用两个稳定 Isotopically 标记鞘磷脂种鞘磷脂的定量和定性方法
May 7th, 2018
在这里, 我们提出了一个协议, 以量化和合格的每个鞘磷脂物种使用多反应监测和 ms/毫秒/ms 模式, 分别。
该程序的总体目标是精确分析生物样品中每种鞘磷脂种类的数量和结构。这种方法可以帮助回答脂质领域与脂质生物学和脂质有关的关键问题该技术的主要优点是我们可以通过色谱质谱系统表征生物样品中的各种鞘磷脂种类。首先，从含有 HeLa 细胞的 10 厘米组织培养皿中取出培养基，然后用 6 毫升冰冷的 PBS 冲洗细胞两次。
然后将 1 毫升冰冷的 PBS 加入 10 厘米的组织培养皿中，并使用细胞刮刀收获细胞。从培养皿表面取出后，将细胞转移到两毫升硅化塑料管中。离心后，去除上清液，向每个细胞沉淀中加入 1 毫升甲醇。
然后短暂涡旋试管。接下来，将样品放入浴式超声仪中，以 200 瓦的功率超声处理 5 分钟。完成后，将整个细胞匀浆转移到装有特氟龙衬里螺帽的试管中。
现在将 1 毫升甲醇、1 毫升氯仿、0.8 毫升双蒸水加入 50 微升 10 微摩尔内标中。盖上试管，并在室温下以 2， 500 rpm 的转速剧烈涡旋 5 分钟。然后向每个试管中再加入 1 毫升氯仿和 1 毫升双蒸水。
同样，在室温下以 2， 500 rpm 的转速剧烈涡旋试管 5 分钟。接下来，离心样品以完全分离水相和有机相。将下层相转移到一次性玻璃管中。
将 2 毫升氯仿加入试管中。然后在室温下以 2， 500 rpm 的速度剧烈涡旋试管 5 分钟，以充分混合上相和相间绒毛。第二次离心后，将改性后的下相与初始下相一起转移到一次性玻璃管中。
现在将玻璃管置于氮气流下约 60 分钟，并完全去除收集的下层相中的有机溶剂。最后，用 500 μL 甲醇或乙醇重构样品。用 0.02 微米过滤器将所得混合物过滤到玻璃瓶中。
然后将样品储存在零下 20 摄氏度。对标准化合物进行连续稀释，并将每种浓度的 50 μL 添加到单独的试管中。接下来，通过向第一个样品添加标准曲线下边界三倍以内的量，第二个样品在曲线中心附近添加一个量，第三个样品在标准曲线上限附近添加一个量，制备三个质量控制样品。
然后将细胞匀浆加入 1 毫升甲醇中放入每个试管中，并使用刚刚显示的方法从每个样品中提取总脂质分数。首先，准备流动相。将乙腈、甲醇和双蒸水以 2 比 2 比 1 的比例混合在一起，形成水相。
使用异丙醇作为玻璃瓶中的有机相，并带有特氟龙内衬螺帽。然后在浴式超声仪中对两种流动相进行超声处理 5 分钟。然后将终浓度为 26.4 毫摩尔的甲酸和 14.9 毫摩尔的氢氧化铵加入每个流动相中。
对于定性分析，激活高效液相色谱系统。将进样管放入装有流动相的玻璃瓶中，并吹扫 HPLC 管路。然后将 C18 HPLC 色谱柱连接到 HPLC 系统。
将柱温箱中的温度保持在 50 摄氏度，并使用水性流动相以每分钟 100 μL 的速度调节色谱柱。在运行过程中，将样品放入自动进样器的样品架中。设置用于三阶段质谱分析的三重四重和四重线性离子阱质谱系统的参数，如随附文本方案的表 1 和表 2 中所列。
此外，按照随附的文本方案中更详细的说明，设置目标 SM 物种的第一和第二母离子的参数。创建批处理文件并提交批处理文件，通过液相色谱电喷雾电离串联质谱分析获得每种鞘磷脂种类的 MS 三产物离子谱数据。通过液相色谱电喷雾电离串联质谱分析获得感兴趣的鞘磷脂物种的三相 MS 产物离子谱。
然后，通过比较子离子谱在鞘氨醇长链碱基和目标 n-酰基部分的精确质量数中的质荷比，为每个 MS 分配鞘磷脂的三个子离子谱图。如随附文本方案中所述，使用液相色谱电喷雾电离串联质谱分析定量分析鞘磷脂。然后使用软件进行数据集成处理多反应监测数据，以获得每种鞘磷脂物种提取的离子色谱图的峰面积数据。
量化每种鞘磷脂物种并按照随附文本协议中的描述构建标准曲线。此处显示了从 HeLa 细胞中提取的脂质样品中化学合成的鞘磷脂和鞘磷脂的光谱。值得注意的是，在两个样品中，去甲基化鞘氨醇磷酸胆碱的光谱强度都大于 SM n-酰基部分的光谱强度。
同样有趣的是，对应于鞘氨醇-1-磷酸盐的光谱可用于推测鞘磷脂的鞘氨醇长链碱基的碳键和双键的数量。在目前的定量方法中，精确制备样品以构建校准曲线以验证该方法至关重要。与使用 1 或 1 的加权因子相比，使用加权因子等于 1 的 x 平方的曲线明显改善了低浓度拟合的曲线。
这项技术为生物学和工业领域的研究人员表征生物样品和化妆品等工业产品中的各种鞘磷脂物种铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何精确分析生物样品中每种鞘磷脂种类的数量和结构有了很好的了解。不要忘记，使用吸收剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的玻璃佩戴物。
此外，戴上手套以防止手上的脂质污染也很重要。
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概述
该协议概述了一种使用多重反应监测和MS/MS/MS技术来量化和定性鞘磷脂种类的方法。它旨在通过对生物样品中鞘磷脂的精确分析，提供对脂质生物学的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 脂质生物学
- 质谱学
- 生物样品分析
背景
- 鞘磷脂是细胞膜中重要的脂质。
- 了解其结构和数量对于脂质研究至关重要。
- 该方法增强了鞘磷脂种类的表征。
- 它解决了脂质生物学中的关键问题。
研究目的
- 分析鞘磷脂种类的数量和结构。
- 提高对脂质生物学的理解。
- 为生物样品中的脂质表征提供可靠的方法。
使用的方法
- 从HeLa细胞中进行细胞培养和收获。
- 使用冰冷PBS对细胞进行冲洗和收获。
- 通过离心分离细胞沉淀。
- 使用甲醇提取鞘磷脂。
主要结果
- 成功表征了各种鞘磷脂种类。
- 证明了色谱质谱系统的有效性。
- 提供了详细的脂质分析协议。
- 为理解脂质生物学做出了贡献。
结论
- 该方法允许对鞘磷脂种类进行精确分析。
- 可以应用于各种生物样品。
- 增强了对生物系统中脂质作用的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise structural and quantitative analysis of sphingomyelin species in biological samples, supporting lipid biomarker discovery and mechanistic de-risking in early drug development. By characterizing sphingomyelin composition, it enhances target validation in pathways involving membrane lipid dynamics and signaling. The approach provides predictive confidence for lipid-modulating therapeutics and supports portfolio triage through quantitative lipid profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sphingolipid metabolism pathways to clarify therapeutic hypotheses in lipid-related diseases.
- Operational Value: Provides qualitative structural data via MS3 to identify sphingoid long-chain base and N-acyl moiety composition for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative sphingomyelin measurements using stable isotope-labeled internal standards for assay standardization.
- Operational Value: Supports reproducible lipid extraction and LC-MS/MS workflows suitable for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant sphingolipid profiling in preclinical models to align with translational biomarker strategies.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation through consistent lipid quantification across sample types.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural lipid data that informs target selection and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying sphingomyelin species involved in cellular signaling and membrane dynamics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lipid extraction and MRM-based detection for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates quantitative peak area data and qualitative MS3 spectra to compare lipid modulation across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling sphingomyelin profiling in disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lipid analysis platform applicable across therapeutic areas involving membrane biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in lipid target validation through precise structural and quantitative sphingomyelin data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via isotope-labeled internal standards and standardized extraction protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-targeting compounds based on quantitative sphingomyelin response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, LC-MS/MS operation, and MS3 data interpretation for structural elucidation.
- Dependent on access to triple quadrupole or linear ion trap mass spectrometry systems capable of MS3 acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of lipid extraction and derivatization protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse biological matrices beyond cultured cells.
- Limited by the availability of sphingomyelin isotope standards for accurate quantification across diverse lipid species.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Preparation of Lipid Samples
3:06
Sample Preparation for Calibration Curve and Method Validation
3:50
SM Analysis by LC-ESI-MS/MS
5:33
Batch File Creation and Assigning the MS Three Product Ion Spectra of Sphingomyelin
6:23
Quantitative Analysis of SM by LC-ESI-MS/MS
7:02
Results: Validating the Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin
8:01
Conclusion
