绿松石鳉鱼的急性和慢性毒性测试协议Nothobranchius furzeri
2018年4月24日
在这项工作中, 我们描述了一种急性, 慢性和几代生物测定, 以研究单一和联合压力源对绿松石鳉鱼Nothobranchiusfurzeri 的影响。本协议旨在研究生命史特征 (死亡、生长、繁殖力、体重) 和临界热最大值。
本实验的总体目标是研究毒物对绿松石鱼 Nothobranchius furzeri 的影响。这种方法可以帮助回答生态毒理学领域的关键问题，例如压力源对重要生活史特征的长期影响，即成熟时间、生长或繁殖力。该实验的主要优点是我们使用的脊椎动物生命周期非常快，从而可以节省时间和成本地进行实验。
这些 killifish 是研究压力源的长期和多代影响影响的理想模型。最终，它们将有助于更好地了解有毒物质对环境的影响。虽然这种方法可以为毒物和温度的综合影响提供新的见解，但它也可以应用于其他压力源，例如紫外线辐射、食物剥夺和 PH 值改变。
Killifish 很难使用，因为它们是生态毒理学的新模型系统，而且因为它们对许多污染物的敏感性仍然未知。当我们第一次了解到基利鱼的寿命非常短，以及它们产生可以在货架上储存多年的休眠卵的能力时，我们就提出了这种实验方法的想法。这种方法的视觉演示至关重要，因为实验的类型以及个体的处理方式可能会改变结果。
首先，在 D3 阶段选择性腺鱼动物园或 GRZ 蛋，它们可以通过金色眼睛的存在来识别。并使用一把柔软的镊子轻轻地将它们转移到一个 2 升的塑料水箱中。在 12 摄氏度下加入 1 厘米的孵化介质，让水温逐渐调整到室温。
24 小时后，给幼鱼喂食浓缩剂量的新鲜孵化的卤虫无节幼体，并通过添加鱼培养基将水深增加到 5 厘米。孵化后 48 小时，将健康、有浮力的幼虫转移到具有暴露介质和有毒物质浓度的单个容器中，如文本方案中所述。每天早晚，检查鱼的死亡率、压力和疾病情况，并根据文本协议计算 LC50 值。
通过用正确的暴露介质填充单个容器来进行慢性暴露试验，并添加空气管为罐子充气。将鱼转移到罐子中，进行剩余的实验。从孵化后 2 到 23 天或 DPH，每天随意喂鱼卤虫无节幼体 2 次。
然后，在补充切碎的 chironomus 幼虫至 37 DPH 后，使用冷冻的 chironomus 幼虫随意喂鱼，每天两次，每天，向前发展。为了确定生长情况，每周测量一次体型，方法是将鱼转移到装满水库培养基的培养皿中。在固定高度拍摄四到五张经过大小校准的鱼背视图照片。
并使用空间测量程序对它们进行数字分析。从 15 DPH 开始，目视检查雄鱼的着色情况，以确定成熟度。检查鳍是否有婚礼着色的最初迹象，并使用可以看到拳头着色的日期作为雄性成熟时间的代表。
从 30 DPH 开始，在每次处理中为成熟的雄性和雌性夫妇设置一个 1 升的产卵池，使用雄性水族箱的暴露介质，并补充产卵基质，检查繁殖力。将雄性和雌性都转移到产卵池中。在尽量减少人类活动或对产卵容器的干扰的同时，让它们产卵两个小时。
之后，无需不必要的水混合，水会在产卵基质中旋转，轻轻地将鱼转移回原来的住房容器。通过将产卵基质倒在 500 微米的网孔上来过滤掉鸡蛋。数鸡蛋并使用移液管将它们转移到培养皿中的潮湿泥炭苔中。
每天清除死蛋。一周后，使用密封膜密封培养皿。并将其储存在 28 摄氏度的温控培养箱中，从 14 到 10 个明暗循环，以便立即发展到 D3 期。
为了长期保存，将种蛋储存在 17 摄氏度的持续黑暗中，此时种蛋进入休眠期，并保持活力多年。要从休眠的鱼卵中招募鱼，将鱼卵转移到 28 摄氏度，并进行 14 到 10 次从明到暗的循环，持续大约三周，让它们发育到 D3 期。要测量成年鱼的临界热最大值或 CT 最大值，请从连续循环的水浴开始，以每分钟 0.33 摄氏度的恒定速率加热。
为每条鱼添加几个 1 升的水瓶。当水达到鱼的实验饲养温度时，将鱼加入水族箱，开始尝试。使用数字温度计每 5 分钟监测一次 CT max 浴缸的 1 升水族箱中的温度。
当鱼无法保持背腹直立姿势或开始剧烈抽搐时，测量一升水族箱中的温度，这是临界最高温度。然后，将鱼转移回其实验外壳进行回收。如图所示，enfurzeri 急性暴露于不同浓度的铜，导致死亡率随着毒物浓度的增加而增加。
LC50 值随时间而降低，这意味着随着浓度的降低，50% 的重复样品死亡之前经过的时间更长。在慢性暴露测定中，使用水生铜，鱼的长度较短，当以测试的最高浓度饲养时，三周后测量。在这个使用水生毒死蜱或 CPH 的实验中，当在 28 摄氏度下饲养时，鱼在暴露于最高浓度的 CPF 时产生的卵较少，然而，在 30 摄氏度时，对照鱼比暴露于任一浓度的 CPF 的鱼产卵更多，这表明 CPF 和温度升高的组合对繁殖力的影响比每个应激源单独影响更大。
这里报告的是 enfurzeri 雄性在 28 和 30 摄氏度下暴露于 CPF 时出现最初着色迹象的平均年龄。在暴露于每升 4 微克 CPF 后，雄鱼的成熟时间比对照鱼长 18%。测量在 24 或 28 摄氏度下饲养的鱼的 CT 最大值，并暴露于污染物 3,4-DCA 表明，当鱼在 24 摄氏度下饲养时，在较低的温度下会出现不稳定的游泳、鳃盖运动增加和失去保持背腹直立位置的能力。
一旦掌握，该协议，包括对繁殖力的影响，可以在两个月内测量。为了测量对整个生殖期甚至下一代的影响，该方案可以延长，但仍然可以在六个月内进行。
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概述
本研究提出了一种生物测定法，用于调查压力因素对翡翠鱼（Nothobranchius furzeri）的影响。它专注于生命历史特征，如死亡率、生长和繁殖力，为生态毒理学提供了见解。
研究的主要组成部分
科学领域
- 生态毒理学
- 环境科学
- 鱼类生物学
背景
- 翡翠鱼的生命周期快速，使其适合研究压力因素的影响。
- 了解毒物的影响对评估环境风险至关重要。
- 本研究涉及急性和慢性压力因素的影响。
- 本研究还考虑了多代影响。
研究目的
- 评估毒物对生命历史特征的长期影响。
- 评估多重压力因素的综合影响。
- 增强对水生生物环境影响的理解。
使用的方法
- 对Nothobranchius furzeri进行急性和慢性生物测定。
- 评估死亡率、生长和繁殖力。
- 评估临界温度最大值。
- 应用该方法于各种压力因素，包括紫外线辐射和pH值变化。
主要结果
- 识别毒物对生长和繁殖的显著影响。
- 了解物种在压力下的适应能力。
- 支持使用翡翠鱼作为生态毒理学模型生物的数据。
- 证据表明压力因素的多代影响。
结论
- 该研究为生态毒理学研究提供了宝贵的框架。
- 结果有助于理解污染物的环境影响。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索其他压力因素。
常见问题
Executive Industry Relevance
The turquoise killifish model enables rapid assessment of toxicant effects on vertebrate life-history traits, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in environmental health research. Its short life cycle and dormant egg storage allow cost-efficient, scalable screening for predictive confidence in compound safety profiling. This approach aids portfolio triage by identifying biological risks associated with environmental exposures prior to downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying impacts on maturation, growth, and fecundity as functional readouts of physiological stress.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized measurement of mortality and sublethal endpoints across concentrations and time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt critical life-history processes, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing dose-response relationships for toxicant exposure.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined protocols for acute, chronic, and multigenerational testing.
- Scalability: Highlights screening readiness via dormant egg recruitment, eliminating need for continuous on-site culture and enabling platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through assessment of combined stressor effects, such as toxicants and temperature, on fecundity and maturation.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by measuring life-history traits predictive of population-level impacts.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by quantifying how stressors alter developmental timing and reproductive output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, vertebrate-based readouts of stressor impact on conserved biological processes.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through measurement of maturation time, growth, and fecundity as integrative biomarkers of physiological status.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs via LC50 determination, size calibration, and egg counting under controlled exposure conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including critical thermal maximum and coloration timing as proxies for physiological thresholds.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by linking life-history disruptions to population fitness and multi-generational outcomes.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through dormant egg banking and protocol adaptability across stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vertebrate stress response.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through defined exposure media, feeding regimens, and environmental controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying hazards early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative thresholds for mortality, growth inhibition, and fecundity reduction.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in vertebrate husbandry, ecotoxicology, and life-history trait measurement.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include temperature-controlled incubators, imaging systems for size calibration, and water baths for CT max assays.
- Cross-team standardization requirements for feeding schedules, exposure medium preparation, and blind scoring of maturation and fecundity endpoints.
- Adaptation considerations across model systems, including sensitivity to handling, water quality, and thermal history.
- Practical limitations supported by source material: challenges in working with a new model system, unknown sensitivity to many pollutants, and variability introduced by individual handling or environmental fluctuations.
