铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

本实验方案的总体目标是生成铜绿假单胞菌PA14菌株的有序非冗余转座子突变体文库（称为PA14NR文库）的高质量拷贝。该方案在文库扩增过程中保持PA14NR文库的完整性，从而获得高质量的文库拷贝。本方案的主要优势在于，它详细描述了文库扩增、质量控制以及单个突变体正确保存所涉及的全部步骤。

尽管本实验方案旨在复制P14NR文库，但也可进行调整以复制其他细菌文库。通常，初次使用该方法的研究人员会因复制过程中存在污染风险而遇到困难。因此，本方案提供了详细的分步操作说明，以降低此类风险。

我们的实验室向全球科学界分发PA14NR文库，并建议由最终用户自行扩增该文库。为提供操作指导，我们提供了一套详细方案，用于制备高质量的文库拷贝。

本方案的可视化演示至关重要，特别是为防止交叉污染而设计的步骤。为保护自身安全以及细菌培养物，在处理指定为PA14NR集合的铜绿假单胞菌PA14菌株非冗余转座子插入突变体文库时，应始终穿戴实验服、手套和口罩。通过将约60毫升熔化的LB琼脂倒入矩形培养皿中，制备LB琼脂平板。

使用前，在无菌操作台中将平板干燥约一小时。在经乙醇擦拭的实验台面上，用本生灯创建无菌区域，并准备好装有适当溶液的容器，用于复制器针的灭菌。

从-80摄氏度冰箱中取出一块PA14NR系列主培养板，置于盛有干冰的4升冰盘中。将待复制的96孔主培养板从干冰上取下，放置在实验台上短暂解冻。将主培养板与琼脂平板对齐，使两块板的A1坐标均位于左上角。

在矩形琼脂平板上标记 A1 坐标的位置。为对复制器针进行灭菌，将针浸入 250 毫升 0.3% 至 0.5% 次氯酸钠溶液中 30 秒。轻轻敲击复制器以去除多余液体，随后将针浸入 250 毫升无菌超纯水中 10 秒，接着浸入 250 毫升 70% 乙醇中 30 秒，最后浸入 250 毫升 95% 乙醇中两分钟。

将接种针垂直置于本生灯火焰中，通过火焰灭菌。缓慢接近火焰，直至乙醇点燃，然后立即移出火焰。待乙醇完全燃尽后，火焰会自行熄灭。将接种针在未使用的含无菌LB琼脂的矩形平板上轻轻触碰30秒，以冷却接种针。

在复制针冷却的同时，用手短暂温热PA14NR集组主板上的铝封膜，然后小心地将其剥离，确保封膜不再接触板面。使用镊子将铝封膜的残留物彻底清除。将复制针插入主板，轻轻推压并沿四个方向摆动复制器，确保针尖与96个孔中每个孔内的冷冻细菌培养物充分接触。

通过将复制器针头压向位于平板边缘孔中的冻存菌，特别注意平板外缘的孔。将复制器针头轻轻放置在琼脂平板表面，以轻微的环形动作移动复制器，使每种突变菌株形成约四到五毫米大小的多个菌苔。

用新的无菌铝封膜密封 PA14NR 集合主平板。使用平板滚压机确保每个孔以及平板边缘完全密封。将 96 孔主平板放回干冰中。

处理完PA14NR菌株后，使用70%乙醇擦拭所有工作台面。将复制的琼脂平板转移至37摄氏度培养箱中，过夜培养。在开始此操作前，请确保超净工作台内无不必要的设备，并开启风机至少10分钟。

使用70%乙醇擦拭超净台表面及放置在超净台内的所有物品。使用50至1200微升的12通道电子移液器，向12毫升深孔板的每个孔中加入525微升含有适当抗生素的LB液体培养基。然后在将深孔板从超净台中取出前将其密封。

接下来，将装有培养基的深孔板转移至经乙醇擦拭过的实验台面。在台面上使用本生灯创建无菌区域，并准备好盛有适当溶液的容器用于复制器针头的灭菌。按照之前演示的方法，将复制器针头浸入各溶液中。

将接种针进行火焰灭菌。然后将接种针插入含有LB琼脂的未使用矩形平板中，冷却30秒。轻轻将接种针放置在含有已培养突变菌株的琼脂平板上，并检查确保每根针均与琼脂平板上的全部96个突变菌株接触。

然后将针头浸入含有LB液体培养基的深孔中，持续5到10秒。避免针头触碰孔壁。用无菌透气封膜密封深孔板。

使用平板滚压仪确保每个单独的孔都密封良好。处理 PA14NR 套件后，用 70% 乙醇擦拭所有工作台面。将接种后的液体培养物置于37°C、950 rpm条件下，在高速摇床中培养15至16小时。

首先清理超净工作台，并开启风机至少10分钟。使用70%乙醇擦拭工作台内所有表面及放入其中的物品。从塑料包装中取出96孔板。

将每块板的板标签撕下，并将其贴在目标板靠近A1至H1孔的一侧边缘。轻轻抬起目标板的盖子，将标签贴在下边缘，以便在板盖上盖子时仍能显示标签。从高速振荡器中取出深孔块，并将其转移至无菌超净工作台。

小心移除透气密封膜，并更换为铝密封垫。以极低转速离心深孔板，以收集冷凝液。由于将菌液转移至目标培养板的过程存在较高的孔间污染风险，因此必须严格遵循所有无菌操作步骤。

将深孔板放回无菌操作台。使用50至1200微升的12通道电子移液器和无菌滤芯吸头，向每个孔中加入525微升甘油LB液体培养基混合液。用电子移液器轻轻上下吹打300微升液体三次，以混匀样品。

在注入前，先将枪头接触孔壁，以防止滴液。重新加载带有新的无菌滤芯枪头的移液器，并用甘油LB液体培养基混合液填充下一排孔。当所有孔均加入甘油LB液体培养基混合液后，使用12通道电子移液器和滤芯枪头，从深孔块的每一排中吸取900微升甘油突变株培养混合液，然后向目标板中对应排的各孔中分别分配150微升，以生成六份文库板的副本。

使用无菌铝箔封膜覆盖每个96孔目标板，并使用封板机彻底密封板的边缘和所有孔。确保铝箔封膜不覆盖标签标识。将密封好的板从生物安全柜中取出，放置于-80摄氏度冰箱内的平坦且水平的表面上。

处理文库后，使用70%乙醇擦拭所有工作台面。按照本视频中演示的方案，共制备了12份PA14NR文库副本，其中包括对照平板，对照平板由按预设模式交替排列的接种PA14菌株和未接种菌株的孔组成。在LB琼脂平板上完成复制后，对对照平板进行肉眼观察，以确认出现预期的生长模式。

从新构建的PA14NR文库的拷贝中随机选取了38个突变菌株，使用随机引物进行PCR扩增，以确认转座子突变株的身份。随后对DNA片段进行测序，验证了所检测的38个突变株中35个的身份。一旦掌握相关技术，整个文库的复制大约需要80小时。

在使用本方案时，务必始终注意工作区域的无菌条件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备高质量的P14NR文库或其他细菌文库。请勿忘记，操作假单胞菌属（Pseudomonas）可能具有危险性，执行本方案时应始终穿戴个人防护装备。

该方案用于保存铜绿假单胞菌PA14非冗余突变体文库，该文库仍是一项重要资源，不仅可用于高通量筛选，还可作为大多数铜绿假单胞菌基因单个突变的来源。