Name: 复制的有序, 非冗余图书馆的铜绿假单胞菌应变 PA14 座子插入突变体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学习复制铜绿假单胞菌PA14NR转座子突变体文库的标准化操作流程。本方案详细展示如何通过严格的无菌操作和质量控制措施，确保文库完整性并降低污染风险，为微生物学和病原体研究提供可靠的技术支持。

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我们感谢麻省总医院特雷德韦尔虚拟图书馆的 Lisa Philpotts 在数据库检索方面的指导。本研究由囊性纤维化基金会（YONKER16G0 和 HURLEY16G0）以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所（BPH 和 ADE：R01 A1095338）提供资助。

作者声明无经济利益冲突。Eliana Drenkard 和 Frederick Ausubel 参与了 PA14 非冗余转座子突变体文库的构建。Bryan Hurley 和 Lael Yonker 目前作为麻省总医院儿科系的一部分，负责该突变体文库的保藏与分发。

P. aeruginosa PA14NR 文库是科学界一项宝贵的资源。根据科睿唯安（Clarivate Analytics）基本科学指标数据库2017年3月的数据，Liberati et al.（2006）37（描述了PA14NR文库的构建）位列微生物学领域发表论文中被引频次最高的前1%。截至2017年8月，Google Scholar 显示Liberati et al.（2006）的原始论文已被引用超过600次。该文库在阐明P. aeruginosa致病机制方面发挥了重要作用。尤为重要的是，PA14NR文库采用96孔板格式，便于开展高通量遗传筛选，以研究多种P. aeruginosa突变体表型44,45,46。由于PA14NR文库可供分发使用，必须采取特殊预防措施以确保该资源的完...

Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、大多数人类生活环境以及皮肤微生物群中。与其他许多细菌物种相比，P. aeruginosa 拥有相对较大的基因组，大小为 5.5–7 Mbp，其鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量较高（65–67%）。此外，其大量基因参与代谢适应性，并属于调控网络的一部分，使其在应对环境胁迫时具有极强的灵活性1。P. aeruginosa 表达多种毒力因子，易于形成生物膜，能够通过多条群体感应通路协调反应，并表现出显著的抗生素耐药性和耐受性发展能力2,3,4,5,6,7,8。这些特性为治疗由 P. aeruginosa 引起的感染带来了重大挑战。
慢性P. aeruginosa感染可发生于多种疾病状态中。囊性纤维化（CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病，其特征是气道内形成黏稠的感染性分泌物，导致进行性支气管扩张，最终因呼吸衰竭而死亡9。至成年期，大多数CF患者已长期感染P. aeruginosa，该菌在该疾病的发病与死亡过程中起关键作用10。此外，严重烧伤患者11、气管切开术患者12、接受关节置换术者13或留置导管患者14也存在P. aeruginosa感染风险，这与该细菌形成生物膜并逃避免疫炎症反应的能力有关15。此外，在广谱、序贯性抗菌治疗后，耐药或耐受多种抗生素的菌群被筛选出来，可在无竞争条件下实现定植12,16,17,18。深入理解P. aeruginosa的致病机制，将对多种疾病状态具有重要意义。
已对多种P. aeruginosa临床分离株（包括PAO1、PA103、PA14和PAK菌株）进行了广泛研究，以探讨P. aeruginosa致病性的不同特征。PA14菌株是一种临床分离株，属于全球最常见的克隆群之一19,20，且在实验室中未经过多次传代。PA14在脊椎动物感染模型中具有高度毒力，表现出显著的内毒素特征21、菌毛结构22、致病岛23、III型分泌系统（TTSS）、对哺乳动物细胞的细胞毒性24，以及抗生素耐药性和持留性特征25。此外，PA14在多种宿主-病原体模型系统中也表现出高度毒力，包括植物叶片浸润模型26,27、Caenorhabditis elegans感染模型28,29、昆虫模型30,31，以及小鼠肺炎模型32,33和皮肤烧伤模型34。
全基因组突变体文库是一类非必需基因的同源突变体集合，可通过基因组规模的基因功能分析，成为研究生物体生物学特性的重要工具。目前已有两种在P. aeruginosa中构建的接近饱和的转座子插入突变体文库可供分发使用。这两个文库的转座子插入位点均已确定。这些所谓的非冗余文库显著减少了筛选未表征的随机转座子突变体所需的时间和成本，从而促进了细菌菌株的全基因组研究。P. aeruginosa PAO1转座子突变体文库是在PAO1菌株的MPAO1分离株中利用转座子ISphoA/hah和ISlacZ/hah35构建而成，由华盛顿大学Manoil实验室负责维护。该文库包含9,437个经序列验证的转座子突变体，具有广泛的基因组覆盖度，大多数基因均包含两个突变体36。有关P. aeruginosa PAO1转座子突变体文库的详细信息可通过华盛顿大学Manoil实验室的公共互联网网站获取，网址为http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm。另一种P. aeruginosa PA14非冗余转座子插入突变体文库（PA14NR Set）是在PA14菌株中利用转座子MAR2xT7和TnphoA37构建而成，目前由麻省总医院儿科系负责分发。PA14NR Set包含5,800多个在非必需基因中具有单个转座子插入的突变体37。PA14NR Set文库的构建细节可在公共互联网网站http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB中查阅，该网站还提供多种在线搜索工具，以方便PA14NR Set的使用。
最初的PA14NR菌株集包含5,459个突变株，这些突变株选自一个约含34,000个随机转座子插入突变株的综合文库，对应于4,596个预测的PA14基因，占所有预测PA14基因的77%37。自2006年该文库构建以来，已陆续新增突变株，目前PA14NR菌株集包含超过5,800个突变株38，代表约4,600个PA14基因。大多数PA14转座子突变株是在野生型背景中构建的37。有关该突变文库中每个成员的详细信息（包括遗传背景），可通过在线数据库查询，或下载非冗余文库电子表格获得，上述功能均可在PA14网站（http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi）上获取。大多数突变株使用MAR2xT7（MrT7）转座子构建，少数使用TnPhoA（phoA）转座子构建37。每种转座子均携带抗生素抗性盒，可用于筛选突变株：gentamicin（MrT7）或kanamycin（phoA）。PA14NR突变株集保存在六十三个96孔板中，并包含两个额外的96孔对照板，其中按预设模式交替排列了接种和未接种的野生型PA14孔。96孔板格式结合在线搜索工具，极大地方便了定制化筛选实验的开发，使用户能够轻松识别与突变表型相关的基因。在线搜索工具还可辅助查找和选择进一步研究所需的其他相关突变株。
PA14 和 PAO1 转座子突变文库是科学界极为重要的全球性资源，二者相互补充，可用于验证这种细菌病原体中未知基因和通路的功能。巧合的是，自 PAO1 和 PA14 转座子突变文库构建以来，对大量 P. aeruginosa 分离株进行的全基因组 DNA 测序分析表明，PAO1 和 PA14 分别属于 P. aeruginosa 系统发育树中的不同主要亚克隆群7,39,40,41。由于临床来源的 P. aeruginosa 分离株在系统发育树中分布广泛，PAO1 和 PA14 分属不同的 P. aeruginosa 亚群这一事实，进一步提升了这两个转座子突变文库在比较研究中的价值。
文献中已有大量关于构建和筛选细菌突变体文库的出版物，包括P. aeruginosa文库35,37,42。然而，据我们所知，目前尚无已发表的实验方案详细描述用于细菌突变体文库的复制、保藏和验证的具体步骤与技术。
本文所述的方法包含三个实验方案，用于促进PA14NR文库的使用与维护。第一个方案描述了针对PA14NR文库接收者推荐的文库复制方法。第二个方案提供了利用PA14NR文库鉴定出的单个突变株的划线、培养和保存指南。第三个方案介绍了质量控制技术，包括对转座子突变株进行PCR扩增并随后测序，以确认突变株的身份。这一系列方案也可适用于其他细菌突变文库或菌种集合的复制与维护。强烈建议复制细菌突变文库或菌种集合，以保持&#34;主库&#34;（即最初收到的原始文库）的完整性。为常规实验室使用而复制多份PA14NR文库，可最大限度地降低主库中孔间污染的可能性。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;文库扩增所需材料&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌96孔组织培养板，每箱50块</td><td>康宁生命科学</td><td>353072</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>无菌 96 孔平底透明板 2000&amp;mu;L型深孔板，每箱25个</td><td>康宁生命科学</td><td>3960</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray（矩形板），每箱60块</td><td>赛默飞世尔科技 罗切斯特</td><td>242811</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>矩形冰盒，中号（4L）</td><td>康宁生命科学</td><td>432104</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard 锥形面罩，每箱 300 个</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal，100个装</td><td>Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Breathe-Easy 膜，每包100片</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>无菌、独立包装、50 mL 溶液槽/试剂储液槽，每箱100个</td><td>Sorenson</td><td>S50100</td><td>通过 Westnet Incorporated</td></tr><tr><td>平板滚轴器</td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>通过 VWR</td></tr><tr><td>Cryo 激光标签 - CRYOLAZRTAG 2.64&quot; x 0.277&quot;，16 张装</td><td>GA国际</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>通过 Labtag.com（打印模板也可从 Labtag.com 获取）</td></tr><tr><td>96孔复制器</td><td>V &amp;amp; P Scientific, Inc.</td><td>定制 407C，3.18 mm 针径，57 mm 长</td><td>通过 V &amp;amp; P Scientific, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro，3 mm 摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>via Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 通道 50-1200&amp;mu;电子移液器</td><td>赛多利斯</td><td>735491PR</td><td>通过 Sartorius</td></tr><tr><td>过滤技巧 50-1200&amp;mu;L，960 个装</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td><td>通过 Fisher Scientific 购买；使用适用于电子多通道移液器的吸头</td></tr><tr><td>干冰</td><td>&lt;em&gt;用户特定供应商&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;个体突变体保存材料&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>移液器（P1000、P200、P20、P2）</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;质量控制 PCR 所需材料&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnistrips PCR管（带圆顶盖）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB0404</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART Barrier 低吸附移液器吸头（10 μL，100 μL，1000 μL）</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543（10 μL）、Z676713（100 μL）、Z676802（1000 μL）</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>移液器（P1000，P200，P20，P2）</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>通过 Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA 纯化试剂盒</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>via Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder，即用型</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM1333</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad 上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;用于文库及单个突变体保存的化学品&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油 MB 级，1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td></td><td></td><td>每升去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，5 g NaCl，1 ml 1 N NaOH（《分子生物学实验指南》）。&amp;nbsp; Wiley，1994。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&amp;nbsp; 琼脂</td><td></td><td></td><td>参见上述制备步骤，加入15 g Bacto Agar</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素，10 g</td><td>生物试剂</td><td>1405-41-0</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>乙醇，190 proof</td><td>去污</td><td>04-355-221</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;质量控制 PCR 用化学品&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>&lt;em&gt;用户首选供应商&lt;/em&gt;</td><td></td><td>参见表3中列出的引物</td></tr><tr><td>康宁 Cellgro 分子生物学级水</td><td>康宁</td><td>46000CV</td><td>通过 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq 聚合酶缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶，重组</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>通过 ThermoFisher</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>通过 Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

铜绿假单胞菌 pa14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于人类环境中。P. aeruginosa 能够形成生物膜、产生抗生素耐药性、分泌毒力因子，并在慢性感染过程中快速进化。因此，P. aeruginosa 可引起急性和慢性感染，且难以治疗，导致特定患者群体中出现显著的发病率。P. aeruginosa 菌株 PA14 是一种人类临床分离株，其基因组结构保守，可感染多种哺乳动物和无脊椎动物宿主，使其成为研究该病原体的理想菌株。2006年，研究人员构建了一个非冗余的转座子插入突变体文库，包含5,459个突变体，对应于4,596个预测的PA14基因。自那时起，PA14文库的分发使科研界能够更深入地理解P. aeruginosa中单个基因及复杂通路的功能。为确保文库在复制过程中的完整性，必须进行规范的操作和精确的技术处理。为此，本文提供了详细的实验方案，描述了文库复制、文库质量控制以及单个突变体正确保存的具体步骤。

使用方案I复制了12份PA14NR文库的新副本，并使用方案III对生成的新副本进行质量控制评估。
按照预设模式交替排列接种了野生型PA14的孔和未接种的孔，构成对照平板（图4A），PA14NR突变体平板与这些对照平板一起，依照方案I中所述方法进行复制。在PA14NR平板集中包含对照平板，用于评估进行平板复制时可能发生的孔间污染。此外，对照平板还可用于在接触含有转座子插入突变体的平板之前练习复制技术。在LB琼脂平板上完成复制并过夜培养后，通过肉眼观察对照平板的生长情况，以确认是否出现预期的生长模式（图4B）。对使用对照平板1接种的深孔板，在过夜培养后通过分光光度计测定OD600，以评估细菌生长情况。结果显示，接种野生型PA14的孔中出现显著生长，而未接种的孔中完全无生长（图...

Pseudomonas aeruginosa 感染在易感宿主中可引起显著的发病率。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株 PA14 的非冗余转座子插入突变体文库（命名为 PA14NR 文库）可用于分析众多生物学过程中的基因功能。本文介绍了一种用于制备高质量 PA14NR 文库拷贝的实验方案。

铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

铜绿假单胞菌是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰阴性细菌，广泛存在于人类生活环境之中。P. aeruginosa ...

本实验方案的总体目标是生成铜绿假单胞菌PA14菌株的有序非冗余转座子突变体文库（称为PA14NR文库）的高质量拷贝。该方案在文库扩增过程中保持PA14NR文库的完整性，从而获得高质量的文库拷贝。本方案的主要优势在于，它详细描述了文库扩增、质量控制以及单个突变体正确保存所涉及的全部步骤。尽管本实验方案旨在复制P14NR文库，但也可进行调整以复制其他细菌文库。通常，初次使用该方法的研究人员会因复制过程中存在污染风险而遇到困难。因此，本方案提供了详细的分步操作说明，以降低此类风险。我们的实验室向全球科学界分发PA14NR文库，并建议由最终用户自行扩增该文库。为提供操作指导，我们提供了一套详细方案，用于制备高质量的文库拷贝。本方案的可视化演示至关重要，特别是为防止交叉污染而设计的步骤。为保护自身安全以及细菌培养物，在处理指定为PA14NR集合的铜绿假单胞菌PA14菌株非冗余转座子插入突变体文库时，应始终穿戴实验服、手套和口罩。通过将约60毫升熔化的LB琼脂倒入矩形培养皿中，制备LB琼脂平板。使用前，在无菌操作台中将平板干燥约一小时。在经乙醇擦拭的实验台面上，用本生灯创建无菌区域，并准备好装有适当溶液的容器，用于复制器针的灭菌。从-80摄氏度冰箱中取出一块PA14NR系列主培养板，置于盛有干冰的4升冰盘中。将待复制的96孔主培养板从干冰上取下，放置在实验台上短暂解冻。将主培养板与琼脂平板对齐，使两块板的A1坐标均位于左上角。在矩形琼脂平板上标记 A1 坐标的位置。为对复制器针进行灭菌，将针浸入 250 毫升 0.3% 至 0.5% 次氯酸钠溶液中 30 秒。轻轻敲击复制器以去除多余液体，随后将针浸入 250 毫升无菌超纯水中 10 秒，接着浸入 250 毫升 70% 乙醇中 30 秒，最后浸入 250 毫升 95% 乙醇中两分钟。将接种针垂直置于本生灯火焰中，通过火焰灭菌。缓慢接近火焰，直至乙醇点燃，然后立即移出火焰。待乙醇完全燃尽后，火焰会自行熄灭。将接种针在未使用的含无菌LB琼脂的矩形平板上轻轻触碰30秒，以冷却接种针。在复制针冷却的同时，用手短暂温热PA14NR集组主板上的铝封膜，然后小心地将其剥离，确保封膜不再接触板面。使用镊子将铝封膜的残留物彻底清除。将复制针插入主板，轻轻推压并沿四个方向摆动复制器，确保针尖与96个孔中每个孔内的冷冻细菌培养物充分接触。通过将复制器针头压向位于平板边缘孔中的冻存菌，特别注意平板外缘的孔。将复制器针头轻轻放置在琼脂平板表面，以轻微的环形动作移动复制器，使每种突变菌株形成约四到五毫米大小的多个菌苔。用新的无菌铝封膜密封 PA14NR 集合主平板。使用平板滚压机确保每个孔以及平板边缘完全密封。将 96 孔主平板放回干冰中。处理完PA14NR菌株后，使用70%乙醇擦拭所有工作台面。将复制的琼脂平板转移至37摄氏度培养箱中，过夜培养。在开始此操作前，请确保超净工作台内无不必要的设备，并开启风机至少10分钟。使用70%乙醇擦拭超净台表面及放置在超净台内的所有物品。使用50至1200微升的12通道电子移液器，向12毫升深孔板的每个孔中加入525微升含有适当抗生素的LB液体培养基。然后在将深孔板从超净台中取出前将其密封。接下来，将装有培养基的深孔板转移至经乙醇擦拭过的实验台面。在台面上使用本生灯创建无菌区域，并准备好盛有适当溶液的容器用于复制器针头的灭菌。按照之前演示的方法，将复制器针头浸入各溶液中。将接种针进行火焰灭菌。然后将接种针插入含有LB琼脂的未使用矩形平板中，冷却30秒。轻轻将接种针放置在含有已培养突变菌株的琼脂平板上，并检查确保每根针均与琼脂平板上的全部96个突变菌株接触。然后将针头浸入含有LB液体培养基的深孔中，持续5到10秒。避免针头触碰孔壁。用无菌透气封膜密封深孔板。使用平板滚压仪确保每个单独的孔都密封良好。处理 PA14NR 套件后，用 70% 乙醇擦拭所有工作台面。将接种后的液体培养物置于37°C、950 rpm条件下，在高速摇床中培养15至16小时。首先清理超净工作台，并开启风机至少10分钟。使用70%乙醇擦拭工作台内所有表面及放入其中的物品。从塑料包装中取出96孔板。将每块板的板标签撕下，并将其贴在目标板靠近A1至H1孔的一侧边缘。轻轻抬起目标板的盖子，将标签贴在下边缘，以便在板盖上盖子时仍能显示标签。从高速振荡器中取出深孔块，并将其转移至无菌超净工作台。小心移除透气密封膜，并更换为铝密封垫。以极低转速离心深孔板，以收集冷凝液。由于将菌液转移至目标培养板的过程存在较高的孔间污染风险，因此必须严格遵循所有无菌操作步骤。将深孔板放回无菌操作台。使用50至1200微升的12通道电子移液器和无菌滤芯吸头，向每个孔中加入525微升甘油LB液体培养基混合液。用电子移液器轻轻上下吹打300微升液体三次，以混匀样品。在注入前，先将枪头接触孔壁，以防止滴液。重新加载带有新的无菌滤芯枪头的移液器，并用甘油LB液体培养基混合液填充下一排孔。当所有孔均加入甘油LB液体培养基混合液后，使用12通道电子移液器和滤芯枪头，从深孔块的每一排中吸取900微升甘油突变株培养混合液，然后向目标板中对应排的各孔中分别分配150微升，以生成六份文库板的副本。使用无菌铝箔封膜覆盖每个96孔目标板，并使用封板机彻底密封板的边缘和所有孔。确保铝箔封膜不覆盖标签标识。将密封好的板从生物安全柜中取出，放置于-80摄氏度冰箱内的平坦且水平的表面上。处理文库后，使用70%乙醇擦拭所有工作台面。按照本视频中演示的方案，共制备了12份PA14NR文库副本，其中包括对照平板，对照平板由按预设模式交替排列的接种PA14菌株和未接种菌株的孔组成。在LB琼脂平板上完成复制后，对对照平板进行肉眼观察，以确认出现预期的生长模式。从新构建的PA14NR文库的拷贝中随机选取了38个突变菌株，使用随机引物进行PCR扩增，以确认转座子突变株的身份。随后对DNA片段进行测序，验证了所检测的38个突变株中35个的身份。一旦掌握相关技术，整个文库的复制大约需要80小时。在使用本方案时，务必始终注意工作区域的无菌条件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备高质量的P14NR文库或其他细菌文库。请勿忘记，操作假单胞菌属（Pseudomonas）可能具有危险性，执行本方案时应始终穿戴个人防护装备。该方案用于保存铜绿假单胞菌PA14非冗余突变体文库，该文库仍是一项重要资源，不仅可用于高通量筛选，还可作为大多数铜绿假单胞菌基因单个突变的来源。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

复制的有序, 非冗余图书馆的铜绿假单胞菌应变 PA14 座子插入突变体

来源：Kazi, M. I., 等.，利用高通量测序技术构建革兰氏阴性菌转座子插入文库。 J. Vis. Exp.

分离含有基因组转座子插入的革兰氏阴性菌

在此，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 mariner转座子介导的诱变用于构建高密度插入突变体文库，以筛选、分离和鉴定模式菌株中新的海藻酸盐调控因子 铜绿假单胞菌...

鉴定与海藻酸盐产生相关的新基因 铜绿假单胞菌 使用微型装置himar1 Mariner 转座子介导的诱变

使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

在此，利用转座子介导的非编码DNA元件随机插入，确定了其在染色体上的最佳位置。...

利用一种新型转座子介导的方法确定 Escherichia coli 中 DNA 元件的最佳染色体位置

本文介绍了一种利用细菌接合技术在大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella...

利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如Escherichia coli或Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

我们在此介绍一种将转座子诱变与高通量测序相结合的技术，用于在仓鼠攻毒后鉴定并定量组织中的转座子钩端螺旋体突变株。该方案可用于筛选突变株在动物体内的存活与播散能力，也可应用于 体外...

高通量并行测序检测适应性 问号钩端螺旋体 转座子插入突变体在金黄叙利亚仓鼠感染过程中的研究

本文介绍了一种用于检验多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中作用的实验方法。...

检测多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter...

在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

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高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

用于在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下培养和分析微生物生物膜的流动池系统应用方案。...

Pseudomonas aeruginosa 和 Saccharomyces cerevisiae 在流动池中的生物膜

学习复制铜绿假单胞菌PA14NR转座子突变体文库的标准化操作流程。本方案详细展示如何通过严格的无菌操作和质量控制措施，确保文库完整性并降低污染风险，为微生物学和病原体研究提供可靠的技术支持。

铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

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