Name: 用两个稳定 Isotopically 标记鞘磷脂种鞘磷脂的定量和定性方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习使用多重反应监测和串联质谱技术对生物样本中的鞘磷脂进行精确定量与定性分析。该方法适用于HeLa细胞培养物，可详细表征各类鞘磷脂分子结构。

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本研究得到了日本文部科学省科学研究费补助金（KAKENHI）对 K.H.（#15K01691）、Y.F.（#15K08625）、K.Y.（#26461532）的资助，以及厚生劳动省难治性疾病研究事业（K.Y. #201510032A）的资助。我们感谢 Edanz Group（www.edanzediting.com/ac）对本文初稿的编辑工作。

使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。佩戴手套以尽量减少皮肤来源的SM对样品的污染。本实验方案适用于在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1,000 U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的Eagle最小必需培养基中培养的HeLa细胞。
1. 脂质样品的制备
注意：所有玻璃器皿（包括带聚四氟乙烯衬里螺旋盖的试管）均必须不含洗涤剂。
<ol>
	<li>采用 Bligh &amp; Dyer 法从细胞匀浆中提取总脂质组分7
	<ol>
		<li>从 10 cm 组织培养皿中移除培养基（或条件培养基），并用 6 mL 冰冷的 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>使用 P1000 移液器向 10 cm 组织培养皿中加入 1 mL 冰冷 PBS。用细胞刮刀收集细胞，并转移至 2.0 mL 硅化塑料离心管中。</li>
		<li>离心（1,000 × g，5 分钟，4 °C）后，用 P1000 移液器移除上清液。</li>
		<li>加入 1 mL 甲醇。短暂涡旋振荡管体，并在浴式超声仪中以 200 W 超声处理 5 分钟。 
		注：调节浴式超声仪中的水位，以确保细胞沉淀被有效匀浆。</li>
		<li>用移液器将甲醇中的细胞匀浆转移至带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的试管（13 mm × 100 mm）中。</li>
		<li>向每支试管中加入 1 mL 甲醇、1 mL 氯仿、0.8 mL 双蒸水和 50 µL 浓度为 10 µmol/L 的内标物 d18:1/(D31)-16:0 SM。</li>
		<li>在室温下剧烈涡旋振荡试管 5 分钟。 
		注：此时形成单一相（氯仿/甲醇/水 = 1/2/0.8（v/v/v））。</li>
		<li>加入 1 mL 氯仿和 1.0 mL 双蒸水。</li>
		<li>在室温下以 2,500 rpm 剧烈涡旋振荡试管 5 分钟。 
		注：此时水相（上层）与有机相（下层）分离。</li>
		<li>离心（2,150 × g，5 分钟，25 °C）后，收集下层相并转移至一次性玻璃试管中（初始下层相）。 
		&#8203;注：使用巴斯德移液器和安全移液过滤器收集下层相。将移液器尖端插入下层相中，挤压靠近“E”阀的小球以排出移液器尖端内的上层相及界面絮状物，然后虹吸下层相进入移液器。</li>
		<li>向试管中加入 2 mL 氯仿，并在室温下以 2,500 rpm 剧烈涡旋振荡 5 分钟，使其与上层相及界面絮状物充分混合。</li>
		<li>离心（2,150 × g，5 分钟，25 °C）后，按照步骤 1.1.10 所述方法，将经处理后的下层相收集并转移至含有初始下层相的一次性玻璃试管中。</li>
		<li>将玻璃试管置于氮气流下，完全去除收集到的下层相中的有机溶剂。</li>
		<li>用 500 µL 甲醇或乙醇重新溶解样品，经 0.02 µm 滤膜过滤后，储存于玻璃小瓶中，置于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建校准曲线及方法验证的样品制备
	<ol>
		<li>向带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的试管中分别加入 50 µL 浓度为 0.1、0.5、1、5、10 或 50 µmol/L 的标准品（d18:1/(D9)-18:1 SM）。</li>
		<li>向每支试管中加入细胞匀浆，并用甲醇定容至 1 mL。 
		注：作为基质的细胞匀浆用量根据各实验而异。若常规分析来自 10 cm 培养皿中细胞的 SM 物种，则每支试管中的细胞匀浆量应接近一个 10 cm 培养皿中的细胞量。</li>
		<li>按照步骤 1.1.6–1.1.14 所述方法提取总脂质组分。</li>
		<li>按照步骤 1.2.1–1.2.3 制备用于方法验证的质量控制（QC）样品。制备三种不同浓度的标准品（d18:1/(D9)-18:1 SM）QC 样品：一种浓度接近标准曲线下限的 3 倍（QC-低，QC-L），一种接近标准曲线中点（QC-中，QC-M），一种接近标准曲线上限（QC-高，QC-H）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法进行鞘脂分析
<ol>
	<li>流动相的制备
	<ol>
		<li>混合溶剂（乙腈/甲醇/ddH₂O）2O = 2/2/1（v/v/v）的水相与异丙醇的有机相置于带聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃瓶中，在浴式超声仪中超声处理5分钟。</li>
		<li>加入甲酸（终浓度 26.4 mmol/L）和 NH4OH（14.9 mmol/L）加入每种流动相中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液相色谱-电喷雾电离质谱法对SM的定性分析3
	<ol>
		<li>启动高效液相色谱（HPLC）系统，将进样管插入装有流动相的玻璃瓶中，并对HPLC管路进行冲洗。连接一根C18 将高效液相色谱柱（1.5 mm 内径 × 100 mm 长度，粒径 3.0 µm）连接至高效液相色谱系统，保持柱温箱温度为 50 °C，并以水相流动相在 100 µL/min 流速下平衡色谱柱。将样品放入自动进样器的样品架中。</li>
		<li>设定三重四极杆与四极杆线性离子阱质谱系统的 MS 参数3 分析如所列于 表1 和 表2 以及目标SM物种的第一和第二前体离子。
		<ol>
			<li>双击数据采集软件图标，双击“硬件配置”，选择“LC+QTRAP4500+Valve”，然后点击“激活配置”。</li>
			<li>单击“新建子项目”和“确定”以创建新的子文件夹。</li>
			<li>单击“文件”选项卡，选择“新建”，然后选择“采集方法”并点击“确定”。单击“质谱”图标和“MS”选项卡。将扫描类型设置为“MS/MS/MS（MS3）”，扫描速率为10,000 Da/s，极性为“负离子模式”，持续时间设置为待分析的整个时间段（min）。设置 m/z “开始（Da）”和“结束（Da）”作为扫描范围。设置 m/z 目标感兴趣SM物种的第1和第2个前体离子。 
			注意：若要分析多种SM物质，需高亮“-MS3”图标，右键单击，选择“复制此实验”，然后将其放入 m/z 其他鞘脂（SM）种类的第1和第2级前体离子。</li>
			<li>选择“Advanced MS”选项卡，并按如下设置各项参数：扫描模式设为“Profile”，步长设为0.12（Da），Q1和Q3分辨率分别设为“Unit”和“LIT”，强度阈值设为0，设定时间设为50（ms），质量范围间暂停时间设为1.5 ms，选择“Dynamic fill time”，Q3入口势垒设为8 V，激发时间设为25 ms。</li>
			<li>单击“MS”选项卡中的“编辑参数”按钮，然后选择“源/气体”选项卡。根据下表设置帘气、碰撞气、离子喷雾电压、温度、离子源气体1和气体2的参数 表1然后选择“化合物”选项卡。按照所列参数设置去簇电压、入口电压、碰撞能量、激发能量和碰撞能量展宽。 表2.</li>
			<li>高亮“集成Valco阀门”，将“步骤0的位置名称”设为A，将B设为5.0 min的总时间位置，同时将A设为70.0 min的总时间位置。</li>
			<li>高亮选择“Shimadzu LC系统”。点击“Pump”选项卡，设置泵流模式为二元流，总流速为0.28 mL/min，压力上限为20.0 MPa。点击“Aautosampler”选项卡，设置清洗体积为200 µL，进样针行程为52 mm，清洗速度为35 µL/s，进样速度为5.0 µL/s，吹扫时间为25.0 min，浸入清洗时间为5 s，清洗模式为“吸样前后清洗”。
			<ol>
				<li>此外，启动冷却单元，将冷却温度设为 4 °C，控制瓶针行程设为 52 mm。选择“烘箱”选项卡，启用烘箱，并将烘箱温度和最高温度分别设置为 50 °C 和 85 °C。</li>
				<li>选择“控制器”选项卡并勾选“开机”复选框。进入“时间程序”选项卡，设置溶剂梯度如下：溶剂A/B以100/0的比例保持5分钟，随后在4分钟内线性改变至80/20，再在50分钟内线性改变至35/65，接着在1分钟内线性改变至25/75。之后保持25/75比例10分钟，再在4分钟内线性恢复至100/0。设置完成后保存方法。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>创建批处理文件
		<ol>
			<li>双击“构建采集批次”图标，点击“添加集合”、“添加样品”，设置新样品的数量，然后点击“确定”。</li>
			<li>单击“方法编辑器”按钮并选择要使用的方法。如果一个批处理文件中使用了多种方法，请勾选“使用多种方法”复选框，并为每个样品选择相应的采集方法。重命名“样品名称”，设置“进样瓶位置”的正确编号，并输入进样体积。然后保存批处理文件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>获取质谱数据3 LC-ESI-MS 法测定目标 SM 物种的产物离子谱3 分析
		<ol>
			<li>在批处理文件中选择“提交”选项卡，选中待分析的样本行，然后点击“提交”按钮。</li>
			<li>点击“查看队列”图标、“平衡”图标，选择要使用的采集方法，将时间设置为1分钟，然后点击“确定”。</li>
			<li>取消勾选“保留仪器用于调谐”选项，然后点击“开始样品”图标以运行批处理序列。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分配每个质谱3 通过比较质荷比（m/z产物离子谱图的精确质量以及鞘氨醇类长链碱基（LCB）的精确质量 N- 感兴趣的酰基部分。确定鞘氨醇长链碱基（LCB）中的碳原子数和双键数 N-根据相应的产物离子确定酰基部分。
		<ol>
			<li>确认已选择正确的子项目文件夹，然后双击“打开数据文件”图标，并选择待分析的样品。在色谱图中拖动每个目标鞘脂（SM）物种的峰，然后双击。获取的MS3 拖拽区域内的产物离子谱图将被呈现。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法对SM进行定量分析
	<ol>
		<li>按照步骤2.1和2.2.1中所述设置流动相和高效液相色谱柱。</li>
		<li>将三重四极杆与四极杆线性离子阱质谱系统的参数设置为多反应监测（MRM）分析，具体参数如以下所列 表1 和 表2.
		<ol>
			<li>按照步骤 2.2.2.1 和 2.2.2.2 中所述进行操作。</li>
			<li>点击“文件”选项卡，选择“新建”，然后选择“采集方法”并点击“确定”。点击“质谱”图标和“MS”选项卡。将扫描类型设置为“MRM”，极性设置为“正离子模式”。将“持续时间”设置为需要分析的整个时间段。设置 m/z [ M + H ] 的+ 将184分别设置为目标SM物种的“Q1质荷比（Da）”和“Q3质荷比（Da）”。将“时间”设为10 ms，将“ID”设为目标SM物种的名称。</li>
			<li>选择“高级质谱”选项卡，并按如下设置各项参数：Q1 和 Q3 的分辨率均设为“单位分辨率”，强度阈值设为 0，设定时间设为 0（ms），质量范围间暂停时间为 5 ms。</li>
			<li>单击“MS”选项卡中的“编辑参数”按钮，然后选择“源/气体”选项卡。将帘气、碰撞气、离子喷雾电压、温度、离子源气体1和气体2的参数设置为下表所列数值 表1然后选择“化合物”选项卡。将去簇电压、入口电压、碰撞能量和碰撞池出口电压的参数设置为下表所列数值。 表2.</li>
			<li>按照第2.2.2.6步所述设置阀门。</li>
			<li>按照步骤2.2.2.7中所述设置液相色谱条件，然后保存方法。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照第2.2.3步所述创建批处理文件。</li>
		<li>按照步骤2.2.4所述，通过LC-ESI-MS/MS分析获取每种鞘磷脂（SM）物种的MRM数据。</li>
		<li>使用软件对 MRM 数据进行处理，完成数据积分，并获取各 SM 分子种类提取离子色谱图的峰面积数据。
		<ol>
			<li>双击定量分析中用于数据积分的软件图标，点击“Edit”选项卡并选择“User Integration Defaults”。将高斯平滑宽度设置为1.0点，然后点击“OK”。再次点击“Edit”选项卡并选择“New Results Table”。选择需要积分的样品，点击箭头按钮，然后点击“Next”。选择“Create New Method”，设置方法名称，然后点击“Next”。点击“Next”，并勾选 d18:1/(D31)-16:0 SM 作为内标，单击“下一步”，然后单击“完成”。</li>
			<li>单击“显示峰形审查”，确认色谱图峰被正确识别。需要注意的是，d18:1/(D31)-16:0 SM 的保留时间通常比 34-1 SM（通常由 d18:1/16:0 SM 组成）短约 0.3 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据每种SM物质的峰与d18:1/(D的比值定量每种SM物质31)-16:0 SM 内标
		<ol>
			<li>单击“文件”选项卡，选择“导出”，选择“结果表”，确认格式为“MultiQuant”，列为“导出所有列”，行为“导出除明确隐藏外的所有行”，然后单击“OK”。</li>
			<li>在 Excel 软件中打开导出的文件。通过内标（IS，d18:1/(D31)-16:0 SM）。然后乘以注入样品中内标物（IS）的理论量，以计算注入样品中目标SM物种的含量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建标准曲线
	<ol>
		<li>获取 d18:1/(D 的 MRM 数据9)-18:1 SM 和 d18:1/(D31)-16:0 SM 作为构建标准曲线的样品，进行 LC-ESI-MS/MS 分析，具体步骤如 2.3.1–2.3.4 所述。</li>
		<li>获取 d18:1/(D 的峰面积数据9)-18:1 SM 和 d18:1/(D31)-16:0 SM，操作步骤如2.3.5所述。</li>
		<li>计算 d18:1/(D9)-18:1 SM 在注射样品中的含量，如步骤 2.3.6 所述。</li>
		<li>通过将X轴和Y轴分别设为d18:1/(D的标称量和计算量，绘制趋势线9)-18:1 SM 并获得趋势线公式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Excel 软件验证定量方法
	<ol>
		<li>为验证该方法，定量测定 d18:1/(D9)-18:1 SM 和 d18:1/(D31)-16:0 SM 在质控样本中的含量，需按步骤 2.3.1–2.3.4 所述，于 1 天内对每个质控样本至少分析 3 次，并至少重复 3 天。</li>
		<li>获取峰面积数据并计算 d18:1/(D9)-18:1 SM 在注射样品中的含量，具体操作见步骤 2.3.5 和 2.3.6。</li>
		<li>根据所获得的校准曲线，计算 d18:1/(D9)-18:1 SM 在注入的样品中。</li>
		<li>精密度评估
		<ol>
			<li>计算 d18:1/(D 的平均值和标准差9)-18:1 SM 在第 2.5.3 步中使用 Excel 软件对日内和日间数据集进行分析所得。</li>
			<li>步骤 2.5.4.1 中获得的平均值除以标准差，并以 % 表示。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准确性评估
		<ol>
			<li>按如下方法计算每个数据的准确率： 
			[(步骤 2.5.3 中计算得到的量) / (标称量) - 1] × 100(%)</li>
			<li>计算日内和日间数据集准确率绝对值的平均值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li>
<li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li>
<li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+pathways%2C+functions%2C+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li>
<li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipidomics%3A+high-throughput%2C+structure-specific%2C+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li>
<li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li>
<li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/10.1139/o59-099#.WlOY-N-nHIU">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS%2FMS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability%2C+data+quality%2C+and+assay+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+dissociation%3A+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li>
<li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li>
<li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li>
<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在本定性方法中，我们获得了鞘磷酰胆碱（SPC）和一个N-酰基部分的MS3产物离子。正确指认SPC和N-酰基部分均至关重要。需要注意的是，其他含磷酸胆碱的分子也可能作为MS3产物离子被检测到。二酰基磷脂酰胆碱（PC）和缩醛磷脂-PC在哺乳动物细胞中含量丰富，其疏水性与鞘磷脂（SM）相似。因此，理论上带有同位素（通常为13C）的二酰基-PC和缩醛磷脂-PC可能与SM同时被检测到。在我们的实验中，SM分析时同时观察到了缩醛磷脂-PC的MS3产物离子。了解SPC的谱峰强度大于SM的N-酰基部分的强度，有助于正确选择SM的MS3产物离子（图1A和B）。相反，脂肪酰基部分的强度大于（或几乎等于）去甲基化溶血缩醛磷脂-PC的强度（数据未显示）。
在本定量方法中，准确配制用于构建校准曲线和验证方法的样品至关重要...

鞘磷脂（SM）是哺乳动物细胞中常见的一种鞘脂类物质。SM 在细胞内合成1，并作为其他鞘脂类物质（如1-磷酸鞘氨醇和神经酰胺）的前体，这些物质分别在免疫细胞迁移和皮肤屏障稳态中发挥关键作用2,3。因此，对 SM 代谢的精确分析对于阐明鞘脂类物质在生理和病理过程中的作用至关重要。
鞘磷脂（SM）由神经酰胺和连接在神经酰胺1-羟基上的磷酸胆碱组成，其中神经酰胺进一步由鞘氨醇和一个N-酰基部分构成。鞘氨醇和N-酰基部分中碳原子数和双键数的多样性导致了多种神经酰胺（以及SM）分子种类的存在。近年来液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）技术的发展，使得对SM进行定性和定量分析成为可能4,5。在定性分析中，通过指认鞘氨醇长链碱基（LCB）的碎片离子谱图，可确定SM中LCB部分的碳原子数和双键数。然而，由于尚未有关于N-酰基部分对应碎片离子的报道，因此无法直接获得其结构信息，通常需通过前体离子与LCB对应的碎片离子在正负离子模式下的差值分析来推断N-酰基部分的结构4,5。本报告中，我们提出一种利用三重四极杆和四极杆线性离子阱质谱仪在MS3模式下同时检测LCB和N-酰基部分碎片离子的方法，从而有助于更精确地推测每种SM分子的结构6。
生物样品基质引起的离子抑制（或增强）效应会干扰LC-ESI-MS分析中的准确定量。因此，理想的方法是在与生物样品相同的基质中为所有目标分析物建立校准曲线。然而，该策略并不可行，因为在生物样品中几乎无法制备出所有鞘磷脂（SM）种类，尤其是在进行全面分析时。因此，实际可行的方法是使用在生物样品中添加的一种代表性SM种类来建立校准曲线并确定定量范围。我们采用两种同位素标记的SM种类建立校准曲线：一种用作内标物，另一种用作标准品。我们在添加了同位素标记SM标准品的生物样品中检测到了微量信号，并成功获得了校准曲线及定量范围6。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>硅化 2.0 mL 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>试管</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（Teflon）衬垫螺旋盖</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>一次性玻璃试管</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm 内径 × 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>保护柱插入柱套中，并与 C18 柱连接</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm × 10 mm 保护柱</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>柱套</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% 氨水</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器（水浴型）</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>用于玻璃试管的涡旋混合器</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL 玻璃小瓶</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>样品储存于带螺旋盖和 8 mm 隔垫密封的 1.4 mL 玻璃小瓶中，保存于 -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm 隔垫</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>分析样品时，将螺旋盖更换为带切口隔垫的螺旋盖</td></tr><tr><td>1.4 mm 玻璃小瓶用螺旋盖</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>带切口隔垫的螺旋盖</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>三重四极杆与四极杆线性离子阱质谱仪</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>用于采集和分析产物离子谱的数据软件</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>用于定量分析中数据积分的数据软件</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 鞘磷脂</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>鞘氨醇磷酸胆碱</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>伊格尔（Eagle&amp;rsquo;s）最低必需培养基</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

我们介绍一种利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对鞘磷脂（SM）进行定性和定量分析的方法。SM 是一种常见的鞘脂类物质，其亲水部分为磷酸胆碱，疏水部分为神经酰胺。由于神经酰胺中的鞘氨醇长链碱基（LCB）和 N-酰基部分存在多样性，哺乳动物细胞中存在多种 SM 分子种类。本报告中，我们展示了一种基于 MS/MS/MS（MS3）实验中相应碎片离子来推断 LCB 和 N-酰基部分的碳原子数及双键数的方法。此外，我们还介绍了一种使用两种稳定同位素标记的 SM 分子进行 SM 定量分析的方法，有助于确定 SM 定量分析的适用范围。该方法将有助于对生物样本及化妆品等工业产品中的多种 SM 分子种类进行表征。

采用化学合成的 d18:1/24:0 SM（图1A）以及从 HeLa 细胞中提取的脂质样品中的 d18:1/24:0 SM（图1B）进行 LC-ESI-MS3 分析，分别以 [M+HCOO]- 和 [M-CH3]- 作为第一级和第二级母离子。需要注意的是，去甲基化鞘氨醇磷酸胆碱（SPC）（m/z 449）的谱图强度高于 SM 的 N-酰基部分（m/z 378）。此外，对应于 [M-胆碱-CH3 (鞘氨醇-1-磷酸)]- 的谱图也有助于确定 SM 的长链碱基（LCB）。我们还证实，在本实验的 MS3 分析条件下，去甲基化 SPC（m/z 449）的谱图主要来源于 d1...

本文介绍了一种利用多反应监测和串联质谱/三级质谱模式分别对每种鞘磷脂组分进行定量和定性分析的实验方案。

我们介绍了一种通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法对鞘磷脂（SM）进行定性和定量分析的方法。

本实验的总体目标是精确分析生物样品中每种鞘磷脂组分的含量及其结构。该方法有助于解答脂质研究领域中有关脂质生物学和脂质代谢的关键问题。该技术的主要优势在于，我们可通过色谱-质谱联用系统对生物样品中的多种鞘磷脂组分进行表征。首先，从含有HeLa细胞的10厘米组织培养皿中移除培养基，并用6毫升冰上预冷的PBS缓冲液冲洗细胞两次。然后向10厘米的组织培养皿中加入1毫升冰冻的PBS，并使用细胞刮刀收集细胞。细胞从培养皿表面脱离后，将细胞转移至2毫升硅化塑料管中。离心后，弃去上清液，并向每份细胞沉淀中加入1毫升甲醇。然后短暂涡旋振荡试管。接着将样品放入浴式超声仪中，在200瓦功率下超声处理5分钟。完成后，将整个细胞匀浆转移至配有聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的试管中。向每支试管中加入1毫升甲醇、1毫升氯仿、0.8毫升双蒸水以及50微升浓度为10微摩尔的内标物。盖紧管盖，在室温下以2,500 rpm剧烈涡旋振荡5分钟。然后向每支试管中再加入1毫升氯仿和1毫升双蒸水。再次在室温下以 2,500 rpm 的速度剧烈涡旋振荡试管 5 分钟。接着离心样品，以彻底分离水相和有机相。将下层相转移至一次性玻璃试管中。向试管中加入 2 毫升氯仿。然后在室温下以 2,500 转/分钟剧烈涡旋振荡 5 分钟，以充分混合上层相和中间相絮状物。经过第二次离心后，将修饰后的下层相与初始下层相一同转移至一次性玻璃试管中。现在将玻璃管置于氮气流下约60分钟，彻底除去收集到的下层相中的有机溶剂。最后，用500微升甲醇或乙醇重新溶解样品。使用0.02微米滤膜将所得混合物过滤至玻璃小瓶中。然后将样品在-20摄氏度下保存。对标准品进行系列稀释，并将每种浓度的50微升分别加入不同的试管中。接下来，制备三个质控样品：向第一个样品中加入接近标准曲线下限三倍浓度的量，向第二个样品中加入接近标准曲线中心浓度的量，向第三个样品中加入接近标准曲线上限浓度的量。然后将一毫升甲醇中的细胞匀浆液加入每支试管中，并使用刚刚展示的方法从每个样品中提取总脂质组分。首先，配制流动相。按2:2:1的比例混合乙腈、甲醇和双蒸水，作为水相。使用异丙醇作为有机相，盛装于带聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃瓶中。随后将两种流动相置于浴式超声仪中，超声处理5分钟。然后向每种流动相中分别加入甲酸，使其终浓度为26.4毫摩尔，以及14.9毫摩尔的氢氧化铵。进行定性分析时，启动高效液相色谱系统。将进样管插入装有流动相的玻璃瓶中，并对高效液相色谱管路进行冲洗。然后将C18高效液相色谱柱连接至高效液相色谱系统。将色谱柱温箱的温度保持在50摄氏度，并以100微升/分钟的流速用 aqueous 流动相平衡色谱柱。运行过程中，将样品放入自动进样器的样品架中。根据随附文本方案中的表一和表二所列参数，设置三重四极杆和线性离子阱串联质谱系统，用于三级质谱分析。同时，按照随附文本方案中详细描述的方法，设置目标鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）种类的第一和第二前体离子参数。创建批处理文件，并提交该批处理文件，通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析，获取每种鞘磷脂种类的三级质谱产物离子谱图数据。通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析，获得目标鞘磷脂种类的三级质谱产物离子谱图。然后，通过比较产物离子质谱图中目标鞘氨醇长链碱基和n-酰基部分的精确质荷比，分别为每种鞘磷脂指派三个产物离子质谱。按照随附文本方案所述，采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析对鞘磷脂进行定量分析。随后，使用软件处理多反应监测数据，进行数据积分，以获得每种鞘磷脂分子物种的提取离子色谱峰面积数据。定量分析每种神经鞘磷脂（Sphingomyelin）组分，并按照随附文本方案中的描述绘制标准曲线。此处展示了化学合成的神经鞘磷脂以及从HeLa细胞中提取的脂质样品中所含神经鞘磷脂的质谱图。值得注意的是，在两个样品中，去甲基鞘氨醇磷酸胆碱（demethylated sphingosylphosphorylcholine）的信号强度均高于SM的n-酰基部分。此外，鞘氨醇-1-磷酸对应的质谱峰可用于推测鞘磷脂中鞘氨醇长链碱基的碳原子数和双键数目。在本定量方法中，为验证该方法而精确制备用于构建校准曲线的样品至关重要。与使用权重因子为1或1/x相比，采用权重因子为1/x²时，低浓度下的曲线拟合明显得到改善。该技术为生物学和工业领域的研究人员提供了表征生物样本及工业产品（如化妆品）中多种鞘磷脂种类的方法。观看本视频后，您应能够准确理解如何分析生物样本中每种鞘磷脂的含量及其结构。请注意，操作吸收性试剂时可能存在极高危险性，因此在执行该实验步骤时，必须采取适当防护措施，例如正确佩戴防护眼镜。此外，必须佩戴手套，以防止手部分泌的脂质造成污染。

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

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生物化学

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利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

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