Name: 雄激素依赖性和去势抗性前列腺癌的荧光自体小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 了解前列腺内注射技术建立小鼠原位肿瘤模型，用于研究雄激素依赖性和去势抗性前列腺癌。该方法可模拟临床肿瘤微环境，帮助评估治疗效果和肿瘤免疫反应。

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本工作获得了美国国立卫生研究院向 Praveen Thumbikat（NIDDK R01 DK094898）、Sarki Abdulkadir（NCI R01 CA167966、NCI R01 CA123484、NCI P50 CA180995）和 Jonathan Anker（NCI F30 CA203472）提供的资助。

本方案中所述的所有动物实验操作均须遵守伦理规范，并获得相应大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 手术材料和癌细胞的准备
<ol>
	<li>手术前一天，将显微解剖剪、格拉费镊子、格拉费组织镊、带缝线切割器的持针钳以及相应数量的手术巾进行高压灭菌。使用环氧乙烷气体对50 µL注射器和28号针头进行灭菌图1C).</li>
	<li>手术前一天，在37 °C、5% CO₂培养箱中，将Myc-CaP细胞接种于10 cm培养皿中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的RPMI培养基进行培养。2 培养箱。对于生物发光和/或荧光肿瘤监测，先将293T细胞转染适当的载体，随后用0.45 µm滤膜过滤的慢病毒感染Myc-CaP细胞31分选细胞以获得转导阳性率为100%的稳定细胞系。 
	注意：所有组织培养操作均需在无菌条件下进行，并确保所有细胞系无支原体污染。本研究中使用的小鼠前列腺癌细胞系为 Myc-CaP32，被转导以稳定表达萤火虫荧光素酶和mCherry。Myc-CaP细胞系源自一只 c-myc过表达 Hi-myc 的小鼠，这些细胞含有扩增的雄激素受体（雄激素受体），其为雄激素依赖性32 在小鼠去势后形成CRPC肿瘤33本研究中所有小鼠均为6-8周龄雄性FVB/NJ小鼠。可根据相应遗传背景选用其他小鼠前列腺癌细胞系，亦可使用人前列腺癌细胞系或来源于患者的原代前列腺癌细胞，并结合免疫缺陷小鼠进行实验。不同细胞系每针注射的最佳细胞数量需通过实验确定。此外，可采用其他成像方式观察肿瘤，包括磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）或计算机断层扫描（CT），也可使用GFP替代mCherry作为荧光标记。</li>
	<li>手术前一晚，将不含酚红的Matrigel基底膜基质置于4 °C冰箱中过夜解冻。</li>
	<li>手术当天，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化使细胞脱落。使用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用不含FBS或P/S的10 mL RPMI洗涤细胞。</li>
	<li>计数细胞，并将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 6.67×107 细胞/mL（1×106 细胞/15 µL</li>
	<li>加入等体积的Matrigel，制备成终浓度为1×10的1:1 PBS/Matrigel细胞悬液6 细胞/30 µL，注射前将细胞置于冰上以防止凝固。 
	注意：在制备 Matrigel 细胞悬液后的 3 小时内完成前列腺内注射。若对超过 5 只小鼠进行前列腺内注射，需重复上述步骤，制备新鲜的 Matrigel 细胞悬液。</li>
</ol>
2. 术前小鼠准备
注意：手术前至少将小鼠在大学动物饲养设施中适应一周，以确保充分适应环境并尽量减少动物应激。步骤 2.1–2.6 由外科助手完成。所有后续手术步骤均由外科医生使用无菌手套和无菌手术器械，采用无菌技术操作。
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉小鼠（通过麻醉舱诱导浓度为2-5%，通过鼻罩维持浓度为1-3%）。通过夹趾反射消失确认麻醉完全。</li>
	<li>称量小鼠体重，并皮下注射至少0.05 mg/kg的镇痛剂布托啡诺。 
	注意：小鼠体重≥20 g更有利于成功进行前列腺内注射。</li>
	<li>在双眼涂抹眼用软膏以润滑角膜，防止角膜干燥。</li>
	<li>剃除腹部所有毛发。</li>
	<li>使用无菌不粘垫蘸取外科消毒液，以腹部为中心环形擦拭三遍，再用无菌酒精湿巾擦拭三遍，对腹部进行消毒。等待腹部自然干燥。 
	注意：在后续手术过程中，仅允许无菌手套和无菌手术器械接触已消毒的腹部区域。</li>
	<li>将小鼠仰卧位转移至加热垫上的洁净表面，并置于洁净手术显微镜物镜正下方。</li>
	<li>用无菌手术巾覆盖小鼠身体，仅在腹部位置留一小孔暴露手术区域。</li>
</ol>
3. 前列腺内注射
注意：所有手术步骤均须在无菌条件下进行。调整显微镜、小鼠位置或任何其他非无菌物品的操作必须由手术助手完成。
<ol>
	<li>在阴茎和包皮腺上方腹部正中线处，对外侧皮肤进行约1 cm的切口（图1D）。</li>
	<li>用剪刀在组织层之间分离腹外侧皮肤与腹内肌肉之间的结缔组织。</li>
	<li>在用镊子提起腹内肌肉以避免刺破肠管或膀胱的同时，对腹内肌肉进行类似的切口（图1D）。</li>
	<li>寻找双侧精囊之一（图1A，白色）或前前列腺叶（图1A，黑色），它们通常位于膀胱（图1A，黄色）的后方、外侧并略偏上方，但该位置在不同小鼠间可能存在差异。前前列腺叶呈半透明状，并附着于白色精囊的较小曲面处。</li>
	<li>使用格拉夫组织镊轻轻提起精囊尖端，使组织产生张力，但避免刺破精囊（图1E）。</li>
	<li>通过轻柔吹吸混匀Myc-CaP Matrigel溶液（由手术助手操作），因细胞可能发生沉淀，缓慢吸取30 µL（1×106个细胞）至针头中，避免产生气泡。</li>
	<li>将针头斜面小心地平行于前前列腺叶长轴方向插入。缓慢将30 µL液体注入叶内，然后缓慢退出针头以防止泄漏（图1F）。通过观察前前列腺叶是否肿胀来确认注射充分（图1G）。</li>
	<li>将精囊及已注射的前列腺叶小心地保持在小鼠体外约30秒，使Matrigel在叶内部分凝固。在此期间，使用无菌聚酯棉签收集腹腔内可能渗漏的细胞溶液，以防止异位肿瘤形成，但切勿压迫已注射的前列腺叶。</li>
	<li>小心地将精囊和已注射的前列腺叶放回腹腔，避免对其施加压力。复位所有外露的组织。</li>
	<li>使用5-0 Vicryl可吸收反向切割缝合针，行连续缝合关闭腹内肌肉层。</li>
	<li>使用4-0尼龙单股不可吸收反向切割缝合针，行间断缝合关闭腹外侧皮肤。 
	注意：也可使用已灭菌的9 mm皮肤钉合器关闭腹外侧皮肤。然而，与缝线不同，皮肤钉会干扰后续的生物发光和荧光肿瘤成像信号。</li>
	<li>用无菌乙醇湿巾（由手术助手开启）清洁所有器械，并将其置于玻璃珠灭菌器中灭菌30秒。在用于下一只小鼠前，确保器械完全干燥。</li>
	<li>用无菌生理盐水（由手术助手开启）冲洗注射器和针头，防止残留Matrigel造成堵塞。 
	注意：所有手术操作均应配备手术助手，负责完成所有非无菌的术前小鼠准备和术后护理工作，并在注射前混匀Myc-CaP Matrigel溶液。为节省时间（因每只小鼠的前列腺内注射操作需20–30分钟），可在主刀医生为当前小鼠缝合时，由助手开始准备下一只小鼠。</li>
</ol>
4. 术后小鼠护理
<ol>
	<li>术后立即、24 小时和 48 小时，皮下注射 1 mg/kg 镇痛剂美洛昔康。</li>
	<li>将小鼠置于笼中恢复，笼子一半放置在加热垫上，且不加垫料。术后至少监测小鼠 30 分钟，直至其恢复正常活动和运动能力，之后将其转移至清洁笼具中，并将食物放置在笼底。</li>
	<li>术后每日继续监测小鼠伤口愈合情况、体重、理毛行为及活动能力。一旦发现打斗迹象，立即将小鼠分笼饲养。</li>
	<li>术后 14 天内拆除所有残留缝线。</li>
</ol>
5. 生物发光肿瘤成像
<ol>
	<li>按照制造商说明制备经无菌过滤的 Na+ 或 K+ D-荧光素，并避光保存。</li>
	<li>按每克体重 10 µL 的剂量，对小鼠进行腹腔注射荧光素。</li>
	<li>至少 10 分钟后，使用 IVIS Spectrum 成像系统对小鼠进行成像，操作方法如前所述34,35。</li>
	<li>使用 Living Image 软件分析图像，方法如前所述34,35。 
	注意：IVIS 成像分析可用于确认前列腺内注射是否成功，以及评估早期肿瘤的形成情况，从而在实验组之间标准化肿瘤负荷。然而，根据生物发光或荧光信号的强度，即使实际肿瘤体积增大，图像定量结果可能因信号饱和而达到平台期。因此，在肿瘤生长的后期阶段，IVIS 成像在判断有效治疗后肿瘤体积的缩小方面较为有用，而在图像饱和后判断肿瘤体积的进一步增大则受限。</li>
</ol>
6. 肿瘤采集、肿瘤分析、生存终点
<ol>
	<li>若需采集肿瘤用于分析，可通过 CO2 吸入并辅以颈椎脱位的方式人道处死小鼠，或采用其他经 IACUC 批准的方法，并从腹腔中解剖分离肿瘤。肿瘤应位于前列腺原位。 
	注意：若肿瘤附着于腹前壁或在腹腔内广泛播散，提示原位前列腺注射操作不佳或存在泄漏，不应视为原位肿瘤。</li>
	<li>称量肿瘤重量。</li>
	<li>按公式 π/6×L×W×H 计算肿瘤体积（L 为肿瘤最长轴长度，W 为垂直宽度，H 为垂直高度）。</li>
	<li>肿瘤可用于组织学分析（置于 10% 中性缓冲福尔马林中固定）、流式细胞术分析（制备单细胞悬液）、蛋白质分析（使用 RIPA 缓冲液制备组织裂解液）或 RNA 分析（立即将组织置于 RNAlater 中保存）。</li>
	<li>如需进行免疫学分析，还需采集前列腺肿瘤引流的腹主动脉旁淋巴结（图 1B，橙色）及脾脏。 
	注意：若对小鼠进行生存期观察，该模型的实验终点定义为出现出血性腹水36 和/或活动能力下降、理毛行为减少和/或竖毛现象37。用于生存分析的小鼠需接受术前和术后镇痛处理（操作步骤 2.2、4.1），并须定期监测。若发生争斗行为，应将小鼠分笼单独饲养；一旦出现上述任一终点指标，应立即实施人道处死。</li>
</ol>
7. 通过手术去势建立CRPC模型
<ol>
	<li>为建立CRPC模型，执行上述前列腺内注射方案（方案步骤1-5）。</li>
	<li>肿瘤形成后至少一周，按照先前所述方法38通过电灼术进行手术去势。</li>
	<li>通过生物发光成像监测肿瘤的消退与复发。去势后，肿瘤将在3天内开始消退，并在约30天内复发，代表CRPC的形成。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们概述了进行前列腺内癌细胞注射手术的实验方案。我们采用了一种依赖雄激素且MYC过表达的小鼠前列腺癌细胞系Myc-CaP（MYC过表达见于约80–90%的人类前列腺癌39），该细胞系最初来源于Hi-Myc小鼠32,33。该细胞系经稳定转导，可同时表达荧光素酶和mCherry，分别用于无创的体内生物发光和荧光肿瘤成像。此外，在雄激素依赖性肿瘤形成后，我们还实施了手术去势，从而诱导肿瘤退缩并随后复发。因此，我们提供了在免疫健全宿主中建立原位雄激素依赖性前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌（CRPC）模型的详细方法。
将 Myc-CaP 细胞注射至小鼠的前叶前列腺。小鼠前列腺由前叶、腹叶和背外侧叶组成，而人类前列腺则在一个单叶内分为外周带、移行带和中央带40。尽管先前的研究在解剖学和组织学上将小鼠背外侧叶与人类外周带（大多数前列腺癌的发生部位）41，以及小鼠前叶与人类中央带进行过比较42,43，但近期更全面的分析表明，与腹叶相比，前叶和背外侧叶具有高度相似的基因表达模式44。此外，在基因工程小鼠（GEMs）的前叶中已观察到前列腺癌的发生40；并且在进行前列腺内注射操作时，前叶能够容纳所需体积的癌细胞悬液，同时最小化泄漏和操作变异性。
使用皮下（s.c.）移植和转基因GEM癌症模型存在多种缺陷和局限性。与相同细胞系产生的原位肿瘤及人类疾病相比，皮下肿瘤在人工肿瘤微环境（TME）中生长，对化疗药物的反应存在差异20,21,22。这可能是由于皮下肿瘤的血管结构发生改变，例如其对抗血管生成治疗的反应不同即为佐证18,19。相反，原位肿瘤可在具备正常TME、引流淋巴结和血管系统的环境中形成，且可使用小鼠细胞系进行建模，从而能够研究肿瘤免疫学特性以及对免疫治疗的反应。
转基因基因工程小鼠（GEM）可在免疫功能健全的宿主体内形成具有适当肿瘤微环境（TME）的肿瘤，但这些模型通常仅通过单个或少数几个基因改变来诱导肿瘤，从而过度简化了人类癌症的复杂性29。对Myc-CaP及其他前列腺癌细胞系的分析显示，与Hi-Myc小鼠及其他来源GEM模型的肿瘤相比，这些细胞系具有更多的体细胞拷贝数变异和染色体变异29。此外，GEM模型还受限于实验所需的小鼠繁育成本较高且耗时较长，难以开展具有足够统计效力的研究。原位肿瘤模型可克服这些局限性。人源和鼠源前列腺癌细胞系包含大量与人类疾病相关的遗传变异29，并且与人类癌症相似，其单个细胞之间也表现出高度异质性30。原位鼠源同系移植肿瘤可用于免疫学分析，而原位人源异种移植肿瘤则可用于评估治疗药物对人类细胞的作用。最后，与GEM模型不同，细胞系可在注射前进行遗传修饰，从而表达生物发光或荧光成像分子，用于监测肿瘤生长、在实验组间标准化肿瘤负荷、评估治疗反应，以及追踪手术去势后的肿瘤消退和去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的复发。
本方案的关键步骤包括在不损伤其他组织或刺破精囊的前提下，准确定位并游离出精囊及其附着的前前列腺叶；成功将30 µL细胞悬液注入前列腺内且无泄漏；以及妥善收集任何渗漏的细胞，防止在腹腔内形成异位肿瘤。原位前列腺注射的主要局限性在于需要掌握一定的技术技巧，以尽量减少小鼠间肿瘤生长的变异性。这一点在建立CRPC模型时尤为重要，因为该模型还需额外进行手术去势。接受原位注射并实施去势的小鼠必须密切监测术后恢复情况及不良事件，因其已接受两次可存活的重大手术。另一局限性在于每次原位注射所需时间，尽管该时间可缩短至20分钟，且在当前小鼠缝合时，手术助手可同时准备下一只小鼠。此外，原位Myc-CaP肿瘤具有高度侵袭性和快速生长特性，通常在约46天（最早可在35天）因原发肿瘤体积达到实验终点而需终止实验。对于需要较慢肿瘤生长速度或长期治疗的研究，应根据初始接种细胞数量和治疗方案进行经验性优化。与皮下肿瘤模型和GEM模型的局限性相比，上述原位肿瘤模型的各项局限均可克服，并可根据具体实验需求对方案进行进一步调整。
由于原位肿瘤模型涉及使用 体外-处理的细胞，可根据研究需求进行改造。在此，我们对这些细胞进行了改造，使其稳定表达荧光素酶和mCherry，以用于 体内 肿瘤监测。我们还对肿瘤抑制基因进行了 CRISPR-Cas9 敲除 PTEN，以生成更具侵袭性且更贴近临床的细胞系，该细胞系在原位移植时成瘤速度更快（相关论文正在审稿中）。凭借原位肿瘤模型的优势，结合对雄激素依赖性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的研究能力，以及表达成像标记物或对特定基因进行敲低或过表达的潜力，本实验方案为所有前列腺癌研究提供了宝贵的资源。

据估计，2017年前列腺癌的发病率最高（约161,360例男性患者），并导致男性癌症死亡人数位居第三（约84,590例男性患者）1。在诊断时，前列腺肿瘤依赖雄激素，通常采用手术前列腺切除术、放射治疗和/或雄激素剥夺治疗（ADT）进行治疗，但每种治疗方法均伴随多种严重并发症和合并症2,3,4,5,6,7,8,9,10。尽管ADT治疗后肿瘤会退缩，但几乎所有肿瘤最终都会复发为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。在此阶段，获批的治疗方法包括多西他赛、Sipuleucel-T免疫疗法以及抗雄激素小分子药物恩杂鲁胺和阿比特龙，但任何单一疗法带来的生存获益均不超过5.2个月11,12,13,14,15,16,17。因此，所有阶段的前列腺癌患者均亟需更优的治疗选择和并发症管理策略，而实现这一目标的关键在于建立理想的临床前疾病模型。
通过正确的操作步骤，可将前列腺癌细胞系直接接种至小鼠前列腺内，从而建立同系或异种原位肿瘤模型。原位肿瘤建模是肿瘤生物学和药物研发研究的理想选择，因其能够形成具有临床代表性的肿瘤微环境（TME）。既往研究表明，皮下（s.c.）移植肿瘤的肿瘤血管结构发生改变，导致其对抗血管生成疗法的反应与临床实际情况存在差异且准确性较低18,19。此外，多项研究发现，同一种细胞系在接受不同给药方式（皮下或原位）治疗时，多种化疗药物的疗效表现出增强或减弱，而原位模型更接近人类癌症的实际表现20,21,22。进一步研究还发现，只有在结肠癌的原位模型中（而非皮下模型），肿瘤才会产生诱导转移所必需的正确降解酶23。最后，随着免疫疗法在癌症治疗中的不断兴起，尤其是其在前列腺癌治疗中尚未带来显著临床获益24,25，在免疫功能健全的宿主体内构建具有准确TME和引流淋巴结的同系临床前模型显得尤为关键。
基于肿瘤部位的不同，导致这些不一致研究结果的因素有很多。由于具有不同的肿瘤微环境（TME），癌细胞暴露于不同的组织特异性内皮以及改变的血管生成过程，从而影响肿瘤的发展26,27。具有正确TME的原位肿瘤可实现临床相关的药物递送、缺氧条件的模拟以及抗血管生成疗法的评估28。尽管基因工程小鼠模型（GEMs）确实具有准确的TME，但其繁育周期长、成本高，且通常基于单个或少数几个基因的敲除或过表达，其表达水平往往超出临床相关范围。相比之下，用于原位肿瘤研究的人源或小鼠前列腺癌细胞系与人类肿瘤类似，在单个细胞内部以及细胞间的异质性方面均具有更高的遗传复杂性29,30。此外，与GEMs不同的是，原位癌细胞系可被改造以表达特定的成像模态，或上调或下调其他目标分子的表达水平，从而可直接比较体外（in vitro）和体内（in vivo）的实验结果。原位肿瘤也可由患者来源的原代细胞形成。本文中，我们报道了一种将前列腺癌细胞注射至前列腺内以形成原位雄激素依赖性肿瘤的方法，并在去势后复发为原位去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。

<table><tbody><tr><td>Myc-CaP 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>使用前验证无支原体污染</td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Graege 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 组织镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>带缝线剪的 Olsen-Hegar 持针器</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L 注射器 705 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>使用环氧乙烷气体灭菌</td></tr><tr><td>28 号针头 小针座 RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>尖端类型 4，角度 45&amp;deg;，长度 0.75 英寸。使用环氧乙烷气体灭菌</td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Gibco</td><td>18875-093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质，无酚红，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>使用前在冰上于 4&amp;deg;C 过夜解冻</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>11695-0500-2</td><td>由西北大学比较医学中心（CCM）获取</td></tr><tr><td>26 5/8 号注射器</td><td>BD</td><td>309597</td><td>用于美洛昔康和布托啡诺注射</td></tr><tr><td>盐酸布托啡诺 0.3 mg/mL</td><td></td><td>12496-0757-5</td><td>管制药品，由西北大学 CCM 获取</td></tr><tr><td>眼科润滑软膏</td><td>Akron</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液（7.5%）</td><td>Purdue Products</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>无菌非粘连敷料垫</td><td>Moore Medical</td><td>10775</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精擦拭片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜 Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌聚酯头涂抹棒</td><td>Puritan</td><td>25-806 1PD</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl 可吸收反向切割缝合针线</td><td>eSutures</td><td>J493G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 尼龙单丝不可吸收反向切割缝合针线</td><td>eSutures</td><td>699H</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水 0.9% 氯化钠</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-02</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康（Eloxiject）5 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6925-1</td><td>由西北大学 CCM 获取</td></tr><tr><td>D-荧光素（萤火虫），钠盐一水合物</td><td>Goldbio</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauery 外科笔</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>CD3&amp;epsilon; 抗体（克隆号 2GV6）</td><td>Ventana</td><td>790-4341</td><td></td></tr><tr><td>游标卡尺</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>雄激素受体抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9030-P1</td><td>染色稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>突触素抗体（克隆号 Z66）</td><td>Life Technologies</td><td>18-0130</td><td>染色稀释比例 1:200</td></tr></tbody></table>

一种用于雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

原位肿瘤建模是前列腺癌临床前研究的重要工具，相较于皮下移植模型和转基因基因工程小鼠模型，具有多项优势。与皮下肿瘤不同，原位肿瘤具有更接近临床实际的血管结构、肿瘤微环境以及对多种治疗的响应特性。与基因工程小鼠模型相比，原位模型成本更低、实验周期更短，可使用高度复杂且异质性的小鼠或人类癌细胞系，而非仅依赖单一基因改变，且这些细胞系可进行遗传修饰，例如表达成像探针。本文介绍一种将表达荧光素酶和mCherry的鼠源性前列腺癌细胞系通过手术接种至小鼠前叶前列腺的实验方案。这些小鼠可形成原位肿瘤，并可通过非侵入性方式对其进行监测

原位肿瘤建模，前列腺癌，小鼠模型，手术接种，生物发光成像，mCherry，荧光成像，肿瘤微环境，临床前研究 体内 并进一步分析肿瘤体积、重量、小鼠生存率及免疫细胞浸润情况。此外，对原位荷瘤小鼠进行手术去势，可导致肿瘤立即退缩并随后复发，模拟去势抵抗性前列腺癌。尽管该操作需要一定的技术熟练度，但这一同源原位的、兼具雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌模型，对本领域所有研究人员均具有重要应用价值。

在本研究中，我们将小鼠前列腺癌细胞系 Myc-CaP 通过手术方式注射至前叶前列腺中（图 1A），从而建立具有临床相关肿瘤微环境（TME）及正确前列腺引流淋巴结的原位前列腺肿瘤模型（图 1B）。该操作使用显微解剖剪、格拉夫镊、格拉夫组织镊、带剪线器的持针钳，以及配备28号针头的50 µL注射器完成（图 1C）。在阴茎腺上方行约1 cm长的腹正中切口后（图 1D），暴露并牵出一侧精囊腺及其相连的前叶前列腺组织（图 1E），将30 µL含1×106个细胞的1:1 PBS/基质胶（matrigel）细胞悬液注射至前列腺内（图 1F），注射成功最初通过腺叶充血肿胀且无液体渗漏来确认（图 1G）。
为监测原位肿瘤的生长，我们对 Myc-CaP 细胞进行了稳定转染，使其同时表达萤火虫荧光素酶和 mCherry，从而可通过非侵入性方法追踪肿瘤 体内 生物发光图 2A）和荧光（图2B），分别进行。该成像技术的一个局限性在于，根据信号强度的不同，成像定量可能达到饱和，而肿瘤仍在持续增大。因此，在信号强度较高时，此 体内 成像技术更适用于在实验分组初期对肿瘤负荷进行标准化，以及在实验性治疗后评估肿瘤体积的缩小情况。此外，还可采用其他成像方式，如小动物磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）或计算机断层扫描（CT）。
在前列腺内注射后第30天，从腹部解剖分离原位肿瘤（图3A）。原位肿瘤应位于前叶前列腺部位。若肿瘤组织广泛分布于腹腔或附着于腹前壁，则提示前列腺内注射操作不当并发生泄漏。采用正确技术时，肿瘤体积（图3B）和重量（图3C）可被记录，且标准误差相对较小。然而，如观察所示，仍会存在小肿瘤与大肿瘤之间的一定变异性。因此，在所有实验中，实验分组前使用治疗前影像学定量以均衡各实验组间的肿瘤负荷至关重要。此外，由于这些小鼠癌细胞被注射至免疫健全的FVB/NJ小鼠体内，可通过免疫组织化学（IHC）（或流式细胞术或其他技术）对肿瘤微环境（TME）中的CD3 T细胞（图3D）（或其他免疫细胞类型）进行分析。最后，该模型可提供客观的生存终点指标，因为较大的原发肿瘤可导致出血性腹水36（图3E）和/或活动能力下降、理毛行为减少和/或竖毛现象37。偶有情况下，死亡也可能由肿瘤生长阻塞尿液排出所致。
最后，该模型可用于研究雄激素依赖性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌（CRPC），后者预后较差，亟需新的治疗方案。在原位肿瘤形成后，小鼠接受手术去势，操作如前所述38。由于这是第二次重大生存手术，必须格外注意监测小鼠的恢复情况以及任何不良事件或并发症。去势后3天内可观察到明显的肿瘤退缩，随后约30天后出现肿瘤复发，代表CRPC的形成（图4A）。CRPC肿瘤可被分离并进行组织学分析，未显示任何神经内分泌分化特征，因其仍维持较高的雄激素受体（AR）水平，并且神经内分泌标志物突触素（synaptophysin）呈阴性（图4B）。
<img alt="啮齿类动物手术示意图；工具、切口、组织操作；解剖过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：前前列腺叶、引流淋巴结及前列腺内细胞注射的代表性技术。 图中显示（A）右侧前前列腺叶（黑色，*）、附着的右侧精囊（白色）、右侧睾丸及脂肪垫（绿色）和膀胱（黄色）；（B）双侧前列腺引流的腹主动脉旁淋巴结（橙色）；（C）显微解剖剪、格拉夫镊、格拉夫组织镊、带剪线器的持针钳，以及装有28号针头的50 µL注射器（从左至右）；（D）正中切口；（E）精囊和前前列腺叶的外翻；（F）前列腺内注射；以及（G）前前列腺叶的充血肿胀。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤进展的生物发光成像；小鼠数据系列；定量通量图谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2： 体内 生物发光与荧光肿瘤成像 （A） 荧光素酶-和 (B) 使用 IVIS Spectrum 成像系统对表达 mCherry 的原位 Myc-CaP 肿瘤进行成像。生物发光通过总通量（光子数/秒）进行定量。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤分析流程；包括肿瘤标本、体积/重量图表、组织学切片、实验对象。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过肿瘤体积、重量、组织学评估免疫细胞浸润及生存率对原位肿瘤进行分析。 原位肿瘤在前列腺内注射后第30天进行解剖，并通过以下方式分析：（A） 大体成像，（B） 肿瘤体积（π/6×L×W×H；L=肿瘤最长轴长度，W=垂直宽度，H=垂直高度），（C） 肿瘤重量，（D） CD3免疫组化染色（比例尺=100 µm），以及（E） 生存率，以出现出血性腹水作为客观终点指标。（A-B） 数据以均值±均值标准误表示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="去势前和去势后小鼠的荧光成像；肿瘤进展图表；组织学插图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过前列腺内注射结合后续外科去势，建立雄激素依赖性前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌（CRPC）模型。 （A） 携带原位表达荧光素酶肿瘤的小鼠在去势（Cx）前后通过生物发光成像进行监测，（B） 复发的CRPC肿瘤被分离（黑色=原位前列腺肿瘤；黄色=膀胱），并通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色、雄激素受体（AR）免疫组化（IHC）以及突触素（synaptophysin）免疫组化（IHC）（含阳性小鼠对照）进行分析（比例尺=50 µm）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

本实验方案的目的是演示前列腺癌细胞的前列腺内注射，随后进行阉割。在具有临床相关性的肿瘤微环境和免疫健全宿主的背景下，建立依赖雄激素及去势抵抗性前列腺癌的原位临床前模型，对于研究该疾病至关重要。

原位肿瘤建模是前列腺癌临床前研究的重要工具，相较于皮下和……

本实验的总体目标是通过向小鼠前列腺内注射小鼠癌细胞，诱导形成可模拟雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的同源异位肿瘤。该方法有助于回答前列腺癌研究领域中的关键问题，例如前列腺癌的发生机制是什么，以及哪些治疗方法在消除这些肿瘤方面效果最佳。该技术的主要优势在于，异位肿瘤具有更高的遗传复杂性，能够在临床上具有代表性的肿瘤微环境中发育，并且可在注射前进行遗传修饰。该技术的应用前景涉及人类前列腺癌的治疗，因为原位肿瘤对治疗的反应与人类患者中观察到的情况相似。在确认小鼠对脚趾挤压无反应后，将眼药膏涂抹于小鼠眼部，并剃除动物腹部全部毛发。使用无菌不粘连垫进行三轮外科擦洗，再用无菌酒精擦拭巾擦拭，对暴露的皮肤进行消毒。当皮肤干燥后，将小鼠仰卧置于清洁表面上，并放置于加热垫上，正对洁净手术显微镜的物镜下方。用无菌手术单覆盖动物，仅在腹部区域剪开一小孔暴露腹部。沿腹中线、阴茎及包皮腺上方，对外侧皮肤及腹壁内侧肌肉进行一厘米长的切口。找到位于膀胱后方、外侧且略偏上方的一侧精囊及其相连的前叶前列腺。请助手通过轻柔吹打混合 MIC-CAP Matrigel 癌细胞悬液，并缓慢吸取 30 µL 细胞悬液至连接在 50 µL 注射器上的 28 号针头中。随后，使用 Graefe 组织镊轻轻提起一侧精囊的尖端，使组织产生张力但不刺破精囊，再将针头斜面平行于前叶前列腺的长轴方向小心插入。缓慢将全部细胞悬液注入前列腺叶内，随后缓慢退出针头，以防止液体外漏。成功的注射可通过前叶前列腺的肿胀显现。小心且稳定地将精囊和已注射的前列腺叶置于小鼠体外约30秒，以使Matrigel在叶内部分凝固。使用无菌聚酯头涂抹棒收集可能泄漏至腹腔的细胞溶液，以防止异位肿瘤的形成。准确的假体内注射对于非正位肿瘤的形成至关重要。需格外注意避免穿刺到精囊，缓慢注射癌细胞悬液，并收集任何漏出的细胞，以提高该操作的成功率。现在，轻柔地将精囊和已注射的叶瓣放回腹腔，避免对叶瓣施加压力，并复位所有外置的组织。使用5-0 Vicryl可吸收反向切割针缝线，以连续缝合方式闭合腹壁内层肌肉组织，随后使用4-0尼龙单丝不可吸收反向切割针缝线，以间断缝合方式闭合腹壁外层皮肤。术后给予镇痛处理，并将小鼠置于加热垫上的一半无垫料笼中，持续监测直至完全恢复。Myc-CaP细胞经稳定转染表达萤火虫荧光素酶和mCherry后，可通过非侵入性活体生物发光和荧光成像追踪前列腺肿瘤。此处显示的是在前列腺内注射后第30天从腹部解剖获得的代表性肿瘤。采用适当的技术，肿瘤体积和重量可记录为相对较小的标准误差，尽管小肿瘤与大肿瘤之间存在一定的变异性。通过免疫组织化学方法，也可对前列腺内注射的小鼠癌细胞进行分析，以检测肿瘤浸润性CD3阳性T细胞或其他感兴趣的免疫细胞的存在情况。此外，该模型提供了一个客观的生存终点指标，因为较大的原发肿瘤可导致出血性腹水和/或活动能力下降、理毛行为减少和/或竖毛现象。在前列腺内注射后三天进行去势手术，可引起肿瘤显著退缩，随后约30天后出现肿瘤复发，模拟了去势抵抗性前列腺癌的特征。对去势抵抗性前列腺癌肿瘤进行解剖和组织学分析显示，肿瘤未出现神经内分泌分化，仍维持较高的雄激素受体水平，且神经内分泌标志物突触素呈阴性。一旦掌握，该技术若操作得当，可在 20 至 30 分钟内完成。在实施该手术过程中，重要的是须牢记给予术前和术后镇痛药物，并在手术助手的协助下，采用无菌技术完成所有手术操作。在完成该手术后，可进一步开展免疫组织化学、流式细胞术、肿瘤体积与重量评估以及动物生存分析等其他方法，以回答有关免疫治疗及其他实验疗法反应的更多科学问题。观看本视频后，您应充分了解如何将前列腺癌细胞注射至小鼠的前叶前列腺，以便后续进行手术去势及肿瘤消退与复发分析。请务必注意，操作癌细胞可能具有极高危险性，因此在执行该操作时，必须采取相应预防措施，例如始终佩戴合适的个人防护装备。

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