青鳉鱼 Nothobranchius furzeri 急性与慢性生态毒性测试方案

本实验的总体目标是研究有毒物质对青鳉鱼（Nothobranchius furzeri）的影响。该方法有助于回答生态毒理学领域中的一些关键问题，例如应激因子对重要生活史特征（如性成熟时间、生长或繁殖力）的长期影响。本实验的主要优势在于我们使用了一种生命周期极短的脊椎动物，从而实现了时间和成本效益高的实验。

这些鳉鱼是研究长期及多代应激因子影响的理想模型，最终将有助于更好地理解有毒物质对环境的影响。尽管该方法可为有毒物质与温度联合作用提供新的见解，也可应用于其他应激因子，如紫外线辐射、食物剥夺和pH值变化。

由于鳉鱼在生态毒理学中是一种较新的模式系统，且其对许多污染物的敏感性仍不明确，因此在实验操作中具有挑战性。当我们首次了解到鳉鱼具有极短的生命周期以及能够产生可长期在常温下保存的休眠卵时，便提出了这一实验方法的构想。由于实验类型以及个体操作方式均可能影响实验结果，因此对该方法进行可视化展示至关重要。

首先，选择处于 D3 阶段的 gona ray zoo（GRZ）卵，该阶段的卵可通过其具有金色眼睛的特征进行识别。使用柔软的镊子将其轻轻转移至一个两升的塑料水箱中。加入一厘米深、12 摄氏度的孵化培养基，并让水温逐渐调节至室温。

24小时后，给仔鱼喂食浓缩的新孵化卤虫无节幼体，并通过添加鱼培养液将水深增加至5厘米。孵化后48小时，将健康且具有浮力的幼体转移至含有暴露培养液和文中所述毒物浓度的单独容器中。每天早晨和傍晚检查鱼的死亡率、应激反应和疾病状况，并根据文中所述方案计算LC50值。

通过将正确的暴露介质加入各个容器中，并连接通气管对容器进行曝气，开展慢性暴露试验。将鱼类转移至容器中，继续完成后续实验。在孵化后2至23天（DPH），每天两次随意投喂丰年虾无节幼体。

此后，在补充投喂切碎的摇蚊幼虫至37日龄后，继续每天两次、持续投喂冷冻的摇蚊幼虫，任其自由摄食。为测定生长情况，每周定期测量鱼体体长：将鱼转移至含有储液槽培养基的培养皿中，从固定高度拍摄4到5张经体长校准的背部视角照片。

使用空间测量程序对它们进行数字分析。从第15天开始，目视检查雄性鱼的体色以确定其成熟情况。观察鱼鳍上是否出现婚色的最初迹象，并将首次观察到体色变化的日期作为雄性成熟时间的指标。

从30天后开始，通过为每种处理组中的性成熟雄性和雌性个体设置一个一升的产卵缸来检测繁殖力，使用来自雄性鱼缸的暴露介质，并添加产卵基质。将雄性和雌性均转移至产卵缸中。在尽量减少产卵容器周围人为活动或干扰的情况下，让其产卵两小时。

随后，在不必要搅动水体的情况下（以免将产卵基质中的卵搅起），轻柔地将鱼转移回其原始饲养容器中。将产卵基质倒在500 µm孔径的筛网上，滤出卵。计数卵的数量，并用移液器将其转移至培养皿中湿润的泥炭藓上。

每天移除死卵。一周后，用封口膜密封培养皿，并将其置于28摄氏度的控温培养箱中，在14小时光照与10小时黑暗的光周期条件下培养，以促进胚胎立即发育至D3阶段。

为长期保存，将卵置于17摄氏度的持续黑暗环境中，此时卵进入休眠阶段，可保持多年活力。为从休眠卵中孵化鱼类，将卵转移至28摄氏度、光暗周期为14小时光照与10小时黑暗的条件下，持续约三周，使其发育至D3阶段。为测定成年鱼的临界热最大值（CT max），首先使用持续循环的水浴装置，以每分钟0.33摄氏度的恒定速率加热水体。

为每条鱼准备多个一升容量的水族箱。当水温达到鱼类实验培育温度时，将鱼放入水族箱以开始实验。使用数字温度计每五分钟监测一次 CT max 浴中一升水族箱内的温度。

当鱼无法维持背腹直立姿势或开始剧烈抽搐时，测量一升水族箱中的温度，此温度即为临界最高温度。随后，将鱼转移回实验饲养环境中以恢复。如本图所示，enfurzeri 急性暴露于不同浓度的铜后，随着毒物浓度的增加，死亡率也随之上升。

LC50值随时间降低，这意味着在较低浓度下，需要更长时间才会导致50%的重复样本死亡。在慢性暴露实验中，使用水溶性铜处理时，鱼类在最高测试浓度下培养三周后体长较短。在本实验中，使用水溶性毒死蜱（CPH）处理，在28摄氏度下培养时，暴露于最高浓度CPF的鱼类产卵量减少；然而，在30摄氏度时，对照组鱼类的产卵量高于暴露于任一CPF浓度的鱼类，表明CPF与温度升高的联合作用对繁殖力的影响大于各单一胁迫因素单独作用。

本文报告了在28和30摄氏度下暴露于CPF的enfurzeri雄性个体首次出现体色变化的平均年龄。在暴露于每升4微克CPF后，雄性鱼类的成熟时间比对照组鱼类延长了18%。对在24或28摄氏度下培育的鱼类测量其临界热最大值（CT max），并暴露于污染物3,4-DCA，结果显示，在24摄氏度下培育的鱼类出现异常游动、鳃盖运动增加以及失去维持背腹直立姿势能力的温度更低。

一旦掌握，该实验方案（包括对繁殖力的影响）可在两个月内完成检测。若需评估对整个繁殖周期甚至下一代的影响，可延长实验周期，但仍可在六个月内完成。