子</td><td>B&amp;uuml;romarkt B&amp;ouml;ttcher AG，耶拿，德国。www.bueromarkt-ag.de</td><td>Office-Point 直尺 30 厘米，塑料，透明，货号：ln30</td><td>任何一种厘米-毫米刻度的尺子也可以使用。</td></tr><tr><td>生理盐水（0.9%）</td><td>卡尔·罗斯特有限公司，德国</td><td>氯化钠 &gt;99% 货号：0601.1</td><td>配制0.9%生理盐水，需将9 g NaCl溶解于1000 ml蒸馏水中，温度为20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Aesculap AG &amp;amp; Co KG，德国图特林根</td><td>BRAUN 外科手术刀片 N&amp;deg;22</td><td>任何类型的手术刀片均可使用。</td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>Hewlett-Packard</td><td>hp scanjet 7400c</td><td>任何能够以150-600 dpi分辨率进行扫描的标准办公扫描仪均可使用。</td></tr><tr><td>切片装置</td><td>未提供</td><td>无可用数据</td><td>自建切片装置的示例可参见 &lt;强&gt;克努斯特 等&lt;/strong&gt; 解剖学记录。292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) 及其补充数据文件中&lt;强&gt; Albl 等人&amp;nbsp; &lt;/strong&gt;毒理病理学杂志。44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)。</td></tr><tr><td>球形铸造模具（例如，直径为25.5 mm）</td><td>Pralinen-Zutaten.de，德国温达赫</td><td>牛奶巧克力空心松露球，25.5 毫米</td><td>球形铸造模具可自行制作，也可从其他糖果供应商处获取（例如用于制作巧克力松露）。此处提到的铸造模具实际上是空心巧克力松露外壳的包装/外皮（先食用巧克力，再利用其包装来制备i-sector切片）。</td></tr><tr><td>细金属丝</td><td>手工制作 &amp;amp; Hobby Schobes, Stra&amp;szlig;furth，德国。www.bastel-welt.de</td><td>细铁丝（0.3 mm）货号：216464742</td><td>任何其他类型的细金属丝也可使用。</td></tr><tr><td>卫生纸</td><td>NeoLab Migge GmbH，德国海德堡</td><td>Declcate 任务擦拭巾-白色，货号：1-5305</td><td>其他类型的实验室用纸巾也可使用。</td></tr><tr><td>防水笔</td><td>Staedler Mars GmbH &amp;amp; Co KG，N&amp;uuml;rnberg, 德国</td><td>Lumocolor 永久性记号笔 313，0.4 mm，S 型，黑色，货号：313-2</td><td>其他任何类型的防水笔也可使用。</td></tr></tbody></table>

生物银行中猪类 biomedical 模型组织样本的采样策略与处理方法

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

在转化医学研究中，猪模型的应用日益广泛。考虑到单个动物，尤其是基因修饰猪模型的高价值，以及这些模型可获得动物数量通常有限，建立经过适当处理的组织样本（生物样本库）集合，以适用于后续多种分析方法（包括采样时未明确规定的分析），是充分挖掘该模型转化价值的有效策略。针对猪的解剖学特点，近期已制定了标准化获取不同猪器官和组织代表性高质量样本的综合指南。这些指南是确保研究结果在不同研究和研究者之间具有可重复性和可比性的基本前提。记录基本数据（如器官重量和体积）、确定取样位置、所需制备的组织样本数量及其方向、尺寸、处理和修整方式，是决定样本适用于分子、定性和定量形态学分析的普适性与可用性的关键因素。本文以图示方式，逐步演示从猪组织制备具有代表性、多用途生物样本库样本的最重要技术。所述方法包括器官/组织体积和密度的测定、通过点计数法对实质器官应用体积加权系统随机取样程序、评估组织样本在组织学包埋过程中的收缩程度，以及制备随机取向的样本用于定量体视学分析，例如采用&#34;Orientator&#34;和&#34;Isector&#34;方法生成的各向同性均匀随机（IUR）切片，以及垂直均匀随机（VUR）切片。

测定组织/器官密度的浸没法
图12A- B 展示了使用步骤1.1中所述浸没法测定猪肾密度和体积的代表性操作图1, 图2）。其他猪器官和组织密度测量更具代表性的结果如图所示 表2更全面的多种猪组织和器官参考密度列表见《猪类 biomedical 模型组织取样指南》7通过重复测量同一样本及不同独立样本，可评估采用浸没法测得的组织密度数值的有效性。大多数猪组织的密度值略高于水（ρ水 ≈ 1.0），而悬浮在生理盐水中的组织（如脂肪组织、肺组织）则表现出较低的密度 &lt;1.0.
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本文展示了在生物样本库项目中，为猪动物模型生成代表性组织样本的各种方法的实际应用与性能，这些方法适用于广泛的下游分析，包括体积测定、系统性随机取样，以及针对定性和定量形态学与分子分析类型的组织样本差异处理。

在转化医学研究中，猪模型的使用正逐渐变得更加普遍。考虑到单个动物的高价值，尤其是……

本视频展示了用于采集和处理生物样本库猪组织标本的两种关键技术。浸没法可可靠地估算器官和组织的总体积，而定向切片法（orientator法）则可生成随机且各向同性的组织切片，用于无偏估计定量形态学参数。浸没法在测定组织密度方面的主要优势在于，该方法适用于任何类型的组织，并且对小样本和大样本均能产生可靠的结果。取向器技术的优点在于其高效性，并且适用于大组织样本。要开始对大型器官进行体积测定，需从器官上切取适当大小的组织块。用纸巾小心擦拭样本，以去除多余的血液和组织液。然后使用精密天平称量样品，并记录样品重量。向一个合适大小的烧杯中加入0.9%生理盐水。不要将烧杯完全装满，以防止组织浸入时溢出。将烧杯放在天平上，然后将镊子或自制的样品支架浸入生理盐水中，直至镊子或样品支架上的标记达到液面位置。接着，将天平显示归零。小心地将组织样品固定在镊子或样品支架上，并将样品完全浸入生理盐水中，直至达到标记位置。为了获得可靠的密度测量结果，必须确保样品完全浸没，并避免浸没的样品与烧杯内壁或底部接触。在固定样品位置的同时，记录天平上显示的重量。利用该测量值及室温下生理盐水的密度，计算样品的体积。然后根据样品的质量和体积计算组织样本的密度。对于较大的器官和组织（如本例中的肾脏），需使用多个样本进行重复测量，并根据单次测量结果计算平均密度。对于总体测量的小样本或小器官（如垂体），在根据单次测量值计算器官平均密度之前，应重复测量三次。最后，根据器官、组织或器官亚结构的重量和密度计算其总体积。将固定好的组织样本放置在等角圆的打印图上，使其一边与0至180度的方向平行，然后使用随机数字表确定一个随机角度。在等角圆的刻度上找到对应的标记。利用这些标记，沿等角圆刻度所示随机角度的方向，并垂直于样品的放置表面，对样品进行切面切割。将组织块的切面朝下放置在余弦加权圆上。将静止表面的边缘与一对一方向平行放置。现在使用随机数表确定一个随机角度，通过该角度在样品上切割一个新的切面。所得的切面即为各向同性均匀随机切面。本表展示了利用浸没法测定的多种猪组织和器官的代表性密度。大多数猪组织的密度值略高于1，即高于水的密度。而某些在生理盐水中漂浮的组织，例如脂肪组织，其密度则低于1。该图显示了使用取向器技术制备的猪左心室心肌的四个代表性等距无偏区域（IUR）切面。请注意不同IUR切面中切割角度的变化。一旦掌握，组织密度测定的浸没法可在数分钟内完成。如果操作得当，使用定向切片法（orientator technique）生成的各向同性均匀随机组织切片适用于通过适当的体视学分析方法来估计任何定量的形态学参数。数字音乐。

sampling-strategies-processing-biobank-tissue-samples-from-porcine

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学习猪生物医学模型生物库组织样品的取样策略与处理方法，掌握浸没法估算器官体积和定向仪技术生成随机各向同性切片，为神经科学研究提供可靠的定量形态学分析技术。

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