Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

该程序的总体目标是确定在不同营养条件下培养的细胞的脂滴指数。这种方法可以帮助回答脂滴和脂质领域中的关键问题，例如积累的动态和不同的营养条件。该技术的主要优点是可以同时读取多个样品，因为它可以在微孔板中实现。

随着这种方法的开始，当我们观察到在氮饥饿下培养的 Ustilago maydis 细胞的折射，然后意识到这可能意味着这些指导者可能是脂滴。因此，我们联系了巴西里约热内卢联邦大学的 Monica Montero，她实施了酿酒酵母中脂滴的液体荧光恢复测定，以开始合作，使该程序适应 Ustilago maydis。该方案的第一步是制备所需的缓冲液和溶液。

要制备 10 毫摩尔 BO-DP 储备液，请溶解 10 毫克 BO-DP 493-503 和 3.8 毫升二甲基亚砜。分成 100 微升等分试样。然后在零下 70 摄氏度的黑暗中保持。

通过将 1 微升 10 毫摩尔 BO-DP 493-503 添加到 2 毫升 500 毫摩尔淬灭溶液中，制备用于液体荧光回收或 LFR 测定的 5 微摩尔 BO-DP 淬灭溶液。通过开始初始光密度为 600 纳米的 05 培养来培养用于本研究的 umeda 细胞。将细胞在 28 摄氏度和 180 RPM 下孵育 24 小时。

在选定的时间，取出等分试样的细胞。在最初的 8 小时内，每 2 小时撤出 5 毫升。生长 8 小时后，2 毫升的等分试样就足够了。

测量每个等分试样的 600 纳米光密度。将细胞悬液在 4 摄氏度下以 14， 000 倍 G 离心 1 分钟。并且，丢弃上清液。

将细胞沉淀悬浮在一毫升含有 3.7% 甲醛的 PBS 溶液固定溶液中。将细胞在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，将细胞悬液以 14， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 1 分钟。

丢弃上清液。用 1 毫升蒸馏水洗涤细胞沉淀。将细胞悬液离心 1 分钟。

弃去上清液，加入 1 毫升蒸馏水进行第二次洗涤。再次离心。从第二次洗涤中取出上清液。

使用蒸馏水，将 600 纳米细胞沉淀的光密度调整为 5，相当于每毫升 1.5 乘以 10 到 8 分之一细胞。将样品保持在 4 摄氏度直至使用。通过打开分光光度计开始此过程。

打开 SkanIt 软件。单击 New session（新建会话）。从会话树中选择协议，输入荧光波长的设置，然后选择自动照片多人游戏增益。

对于激发带宽，请选择 12 纳米。在光学元件中，选择 top （顶部） 以从孔的顶部激发样品。输入 300 RPM 和低转速以进行温和而持续的搅拌。

选择 run plate out（运行板用），暂停，直到用户作，重复该方案 5 次。单击 save ，然后在 session name 字段中，编写会话的名称。该方案现已可用于样品分析。

将 200 微升 5 微摩尔 BO-DP 淬灭溶液加入黑色 96 孔透明底板的每个孔中。将板放入分光光度计腔室中，在 30 摄氏度下孵育 5 分钟。从这里开始，尽可能避光保护板。

单击开始按钮并读取 600 纳米处的荧光和光密度，对应于空白。在暂停期间，向孔中加入 5 微升甲醛固定细胞悬液，并用移液管小心混合样品。将板放回分光光度计中，然后单击 continue （继续）。

重复连续添加 3 次 5 μL 细胞悬液。用移液管混合，以确保细胞不会沉淀，然后再继续读取。在本演示中，使用 Excel 软件计算和绘制荧光和吸光度与微孔板中每个样品每次连续添加的体积的关系图。

在数据表中输入体积、荧光和吸光度数据。然后用光标选择整个数据，单击 插入 和 X Y 散点。选择图表中每条线的点，并在选中 show equation 框的情况下插入相应的趋势线。

根据方程记下两条直线的斜率值。要获得脂滴或 LD 指数，请将荧光线的斜率除以光密度线的斜率。要分析数据的质量，请计算每条直线的相关系数。

单击函数向导并选择 coral。如果 R 等于或大于 0.9，则读数是可靠的。通过共聚焦显微镜证实该方法的灵敏度非常重要。

当细胞在 YPD 培养基中培养时，LD 指数在指数期增加，然后稳定期下降。相比之下，在氮饥饿下生长的细胞在指数相和固定相中均显示出 LD 指数的稳定增加。在氮饥饿下，LD 指数的增加被 Soraphen A 抑制，Soraphen A 是乙酰辅酶 A 羧化酶的特异性抑制剂，对脂肪酸的合成至关重要，包含在脂质液滴中的三酰基甘油中。

由于两种培养物均以相同的光密度开始，因此结果显示该测定能够检测脂质含量的微小变化。共聚焦显微镜证实了该方法的敏感性。YPD 细胞在整个细胞中含有许多小的 LD，而氮饥饿会产生大的 LD，通常每个细胞 4 到 5 个。

为了进一步研究 LDs 在 U.Maydis 中的动员情况，将在氮饥饿下生长 72 小时的细胞转移到 YPD 培养基中。如图所示，LD 指数在指数函数之后下降。由于细胞能够动员氮饥饿期间积累的 LDs，因此结果表明三酰基甘油含量降低。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。尝试此程序时，请务必记住保护细胞免受光线照射并在添加物之间混合。按照此程序，可以执行其他方法（例如三酰甘油或总脂质含量测定）来回答其他问题，例如细胞中的确切脂质含量。

开发后，这项技术为脂质生物技术领域的研究人员探索新的或已知的生物体铺平了道路，以增加制药应用中生物燃料或脂质的产量。甚至可以用这种技术研究恶性癌细胞，以探索脂质代谢在疾病发展中的参与。看完这个视频，你也对如何确定这些细胞的脂滴指数有了很好的了解。

不要忘记，使用甲醛可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。