96孔板格式下对人诱导多能干细胞来源神经元进行高速拉伸损伤的方法

该模型的总体目标是建立一种具有临床相关性的神经创伤表型，并以96孔板形式呈现，以便高效、同步地比较多种实验条件下所造成的损伤。该模型的主要目的是利用人源诱导多能干细胞分化的神经元，推动神经创伤领域的高内涵表型药物筛选。本模型所使用的培养板保留了行业标准的96孔板几何结构，可与现有的高内涵筛选设备（如机械臂和自动化显微镜）兼容。

首先，将一个无底部的96孔板倒置（底部朝上）放入200瓦的等离子清洗仪中，在高功率下处理60秒。接着，将该孔板底部朝下放入200毫升新配制的1.5% APTES去离子水溶液中，在通风橱内孵育20分钟。在孵育进行至10分钟时，使用镊子将经等离子处理的硅胶膜置于一张7.5 × 11厘米的烘焙纸矩形片上表面，并将一块7.5 × 11.05厘米的铝板对齐放置于孔板制备夹具的下部区域。

然后使用镊子将硅胶膜和羊皮纸在铝板上对齐。在涂覆结束后，将无底板从 APTES 溶液中取出，并抖去多余的溶液。将无底板依次浸入两份连续的 200 毫升去离子水浴中，每次浸入 5 秒，然后抖去多余的水分。

用压缩空气完全干燥后，将无底板放入平板制备夹具的上部，轻轻合上夹具，使无底板与硅胶压合在一起。为对齐压头模块，使用载物台夹具将平板固定在拉伸装置的载物台上，并在具有实时画面的摄像头下操作，同时将穹顶光源置于装置上方。启动连接损伤装置的计算机上的仪器控制软件，点击“Launch”窗口以运行体外神经创伤实验项目。

在项目窗口中，双击运动控制和位置跟踪虚拟仪器。关闭围绕损伤装置的防护罩，然后单击运动控制虚拟仪器中的箭头以运行该仪器。单击靠近底部的位置，将载物台下降至距压痕器接触位置两毫米以内，然后单击停止以关闭虚拟仪器。

在项目窗口中，右键单击 Axis One，然后单击交互式测试面板。在弹出窗口的“目标位置”字段中输入 500 个单位，以将步长设置为 50 微米。然后反复单击“运行”，直到载物台首次接触到任意压头，并通过相机显示的实时图像检查接触情况。

交互式测试面板窗口的左上角将显示载物台的垂直位置。继续降低培养板，直到每个孔都与压头接触，必要时移动摄像头和载物台以查看整个培养板。当所有柱体均接触时，记录显示的载物台垂直位置，然后关闭交互式测试面板。

接下来，运行运动控制虚拟仪器，点击“Top”以抬升载物台，并在载物台到达指定位置后使用停止按钮关闭虚拟仪器。打开门以使设备停止工作，然后松开最先接触的角落上的紧定螺钉以降低该角落，同时拧紧对角的螺钉以抬高最后接触的角落。重复进行平板下降、观察和调整过程，直至平板与所有压头同时接触。

精确对齐压痕模块对于在培养板所有孔中实现均匀损伤至关重要。打开门以再次关闭设备，将固定螺钉插入压痕模块上的孔中。然后将螺钉拧紧至固定位置，并注意当培养板接触时交互式测试面板显示的载物台位置。

为拉伸培养板，将位置检测虚拟仪器中“文件路径”字段内的文件名更改为唯一的文件名，然后点击运行箭头。在运动控制面板虚拟仪器中设置压痕的深度和持续时间，以及“损伤”和“损伤持续时间”字段。将培养板置于零位置后，运行运动控制面板虚拟仪器，然后点击“损伤”以对培养板进行压痕处理。

点击“顶部”按钮使载物台上升，当培养板到达顶部位置时点击停止，并打开门以关闭损伤装置。然后检查位置追踪虚拟仪器中显示的载物台位移历史，确认已施加指定的最大位移，并将数据导出至合适的电子表格程序。为评估硅胶膜的拉伸情况，在等离子处理后，将培养板放置在柔软表面上，并用永久性记号笔的墨水预涂印章上的小突起部分。

将印模插入待检测的第一个孔中，并轻敲以确保墨水充分转移。当所有孔均完成印模后，将高速相机置于损伤装置上方的悬臂架上，镜头光圈调至最小数字档位，使视野中包含以 3×4 网格排列的 12 个压痕针。将装置置于零点位置后，点击相机软件上的录制按钮，使其显示“触发输入”，然后打开明亮的漫射轴向光源。

然后按照刚刚演示的方法对培养板进行压痕处理，并关闭轴向光源。为建立细胞损伤模型，向经等离子体处理的培养板每孔中加入100 µL经层粘连蛋白处理的人诱导性多能干细胞来源的神经元，于室温孵育15分钟，使细胞贴附至培养板底部，随后将培养板放入细胞培养箱中。培养2至3天后，将培养板固定在损伤装置的载物台上，并调整盖子的位置，以固定培养板，同时避免细胞培养物暴露于环境空气中。

然后，将培养板置于零点位置，按照刚刚演示的方法对培养板进行压痕。理想的未受损培养物中，超过五个细胞的细胞团应极少或没有，神经突应为独立、细长且弯曲的形态，几乎无或完全没有串珠样改变。在理想条件下，培养物的存活率应接近制造商数据表中注明的存活率，且在硅胶基质上的培养物应与在传统刚性培养基上维持的培养物相似。

提高细胞密度会增加培养物中形成的细胞团块的数量和大小，而提高层粘连蛋白浓度通常可抵消这种效应。在受到57%峰值应变损伤的培养物中，损伤后4小时，神经突出现缩短或缺失，部分神经突出现串珠样改变，并通过残留的活细胞显示出聚集现象。值得注意的是，高剂量层粘连蛋白处理以浓度依赖的方式减轻了细胞培养物的损伤程度，这一点体现在高剂量层粘连蛋白处理组中神经突长度和细胞活力的增加。

在进行该操作时，需考虑准备时间。例如，膜去毒处理需要三天时间，制备好的培养板在使用前应静置过夜使其充分固化。请注意，损伤装置内部含有一个强效的音圈电机以驱动其运动，因此在装置运行时应始终保持安全距离，并且只有当载物台运动至行程顶端时，方可关闭设备电源。