Name: 万古霉素滴入硫酸钙和自体骨治疗兔骨感染的改进模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习使用万古霉素载入硫酸钙与自体骨治疗兔骨感染的标准化模型方法。该模型通过骨蜡封堵实现一致菌量，为骨感染发病机制、骨不连治疗及跨物种研究提供可靠实验基础。

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本工作得到国家自然科学基金（81803808，81873062）、浙江省医药卫生科技计划基金（2017KY271）和浙江省科技计划项目（2017C37181）的支持。

本研究中使用的兔子均按照《实验动物护理与使用指南》进行处理。所有实验程序均遵循浙江中医药研究院生物伦理委员会的规定。
1. 细菌悬液的制备
<ol>
	<li>将0.5 mg的S. aureus冻干粉（ATCC 6538）溶于0.3 mL LB培养基中，充分混匀悬浮液。</li>
	<li>将细菌悬浮液划线接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，于37 °C培养16小时。</li>
	<li>挑取单个细菌菌落形成单位（CFU），接种于胰蛋白胨大豆肉汤管中培养24小时。在37 °C继续传代培养约24小时，于培养16至18小时、600 nm处光密度（OD）值达到0.6时，获得对数中期生长的细菌14。</li>
	<li>取1 mL细菌悬浮液转移至离心管中，在825 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。用100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并洗涤细菌，重复此步骤3次。最后用3 mL PBS重悬细菌。</li>
	<li>采用McFarland比浊法估算细菌浓度15。
	<ol>
		<li>将100至500 µL细菌悬浮液加入比色管中，直至浊度与0.5 McFarland标准管相当。</li>
		<li>通过目视与0.5 McFarland标准管比较浊度，当细菌浓度约为108 CFU/mL时即达到要求。 
		注意：确保细菌悬浮液的体积足以满足后续实验操作。每只兔子使用的细菌悬浮液体积少于1 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取0.2 mL细菌悬浮液涂布于琼脂平板，均匀涂开。于37 °C培养16小时后，计数细菌菌落数量，以验证细菌悬浮液的CFU浓度。</li>
</ol>
2. 骨感染模型的制备
<ol>
	<li>将3月龄的雄性新西兰白兔饲养在独立的笼子中，环境温度控制在（20 ± 1 °C），光照周期为12小时光照/12小时黑暗。每日提供常规饲料和自来水。</li>
	<li>确保手术时兔子体重超过3 kg。</li>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠（每100 g体重3 mg）对兔子进行麻醉。通过捏压兔爪无反应来确认兔子已完全麻醉。在手术过程中将兔子固定于手术台上。 
	注意：确保造模过程持续时间少于1小时。</li>
	<li>使用电动剃刀逆毛发生长方向剃除胫骨近端区域的毛发。用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。</li>
	<li>用笔和尺标记胫骨上端及用于注射金黄色葡萄球菌（S. aureus）的钻孔位置（距胫骨上端1.5 cm）。确保钻孔位置水平位于胫骨平台的中线处（图1A）。</li>
	<li>使用11号手术刀切开胫骨皮肤，并在骨膜上做1 cm切口（图1B,C）。使用电动骨钻在胫骨上钻一个直径为2 mm的孔（图1D）。</li>
	<li>用直径2 mm、高2 mm的骨蜡圆柱体填塞胫骨平台上的2 mm直径孔（图1E）。沿胫骨平台水平面去除多余的骨蜡（图1F）。检查2 mm孔是否完全被骨蜡填充（图1G）。 
	注意：通过观察孔内是否有血液溢出，确认孔内是否完全充满骨蜡。</li>
	<li>使用可吸收缝合线以垂直褥式缝合法缝合骨膜和皮肤，防止动物咬扯缝线（图1H）。</li>
	<li>使用1 mL无菌注射器注入浓度为1 × 108 CFU/mL的S. aureus菌液（每100 g体重30 µL）。确保针头穿透骨蜡，并缓慢将S. aureus菌液注入骨髓腔内（图1I）。</li>
	<li>造模后将动物置于温暖、清洁的环境中，避免热量散失。监测呼吸频率和心率。待兔子苏醒后，将其饲养于单独笼中，自由摄食和饮水。</li>
</ol>
3. 骨感染模型的评估
<ol>
	<li>感染后第 7、14、21 和 28 天，将兔子放入固定器中，使头部和耳朵位于固定器外。</li>
	<li>从耳缘静脉采集 2 mL 血液至含二钾乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝剂的采血管中；从血管采集 1 mL 血液至采血管中。在室温下以 651 × g 的速度离心血清 10 分钟。
	<ol>
		<li>使用血液生化分析仪测定全血白细胞计数（WBC），采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定C反应蛋白（CRP）16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后第 7、14、21 和 28 天，使用戊巴比妥钠（剂量为每 100 g 体重 3 mg）麻醉一只模型兔。使用 11 号手术刀切开胫骨皮肤，并在骨膜上做 2 cm 切口（图 2A）。</li>
	<li>清除骨蜡。使用电动骨钻装置打两个相邻的直径为 4.8 mm 的孔，以清除坏死骨组织（图 2B）。使用骨勺清除坏死的骨髓和肉芽组织（图 2C）。 
	注意：清创过程中应彻底清洁骨组织，避免骨组织残留在骨髓中。</li>
	<li>刮除并清理两个孔之间的骨组织（图 2D）。</li>
	<li>将 1 mL 骨髓均匀涂布于羊血琼脂平板上。在 37 °C 下培养过夜。选择菌落数为 30–300 的平板，并计算菌落数量。</li>
	<li>感染后第 28 天结束时，沿膝关节和踝关节边缘取胫骨标本。将胫骨标本置于 4% 多聚甲醛中固定 24 小时。用 10% EDTA 脱钙 8 周。</li>
	<li>将胫骨标本依次经梯度乙醇脱水，然后包埋于石蜡中。从冠状面连续切取 4 片 5 µm 厚的切片。使用苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色试剂盒对切片进行染色。</li>
	<li>使用显微镜观察染色切片，并用标准软件记录透射光图像。</li>
</ol>
4. VCS 珠的制备
<ol>
	<li>将1 g盐酸万古霉素粉末加入9.5 g医用级硫酸钙中，然后向混合粉末中加入3 mL生理盐水。用刮刀充分混合30至45秒。</li>
	<li>将混合物放入柔性硅胶模具（直径4.8 mm、高4.8 mm的圆柱形）中，在室温下干燥15分钟。通过弯曲模具取出VCS微珠。</li>
</ol>
5. 抗生素治疗与自体骨移植
<ol>
	<li>以每100 g体重3 mg的剂量，用戊巴比妥钠对模型兔进行麻醉，于第28天th 感染后一天。使用电动剃须刀剃除近端胫骨区域的毛发。用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。 
	注意： 确保建模过程少于1小时。</li>
	<li>使用电动剃须刀剃除尾部区域的毛发，并用聚维酮碘溶液对尾部进行消毒。</li>
	<li>使用手术剪剪下尾部。用11号手术刀切开尾部皮肤，暴露尾骨。在尾部区域用可吸收手术缝线以垂直褥式缝合法缝合皮肤，以防止动物啃咬缝线。</li>
	<li>去除所有肌肉、软组织和骨膜。在每个关节处分离尾骨，并将骨碎片转移至含有无菌生理盐水的100 mm塑料培养皿中。</li>
	<li>使用弯头镊子将4粒VCS微珠（直径4.8 mm、高4.8 mm的圆柱体，每粒含1.25 mg万古霉素）植入骨髓腔图2E).</li>
	<li>使用弯头镊子将8块自体骨（每块为直径2 mm、高4 mm的圆柱体）填充至骨缺损处图2E).</li>
	<li>用可吸收外科缝线以褥式缝合法缝合骨膜和皮肤图2F). 
	注意： 手术过程中保持温度为 25 °C。</li>
	<li>术后将动物置于温暖、清洁的环境中，以避免热量散失。监测呼吸频率和心率。苏醒后，将兔子单独饲养在笼内，自由摄食和饮水。</li>
</ol>
6. 抗生素活性的评估
<ol>
	<li>在治疗后的第2、4、6和8周，将兔子放入兔固定器中，并将头部和耳朵置于固定器外。</li>
	<li>使用含EDTA-K2抗凝剂的采血管从耳缘静脉采血。从血管中采集1 mL血液至采血管中，室温下以651 × g 的速度离心血清10分钟。</li>
	<li>使用血液生化分析仪测定全血中的白细胞计数（WBC），并通过ELISA法测定C反应蛋白（CRP）16。</li>
</ol>
7. 骨再生的评估
<ol>
	<li>在治疗后8周或12周结束时，通过注射过量戊巴比妥钠处死兔子。</li>
	<li>沿膝关节和踝关节边缘取胫骨标本，清除肌肉及筋膜层。</li>
	<li>采用显微计算机断层扫描（micro-CT）分析胫骨结构。选择一个直径为4.8 mm、长度为9.6 mm的椭圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。利用位图数据重建三维模型图像。</li>
	<li>从三维模型中选取骨体积/组织体积比（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁数量（Tb.N）和小梁分离度（Tb.Sp）的数值，以评估骨再生情况。</li>
</ol>

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</ol>

作者在本研究中无任何利益冲突。

在以往的研究中，已构建了多种动物模型用于研究急性和慢性骨感染；然而，寻找理想模型的工作仍在继续17,18。此外，理想的骨感染模型应能模拟临床骨感染的病理特征，同时建模周期短、成本低且易于操作。迄今为止，兔骨感染模型是炎症性骨病研究中最常用的模型，因为兔子来源广泛、操作可行且成本低廉。在我们之前的研究中，比较了不同体重兔子的死亡率和感染率。结果表明，兔子体重应超过3 kg；否则，术后将出现较高的死亡率，或较高的菌血症发生率及更高的死亡风险。
与早期研究不同，本研究中的兔骨感染模型及抗生素治疗方案更符合人类疾病的病理特征和外科治疗方式。在以往的研究中，注射十四烯基硫酸钠和S. aureus的动物模型其病理状态无法持续超过60天，且死亡率超过20%12,19。已有研究证实，骨缺损处溢出的S. aureus溶液会导致感染率...

骨感染通常由创伤、骨折或其他骨病后细菌或其他微生物侵入引起1。骨感染可引发严重的炎症反应和骨组织破坏。在临床实践中，Staphylococcus aureus（S. aureus）是导致骨感染的主要致病菌2,3。骨感染具有疼痛剧烈、致残性强的特点，且常呈慢性病程，极难治疗4。目前，清创坏死组织并植入载万古霉素的钙盐（VCS）珠链已被证实为控制局部感染的有效策略5,6。然而，仍有10%至15%的患者在抗感染治疗后出现骨修复过程延长、延迟愈合或不愈合7。大段骨缺损是骨科医生面临的最大难题。自体骨移植被认为是治疗骨不愈合的最佳骨替代方案8,9。
迄今为止，关于骨感染和自体骨移植的研究大多在多种动物模型中进行，例如大鼠、兔子、狗、猪和绵羊10,11。兔子模型是骨感染研究中最常用的模型，最早由 Norden 和 Kennedy 于 1970 年建立12,13。在我们之前的研究中，我们采用了 Norden 的方法建立兔模型，发现注入骨髓的金黄色葡萄球菌（S. aureus）数量无法准确量化，因为骨髓血液外流导致细菌溶液溢出。
本文介绍了一种改良的在兔子身上诱导骨感染的外科手术方法。手术结束后，通过血液生化检测、细菌学检查和组织病理学检查验证骨感染模型。随后植入VCS以抑制感染，并植入自体骨以促进骨再生。

<table><tbody><tr><td>可吸收外科缝合线</td><td>Jinghuan</td><td>18S0604A</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器</td><td>Jinglong</td><td>20170501</td><td></td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>ETHICON</td><td>JH5CQLM</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-K2抗凝血管</td><td>XINGE</td><td>20170802</td><td></td></tr><tr><td>电动骨钻装置</td><td>Bao Kang</td><td>BKZ-1</td><td></td></tr><tr><td>电动剃刀</td><td>Codos</td><td>3800</td><td></td></tr><tr><td>柔性硅胶模具&amp;nbsp;</td><td>WRIGHT</td><td>1527745</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红染色试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>20170523</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Luria-Bertani培养基）</td><td>Baisi Biothchnology</td><td>20170306</td><td></td></tr><tr><td>医用级硫酸钙</td><td>WRIGHT</td><td>1527745</td><td></td></tr><tr><td>显微计算机断层扫描（micro-CT）</td><td>Bruker</td><td>SkyScan 1172&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CX41</td><td></td></tr><tr><td>新西兰白兔</td><td>Zhejiang Experimental Animal Center&amp;nbsp;</td><td>SCXK 2014-0047</td><td></td></tr><tr><td>11号手术刀片&amp;nbsp;</td><td>Yuanlikang</td><td>20170604</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Mingsheng</td><td>20170903</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TBD(Jingyi)</td><td>20170703-0592</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Merk</td><td>2070124</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Lierkang</td><td>20170114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt; 冻干粉</td><td>中国普通微生物菌种保藏管理中心</td><td>ATCC 6538</td><td></td></tr><tr><td>羊血琼脂</td><td>HuanKai Microbial</td><td>3103210</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂平板</td><td>HuanKai Microbial</td><td>3105697</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤管</td><td>HuanKai Microbial</td><td>3104260</td><td></td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>Lilly</td><td>C599180</td><td></td></tr></tbody></table>

采用改良兔骨感染模型研究万古霉素负载硫酸钙联合自体骨移植的治疗效果

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

骨感染由细菌侵入引起，在临床、骨科及创伤外科中极难治疗。骨感染可能导致持续性炎症、骨髓炎以及最终的骨不连。建立一种可行且可重复的动物模型对骨感染研究和抗生素治疗至关重要。作为一种体内模型，兔模型在骨感染研究中被广泛应用。然而，既往关于兔骨感染模型的研究显示，感染状态不一致，细菌数量存在变异。本研究提出一种改良的手术方法，通过将细菌阻滞于骨髓内，以在兔体内诱导骨感染。随后可进行多层次评估，以验证该建模方法。
通常，清创坏死组织并植入载万古霉素的硫酸钙（VCS）是抗生素治疗中的主要方法。尽管VCS中的硫酸钙有利于成骨细胞爬行和新骨生成，但在清创后仍会出现大段骨缺损。自体骨（AB）是一种具有吸引力的策略，可用于修复清创坏死骨后形成的大段骨缺损。
在本研究中，我们采用尾骨作为自体骨移植材料植入骨缺损区域。动物处死后，通过显微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析评估骨修复情况。结果显示，在VCS组中， consistently 出现骨不连。相比之下，VCS-AB组的骨缺损区域显著减小。本研究所描述的建模方法提供了一种可重复、可行且稳定的骨感染模型制备方法。VCS联合自体骨治疗在抗生素治疗后显著降低了骨不连的发生率。改进的骨感染模型以及VCS与自体骨的联合治疗策略，有助于深入研究与创伤骨科相关的骨感染及骨再生机制。

骨感染模型的评价 
在接种S. aureus后，兔子的病理表现与临床上慢性骨髓炎的典型症状相似。本研究中，30只兔子被感染并作为模型组，另设10只兔子作为对照组。所有模型组兔子胫骨局部均出现感染性窦道，窦道口有白色或黄色脓液溢出（图3A）。H&amp;E染色结果显示，模型组中细菌聚集物位于死骨周围，且无法辨认出正常的骨细胞。模型组的CRP和WBC水平均高于对照组（图3B）。将坏死骨髓裂解液划线接种于琼脂平板，感染后模型组菌落数明显增多（图3C）。造模结束时，有3只兔子因严重感染死亡。其余成功感染的兔子被确认为骨感染模型，并分为3组：模型组、VCS组和VCS-AB组。
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本研究通过在骨髓中阻滞等量细菌，建立了一种改良的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染兔模型。采用载万古霉素的硫酸钙联合自体骨进行抗生素治疗及骨修复治疗。该方案有助于骨感染与再生的研究。

骨感染由细菌侵入引起，在临床、骨科及创伤外科中极难治疗。骨感染……

可复制的动物模型对于骨感染研究至关重要。然而，目前尚无感染状态和细菌数量均一致的兔模型。我们的骨感染兔模型采用稳定的细菌接种，并使用载万古霉素的硫酸钙联合自体骨碎片进行治疗。该技术可拓展应用于骨感染的诊断、骨不连治疗以及骨感染发病机制的研究。该方法可为大鼠、小鼠和猪的其他骨感染模型提供参考。将相同体积的细菌悬液注入骨髓存在困难。直观演示有助于研究人员轻松且准确地执行关键步骤。制备细菌悬液时，首先将0.5毫克金黄色葡萄球菌（S.aureus）冻干粉溶解于0.3毫升LB培养基中。充分混匀悬液，然后将细菌划线接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，在37摄氏度下培养16小时。次日早晨，挑取单个细菌菌落，接种于胰蛋白胨大豆肉汤管中，在37摄氏度下培养24小时。当细菌处于对数生长中期时，取1毫升菌液转移至1.5毫升离心管中，通过离心收集细菌。随后，每次用100微升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌体沉淀，共洗涤三次，最后一次洗涤后将细菌重悬于3毫升新鲜PBS中。为建立骨感染模型，首先确认一只三个月大、体重三公斤的雄性新西兰白兔对足部夹捏无反应，然后使用电动剃须刀逆着毛发生长方向剃除近端胫骨区域的毛发。用聚维酮碘溶液对暴露的皮肤进行消毒，并用记号笔和直尺标记胫骨上端以及用于金黄色葡萄球菌（S.Aureus）注射的钻孔位置，注意确保钻孔位置位于胫骨平台的水平中线处。接着，使用11号手术刀片切开皮肤，随后切开腹膜约一厘米。使用电动骨钻设备，在胫骨上钻一个直径两毫米的孔，并用一个直径两毫米、长两毫米的骨蜡圆柱体填塞该孔。清除胫骨平台水平面上多余的骨蜡，并确认孔内已完全填满骨蜡。然后，使用可吸收外科缝线，以垂直褥式缝合法缝合骨膜和皮肤，以防止动物啃咬缝线。使用1毫升无菌注射器，缓慢向钻孔内注入浓度为每毫升1×10⁸个菌落形成单位的金黄色葡萄球菌（S. aureus）溶液。注射后第7、14、21和28天，将感染的兔子放入兔固定器中，头部和耳朵置于固定器外，从耳缘静脉采集血样，用于白细胞和C反应蛋白分析。麻醉后，使用11号手术刀进行胫骨皮肤和腹膜的切口，切口长度为1厘米，并清除骨蜡。接下来，使用电动骨钻设备钻出两个相邻的直径为4.8毫米的孔，以清除坏死骨组织，并用骨勺刮除坏死的骨髓及肉芽组织。然后，刮除并清理两孔之间的骨组织，并将1毫升清除的骨髓样本均匀涂布于羊血琼脂平板上，在37摄氏度条件下过夜培养。次日早晨，选取菌落数量在30至300之间的平板，计算每只感染动物的菌落形成单位数量。感染后第28天，将1克盐酸万古霉素粉末加入9.5克医用级硫酸钙中，用刮刀加入3毫升生理盐水搅拌30至45秒。将混合物倒入柔性硅胶模具中，在室温下干燥15分钟。随后弯曲模具，取出载有万古霉素的硫酸钙（VCS）小珠。对于抗生素治疗及自体骨移植，首先在剃除尾部区域毛发并用聚维酮碘溶液对暴露的尾部皮肤进行消毒之前，重新暴露受伤

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医学

万古霉素滴入硫酸钙和自体骨治疗兔骨感染的改进模型

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。...

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

在本视频中，我们描述了一种用于建立兔颅骨模型的外科手术方法，以评估感兴趣骨样本替代材料的骨再生能力。...

建立兔颅骨缺损模型：一种在兔颅骨顶部创建圆形缺损的外科手术方法，用于评估骨替代材料的骨再生能力

本视频介绍了一种通过使用骨蜡防止细菌泄漏，在兔骨髓中手术诱导细菌感染的技术。该兔模型可用于研究骨感染治疗和骨再生。...

建立骨感染的兔模型：通过直接向骨髓内注射细菌诱导慢性感染的技术

关键词：骨感染，兔模型，慢性感染，骨髓，细菌注射

在骨科植入物感染的小鼠模型中，结合光学成像与显微计算机断层扫描（μCT）成像，并利用一种经基因工程改造的发光葡萄球菌（Staphylococcus...

结合 体内 光学成像与 µCT 成像以监测小鼠骨科植入物感染中的感染、炎症及骨解剖结构

目前，所有类型的带血管复合组织异体移植均依赖于长期免疫抑制，而对于非生命攸关的适应证，这种治疗难以持续支持。我们提出一种新的猪胫骨VCA模型，可用于研究骨组织VCA，并展示如何通过手术诱导血管生成来维持骨组织活性，而无需长期免疫调节。...

猪胫骨异体移植中的手术诱导血管生成：一种新的大型动物骨血管化复合组织异体移植模型

本文介绍了一种在兔子中进行的外科手术方案，旨在评估骨替代材料在骨再生能力方面的性能。通过将聚醚醚酮（PEEK）圆柱体固定在兔颅骨上，可在活体或安乐死动物中评估材料所诱导的成骨传导、成骨诱导、成骨生成以及血管生成作用。...

用于评估骨替代材料中骨生长与新生血管形成的兔颅骨骨增量模型

该方案描述了一种新型的体内小鼠脊柱植入物感染模型，其中不锈钢克氏针植入物被生物发光的Staphylococcus aureus...

体内小鼠脊柱植入物感染模型

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一种可重复的兔膝关节软骨撞击模型以诱导创伤后骨关节炎

动物模型常被用于研究癌症向骨骼的转移。在本方案中，我们将介绍两种常用于骨转移研究的肿瘤接种方法，并简要描述一些用于监测和定量分析这些模型的常用方法。...

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学习使用万古霉素载入硫酸钙与自体骨治疗兔骨感染的标准化模型方法。该模型通过骨蜡封堵实现一致菌量，为骨感染发病机制、骨不连治疗及跨物种研究提供可靠实验基础。

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