Name: 原位金纳米粒子合成快速 Nanoprobe 信号增强 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学习原位金纳米粒子合成快速信号增强技术，用于纳米探针生物传感检测。该方法可将金、银、氧化铁纳米粒子信号提升100倍，实现低浓度靶标的高灵敏度可视化检测。

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感谢欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP/2007-2013）/ERC 资助协议编号 615458、瑞典研究理事会以及 Pronova 蛋白质技术卓越中心（VINNOVA——瑞典政府创新系统署）提供的资助。

人血清样本的获取符合采集国的法律和伦理要求， 即经伦理委员会（或类似机构）批准，并获得捐赠者的书面同意。
1. 增强溶液的配制：
<ol>
	<li>通过将MES钠盐溶于去离子水中，配制10 mM、pH 6的MES缓冲液。使用4 M NaOH溶液将pH值调节至6。</li>
	<li>在10 mM、pH 6的MES缓冲液中配制5 mM HAuCl4溶液（溶液1）。</li>
	<li>在10 mM、pH 6的MES缓冲液中配制1.027 M H2O2溶液（溶液2）。 
	注意：溶液1和溶液2的体积取决于需要增强的微阵列的数量和尺寸。例如，一个10 × 10 mm的微阵列需要总共100 μL的体积（溶液1 + 溶液2），以确保微阵列区域与增强溶液充分接触。稀释后的H2O2应在约30至45天内使用完毕。</li>
</ol>
2. 纳米颗粒的制备：
<ol>
	<li>按照 Bastús 的方法制备 40 nm AuNPs 等.16 简言之，注入1 mL水相25 mM HAuCl4 将前体加入149 mL浓度为2.2 mM的柠檬酸钠沸溶液中，待溶液呈现红葡萄酒颜色后停止。将此纳米粒子溶液用作后续种子生长步骤的种子液。</li>
	<li>在 90 °C 下，先注入 1 mL 60 mM 柠檬酸钠，随后注入 1 mL 25 mM HAuCl4 加入含种子的溶液中。反应30分钟后结束。按照Bastús所述方法，重复种子生长步骤五次，直至获得40 nm的纳米颗粒。 等.16</li>
	<li>测量纳米颗粒终溶液的紫外-可见吸收光谱，以确定纳米颗粒的尺寸。17 或者，可采集透射电子显微镜图像（TEM）并用于测定纳米颗粒的尺寸。</li>
	<li>按照Rivero所述方法制备90 nm的AgNPs 等.18 简而言之，将二甲基氨基硼烷（DMAB）加入剧烈搅拌的聚丙烯酸钠（PAA）与AgNO₃溶液中。3最终溶液体积为50 mL，DMAB、PAA和AgNO₃的终浓度分别为3 分别为 1.6 mM、10 mM 和 3.33 mM。 
	注意：购入了经羧基修饰的100 nm IONPs和经羧基修饰的50 nm SiNPs。</li>
	<li>按照Puertas所述方案，用抗体对金纳米颗粒（AuNPs）进行功能化 等.19 简而言之，加入1 mg COOH-PEG-SH（5000 g·mol⁻¹）至1 mL PBS缓冲液中，涡旋振荡使其充分溶解。−1) 加入至 1.2×10-9 10 光密度（OD）的 M AuNPs。用 4 M NaOH 溶液调节 pH 至 12。
	<ol>
		<li>在室温（约 22 °C）下，于温和搅拌条件下将溶液孵育过夜。</li>
		<li>通过在13800 × g下离心15分钟，去除多余的PEG。</li>
		<li>用500 μL去离子水重悬沉淀。</li>
		<li>将PEG修饰的AuNPs与5 μmol盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺（EDC）和7.5 μmol磺基-N-羟基琥珀酰亚胺钠盐（sulfo-NHS）在10 mM MES缓冲液（pH 6）中于37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>通过在13800 × g下离心5分钟，去除溶液中过量的EDC和sulfo-NHS。</li>
		<li>将沉淀重悬于500 µL 10 mM MES pH 6缓冲液中，并加入100 g·mL-1 抗体溶液在37 °C孵育2小时。</li>
		<li>通过在13800 × g下离心10分钟，重复两次，去除抗体过量成分，然后将沉淀重悬于500 μL的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5，含0.3 M NaCl）中。将溶液在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>通过在13800 × g离心10分钟，重复两次，去除非特异性结合的抗体，然后将沉淀重悬于500 μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的10 mM MES缓冲液（pH 6）中。将样品在4 °C孵育过夜。</li>
		<li>通过在13800 × g下离心10分钟，重复两次，以洗去多余的BSA，并将沉淀重悬于500 μL的10 mM MES pH 6缓冲液中。</li>
		<li>按照步骤2.5.1至2.5.9，对5 M AgNPs、0.5 mg IONPs和0.5 mg SiNPs进行抗体修饰，并相应调整EDC和sulfo-NHS的用量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 基于纸张的垂直流动检测方法：
<ol>
	<li>使用机器人点样仪将蛋白G以浓度梯度形式沉积在硝酸纤维素膜上，制备微阵列。点样完成后，将微阵列在室温（约22 °C）下干燥过夜。</li>
	<li>将膜置于滤器夹具中进行垂直流动检测。使用超高压注射泵以1 mL·min−1的流速流过8 M的IgG修饰金纳米颗粒（AuNPs）溶液。随后依次用17 M的IgG修饰银纳米颗粒（AgNPs）溶液、0.1 mg·mL−1的IgG修饰硅纳米颗粒（SiNPs）溶液和0.1 mg·mL−1的IgG修饰铁氧纳米颗粒（IONPs）溶液重复此步骤。</li>
	<li>将微阵列在室温（约22 °C）下干燥30分钟，然后以4800 dpi分辨率在平板扫描仪中扫描。将图像保存为24位彩色TIFF文件。</li>
</ol>
4. 参考商品化玻璃基检测方法：
<ol>
	<li>在室温下将两张玻片分别孵育120分钟，以利用4种不同的人类血清样本检测过敏原组分。</li>
	<li>用去离子水冲洗微阵列。</li>
	<li>将其中一张玻片在室温（约22°C）下与荧光标记的抗人IgE抗体孵育30分钟；另一张玻片在室温下与抗人IgE抗体修饰的金纳米颗粒（AuNPs）孵育30分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗微阵列。</li>
	<li>使用激光扫描仪测量与荧光标记抗人IgE抗体孵育后的微阵列的荧光强度；使用台式扫描仪对与抗人IgE抗体修饰的AuNPs孵育后的微阵列进行数字化，以获取比色信号。</li>
	<li>数字化后，将微阵列在室温（约22°C）下与增强液孵育5分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗传感器，并在室温（约22°C）下静置干燥10分钟。</li>
	<li>使用台式扫描仪以4800 dpi分辨率对微阵列进行数字化，以获取比色信号。将图像保存为16位灰度TIFF文件。</li>
</ol>
5. 用增强溶液孵育芯片：
<ol>
	<li>将等量的溶液1和溶液2预先混合，或直接将两者混合于传感器表面，并确保微阵列上目标区域被混合溶液覆盖。</li>
	<li>让传感器在室温下用增强溶液孵育最多5分钟。更长的孵育时间可提高灵敏度，但也可能导致信噪比升高，尤其是对于纸质微阵列。</li>
	<li>将微阵列浸入去离子水中清洗一次，持续5秒。随后在室温下自然干燥。 
	注意：干燥步骤的时间取决于微阵列的材料。对于纸质微阵列，干燥约需30分钟；对于玻璃基微阵列，干燥约需5–10分钟。</li>
</ol>
6. 成像分析：
<ol>
	<li>使用软件工具分析荧光强度。根据传感器制造商的使用说明（DfU），将所有等于或大于 0.3 ISU（ISAC 标准化单位）的结果视为有效。</li>
	<li>使用软件工具分析比色强度。将图像文件反转，测量每个点的强度，并计算平均像素强度。利用三个重复点的数值，以三个平均点像素强度的均值计算最终信号值。</li>
</ol>

<ol><li>Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+biosensing+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for biosensing applications: a review.</a> Front. Chem. 2, 1(2014).</li>
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<li>Shen, G., Zhang, S., Hu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+in+a+lateral+flow+immunoassay+based+on+dual+gold+nanoparticle+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates.</a> Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).</li>
<li>Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+optimization+of+gold+nanoparticle-based+silver-enhanced+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前，基于纳米探针检测的分析方法的信号增强技术，要么依赖酶促反应12，要么需要使用第二组纳米颗粒来靶向结合检测用纳米探针21，或者在染色技术中，仅限于使用金纳米颗粒（AuNPs）或银纳米颗粒（AgNPs）作为检测探针22。本文介绍了一种简单、快速且无需酶参与的信号增强方法，可用于基于纳米探针检测的分析技术。利用该方法，成功增强了四种类型纳米探针产生的比色信号：AuNPs、AgNPs、IONPs 和 SiNPs。
每组纳米探针观察到的放大倍数均为100倍，但SiNPs除外，由于缺乏增强前信号，无法对其增强倍数进行定量。该增强倍数表明，该方案在所有类型的纳米探针中均具有相似的效率。此外，当在印有金纳米颗粒（AuNPs）储备液系列稀释液的纸基载体上实施增强步骤时，观察到放大倍数达10000倍。增强前，可见斑点中AuNPs数量最少的区域约含有10000个纳米颗粒；增强后，含有少于10个纳米颗粒的斑点也变得可见。20
本文所建立的增强方案条件，能够利用 Au3+ 还原为 Au0 的过程来提升信号强度，同时将背景噪声降至最低。该增强步骤可在检测完成后立即进行，也可用于检测后已保存数月的微阵列。增强溶液由溶液1和溶液2按1:1比例混合而成。两种溶液可预先混合，也可在加样至微阵列时直接混合。预先混合与直接混合的区别仅在于增强溶液的保存期限：若预先混合，保存期限为5–7天；若不预先混合，则可延长至30–45天。
对结果的进一步分析表明，该增强方法不会干扰生物传感器的定量分析。观察到的信号强度与分析物浓度之间保持了良好的线性相关性（表1）。使用基于玻璃的过敏原组分微阵列免疫分析法对4份预先表征的临床样本进行检测，分别采用标准荧光检测和比色检测，两种检测方法之间的结果具有良好的一致性。在对双轴数据进行以10为底的对数转换后，比较平均荧光强度（MFI）与平均比色强度（MCI），得到的平均R2值为0.79 ± 0.08。本实验表明，若商用试剂盒采用纳米探针进行检测，或可改造为基于纳米探针的检测方法，则该增强方法可适用于此类试剂盒。
增强方法的效果依赖于两个关键因素。首先，必须确保溶液1和溶液2的混合均匀。若混合不均，传感器将接触到溶液1或溶液2相对占优的增强液局部区域，这会降低Au3+还原为Au0的效率，从而损害增强效果。其次，在孵育期间，必须使微阵列的整个目标区域均与增强溶液充分接触。
为了实现信号的超灵敏增强，需要使用增强液孵育较长时间（约5分钟）。为避免产生可能干扰信号采集的背景噪声，应预先对微阵列表面进行封闭处理（例如 BSA、PEG）以防止金的快速非特异性沉积0 以及随之形成的金层。
该增强方法的一个局限性在于检测方法本身的内在效能。该检测需要设置阴性对照和阳性对照，以确保所观察到的信号增强可归因于真正的阳性结果。如果纳米探针与靶标发生非特异性相互作用，则增强后获得的信号将无效。
其他信号增强技术基于纳米颗粒的聚集，或使用能够改善信号检测的材料对纳米颗粒进行染色。通过促进检测位点处纳米颗粒数量的聚集，可实现肉眼或紫外-可见光谱（UV-Vis）检测信号。5 这些信号增强技术依赖于两步检测系统：第一步是目标分析物的初始检测，第二步需要报告分子结合到初始检测复合物上。由于每种检测类型都需要特定的增强方案优化，此类策略缺乏通用性。
染色增强技术（如银染法）与本文所介绍的方案类似，均可直接增强信号检测结构。然而，与本文所示方案不同的是，银染法迄今仅被证明适用于金纳米颗粒（AuNPs）或银纳米颗粒（AgNPs）。6,7,8,9
该方法的适用性可能涵盖任何使用金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、铁氧化物纳米颗粒（IONPs）或硅纳米颗粒（SiNPs）作为检测试剂的分析方法。目前正在进行进一步研究，以探索该方法在由其他材料构成的传感器中的应用。

使用金纳米颗粒（AuNPs）或氧化铁纳米颗粒（IONPs）等纳米材料，已使生物传感应用的灵敏度和通用性得到显著提升。1 为利用纳米颗粒高比表面积的特性，研究人员已开发出多种在纳米颗粒表面修饰不同配体的方法，从而设计出灵敏度更高的传感器。2 然而，生物传感工具的检测能力依赖于产生可检测信号所需的纳米探针数量。例如，对于直径为40 nm的AuNPs，要通过紫外-可见光谱法获得可检测信号，大约需要90 × 106个纳米探针才能有效检测目标物。3 该纳米探针密度限制可通过信号放大策略加以克服。此类策略4可基于纳米颗粒间的聚集或团聚，即通过在初始纳米探针上富集第二组纳米探针，从而提高局部探针密度。5 在传感器表面特定位置增加纳米颗粒数量，可实现肉眼或紫外-可见光信号的检测。然而，该检测方法的灵敏度本质上取决于第二组纳米颗粒对初始纳米探针的靶向能力。其他策略则依赖于对金或银纳米探针进行染色。6,7 染色过程通过将银离子还原并沉积在纳米颗粒表面实现，从而支持肉眼或紫外-可见光检测。8 这些方法通过增强表面等离子体共振信号来放大已有金或银纳米探针的信号，无需像颗粒间团聚法那样依赖二次靶向事件。然而，银染色方法迄今仅见于金或银纳米探针的应用报道。8,9
2005年，Zayats 等10 报道了将金离子还原沉积到金纳米探针表面，以增强表面等离子体共振信号。在该依赖酶的实验中，葡萄糖氧化酶催化产生过氧化氢，后者与氯化十六烷基三甲基铵共同作用，实现了氯金酸的还原。
最近，Wang 等报道了一种增强方法，该方法在现有纳米探针表面生成一层金。11 这些增大的纳米探针对底物3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）表现出类似过氧化物酶的催化活性，可通过肉眼观察到明显的蓝色显色反应。
Stevens et al. 报道了一种基于等离子体共振的 ELISA 检测方法的开发。12 在通过传统的 ELISA 策略检测前列腺特异性抗原（PSA）后，将连接有过氧化氢酶的二抗与传感器孵育，随后将传感器浸入含有过氧化氢和氯金酸的溶液中。若存在标记过氧化氢酶的二抗（阳性结果），会促进过氧化氢的消耗，减缓氯金酸的还原反应，从而生成呈红色的准球形、单分散的金纳米颗粒（AuNPs）。若不存在过氧化氢酶标记的二抗（阴性结果），过氧化氢浓度得以保持，从而促进氯金酸快速还原，生成形态不规则的 AuNPs，呈现蓝色或紫色。过氧化氢的浓度由过氧化氢酶的活性决定，已被证明与待测物的浓度相关。然而，该方法的普适性受到两个因素的限制：一是需要使用过氧化氢酶标记的二抗，二是必须严格控制催化反应的条件。此外，与已有 AuNPs 无关的金簇形成可能会为信号放大策略引入背景噪声问题。
上述技术以及其他多种技术13,14,15，已使得基于纳米探针的生物传感器达到与传统技术相当的检测限。
在此展示一种新型的金增强方法，该方法通过增强或引入表面等离子体共振信号来放大现有纳米探针的信号。在使用金、银、二氧化硅或氧化铁纳米颗粒进行检测后，将传感器置于含有过氧化氢和氯金酸的混合溶液中孵育，该溶液溶于pH 6的2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液。增强液中各组分的浓度经过优化，以促进金的沉积0 在现有纳米探针表面。对于所有研究的纳米探针类型， 即金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）和铁氧体纳米颗粒（IONPs）的使用导致形成一层不明确的界面层，从而引起或增强光散射，产生可检测或增强的可见信号。在纸质和玻璃基质的微阵列中，纳米探针的信号增幅可达100倍，且信号获取过程耗时少于5分钟。信号检测可通过肉眼、紫外-可见光谱法，或使用低成本成像工具（如数码相机或台式扫描仪）完成。此外，已证明该信号增强方案可直接应用于市售的过敏诊断检测试剂盒，无需进行特定优化。

<table><tbody><tr><td>氯金酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>二甲基氨基硼烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酸钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 磁性纳米颗粒</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm 二氧化硅纳米颗粒</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&amp;nbsp;</td><td>RAPP Polymere</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-二甲基氨基丙基)-N&amp;rsquo;-乙基碳二亚胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG 抗体</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 机器人点样仪</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜夹具</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 超精度注射泵</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平板扫描仪 CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人 IgE 抗体修饰的金纳米颗粒&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光扫描仪 LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式扫描仪 Image Scanner Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片 ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记抗人 IgE 抗体&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia 微阵列图像分析仪 MIA 1.2.4&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

快速纳米探针信号增强 原位 金纳米颗粒的合成

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

在生物分析检测中，使用金、银、二氧化硅或氧化铁等纳米探针作为检测试剂，可实现高灵敏度和便捷的比色信号读取。然而，通常需要高密度的纳米颗粒才能实现有效检测。目前可用的基于合成的信号增强方法，要么仅限于金和银纳米颗粒，要么依赖于精确的酶控条件和优化过程。本文介绍一种可增强金、银、二氧化硅和氧化铁纳米探针比色信号的实验方案，其比色信号可提升高达10000倍。该信号增强策略的基础是将Au3+化学还原为Au0。存在多种化学反应可实现Au3+向Au0的还原。本方案中采用Good's缓冲液和H2O2，可促进Au0沉积在已有纳米探针表面，从而抑制新金纳米颗粒的生成。该方案包括：在基于纳米探针的检测完成后，将微阵列与含有氯金酸和H2O2的2-(N-吗啉代)乙磺酸（pH 6）缓冲液共同孵育。该增强溶液适用于纸质和玻璃基传感器，并可应用于市售免疫检测产品，例如本方法在一种商用过敏原微阵列上的成功应用即证明了其通用性。信号显色过程在增强溶液中孵育时间少于5分钟，读取可通过肉眼或低端成像设备（如台式扫描仪或数码相机）完成。

使用纳米探针作为检测剂完成检测后，传感器的检测区域可能已结合有纳米探针（图1a）。若纳米探针的数量低于目视检测的阈值，则最初将判定为待测物检测阴性。通过采用本文所述的方案（图1b），可在纳米探针表面沉积一层结构不明确的金（Au），从而增强其检测信号（图1c）。
为展示增强方案的有效性，进行了用于检测Protein G的纸质免疫测定实验（图2）。将AuNPs、AgNPs、SiNPs和IONPs修饰上IgG抗体，并用作检测试剂。纸质微阵列制备成每点含有不同数量Protein G分子的梯度。
实验完成后观察发现，经IgG修饰的AuNPs（IgG-AuNPs）每点可检测低至2 × 105个分子（图2a），经IgG修饰的AgNPs（IgG-AgNPs）每点可检测低至2 × 104个分子（图2c），经IgG修饰的IONPs（IgG-IONPs）每点可检测低至2 × 107个分子（图2e），而经IgG修饰的SiNPs（IgG-SiNPs）则无法提供可见信号（图2g）。
通过将微阵列与增强溶液共同孵育，可使所用各类纳米颗粒的信号强度提高100倍。对于SiNPs而言，使用增强溶液后能够观察到明显的信号，而在未使用增强溶液的情况下则无法观察到可视信号。图2b、2d、2f 和 2h).
评估了该方法在现有商用免疫测定中的应用可能性。增强实验在基于玻璃的过敏原组分微阵列免疫测定上进行。采用一组来自过敏患者的4份经过验证和表征的血清样本进行微阵列检测（样本标记为a、b、c和d）。将该检测的标准荧光检测结果与使用抗IgE标记的金纳米颗粒（AuNPs）染色后进行信号增强的结果进行了比较（图3）。在信号增强之前，使用抗IgE标记的AuNPs进行检测时，微阵列上未检测到任何斑点。增强后，多个斑点可肉眼可见，并通过图像数字化记录其强度（图3）。采用荧光检测时，检测到多种斑点（图3）。
<img alt="带有IgG抗体、金涂层、蛋白G的纳米颗粒偶联示意图；蛋白质结合过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1。微点从分析物检测到信号增强所经历步骤的示意图。（a）固定在微点上的分析物被两个抗体修饰的纳米探针检测后的情况，（b）微阵列与增强方案孵育，随后抗体修饰的纳米探针发生种子生长，（c）微点在与增强溶液孵育5分钟后，纳米探针尺寸增大。该图改编自Dias et al.20 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="点印迹分析；稀释系列，蛋白质检测，抗体结合，实验结果比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2。用于检测蛋白G的微阵列数字化图像。 在每个微阵列的左侧为使用（a）IgG-AuNPs、（c）IgG-AgNPs、（e）IgG-IONPs 和（g）IgG-SiNPs 进行检测前观察到的微点信号；在每个微阵列的右侧为增强后的微点信号，分别对应（b）IgG-AuNPs、（d）IgG-AgNPs、（f）IgG-IONPs 和（h）IgG-SiNPs。每种浓度的蛋白G均以三复孔形式点样于微阵列上。根据每个微点中打印的蛋白浓度，计算了蛋白G的分子数量。该图改编自 Dias et al.20 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光与比色增强的图表及显微镜结果；荧光检测，数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3。使用商业过敏诊断试剂盒进行检测时，荧光强度与比色强度之间的相关性。 对样本a、b、c和d中过敏原的检测所测得的平均荧光强度（MFI）和平均比色强度（MCI）。插图为在两种方法之间观察到线性相关性的区间内，经以10为底对数转换后的数据。基于荧光标记抗体（Fluorophore-Ab）检测所观察到的微点信号强度为荧光发射强度；基于Ab-AuNPs检测所观察到的微点亮度，则是通过数字化微阵列并使用成像软件对图像进行反相处理后获得。微阵列设计为在最右下角设有用于荧光检测的垂直三复孔阳性对照，其余三个角用于软件分析。图像以16位灰度模式进行分析。本图改编自Dias et al.20 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>R2 增强前</td>
			<td>R2 增强后</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 使用不同纳米颗粒组检测蛋白G在增强前后检测的R2值。 R2 值是通过将斑点强度与测定的分析物浓度进行相关性分析后获得的。

本研究介绍了一种用于增强基于纳米探针生物传感信号的实验方案。该方案基于将氯金酸还原至现有纳米探针表面，这些纳米探针由金、银、二氧化硅或氧化铁纳米颗粒组成。

使用金、银、二氧化硅或氧化铁等纳米探针作为生物分析检测中的检测试剂，可实现高灵敏度……

本实验的总体目标是在纸质或玻璃载体上进行基于纳米颗粒探针的检测时，放大其信号。采用该方法，即使每个位点仅含有10个纳米颗粒，也能获得可见的比色信号。该技术的主要优势在于其广泛的适用性。该方法无需重大修改即可应用于纸张、玻璃及其他潜在载体上的不同纳米颗粒。开始实验前，需在去离子水中配制至少10毫升的10毫摩尔MES溶液，并用4摩尔的氢氧化钠溶液将溶液pH值调节至6。接下来，将1毫升浓度为1.2 × 10⁻⁹ M的40纳米金纳米颗粒悬浮液与1毫克α-巯基-ω-羧基聚乙二醇（PEG）混合，并涡旋混匀。用4 M的氢氧化钠溶液将混合物的pH值调节至12。在室温下轻轻搅拌过夜。然后，将混合物在3,800 × g条件下离心15分钟，并弃去上清液。用移液枪轻轻吹打，将聚乙二醇修饰的金纳米颗粒沉淀重悬于500 µL去离子水中。接着，将5 µmol的EDC溶解于250 µL pH为6的10 mmol/L MES缓冲液中。将7.5微摩尔的磺基-NHS溶解于另取的250微升MES缓冲液中。将该溶液与PEG修饰的金纳米颗粒混合，于37摄氏度孵育30分钟。离心混合物5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500微升MES缓冲液中。向该悬液中加入足量IgG抗体，使抗体浓度达到每毫升100皮克。将混合物在37摄氏度下孵育2小时。将混合物离心10分钟，弃去上清液。用500 µL MES缓冲液重悬沉淀，再次进行离心。然后，将沉淀重悬于500 µL pH 7.5的缓冲液中，该缓冲液含有10 mmol/L磷酸钠和0.3 mol/L氯化钠，溶剂为去离子水。将混合物在37摄氏度孵育30分钟。按照先前所述方法，将混合物离心10分钟，重复两次。将沉淀重悬于500 µL含1% BSA的10 mM pH 6的MES缓冲液中，并在4摄氏度孵育过夜。将混合物离心两次，每次10分钟。最后，将沉淀重悬于500 µL MES缓冲液中，得到IgG修饰的金纳米颗粒。使用机器人点样仪在硝酸纤维素膜上沉积蛋白G浓度梯度的微阵列。接下来，将一张微阵列装入适当尺寸的不锈钢滤器支架中。将装有8皮摩尔浓度IgG修饰金纳米颗粒悬浮液的注射器连接至滤器支架的入口。将注射器安装到注射泵上。准备一个50毫升的离心管，用于收集滤器装置的流出液。然后以每分钟1毫升的流速将悬液通过滤器装置。之后，让微阵列在室温下干燥30分钟。用水和滤纸清洗并干燥滤器支架。将干燥的微阵列在平板扫描仪中以 4,800 DPI 扫描，并将图像保存为 24 位彩色 TIFF 文件。接着，在 10 毫摩尔、pH 6 的 MES 缓冲液中配制 5 毫摩尔的氯金酸溶液和 1.027 摩尔的过氧化氢溶液。为预先混合增强液，将等体积的氯金酸溶液和过氧化氢溶液加入微量离心管中，并充分混合。将预混的增强液加至微阵列传感器表面。或者，将等体积的氯金酸溶液和过氧化氢溶液分别加至传感器表面，然后在传感器上直接充分混合。将传感器与增强溶液孵育最多五分钟，然后将微阵列浸入去离子水中五秒钟，以洗去增强溶液。让微阵列在室温下自然晾干。对每个需要增强的微阵列重复此过程。扫描增强型微阵列并保存图像。在标准的基于纸张的免疫测定中，经IgG修饰的金、银和氧化铁纳米颗粒每点分别检测到2×10⁵、2×10⁴和2×10⁷个蛋白G分子。经IgG修饰的硅纳米颗粒未观察到可见信号。将微阵列在增强溶液中孵育后，金、银和氧化铁纳米颗粒的信号强度提高了100倍。对于硅纳米颗粒，该增强处理使得信号可通过肉眼观察到。该增强方法已应用于一种基于商用玻璃的过敏原组分微阵列免疫测定法，检测了四份人血清样本。使用标记金纳米颗粒的抗IgE进行染色并增强信号，其结果与标准荧光测定法相当。平均荧光强度与平均比色强度之间的平均线性相关性为0.79。一旦掌握，若操作正确，该技术可在10分钟内完成。

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科研

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