使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

本项基于电穿孔的活体基因转移技术的主要目标是利用CRISPR介导的功能缺失分析，评估目的基因在小脑颗粒细胞分化过程中的作用。该方法有助于解答发育神经科学和神经肿瘤学领域中的关键问题，例如鉴定对正常小脑发育及脑肿瘤形成具有重要作用的分子。子宫内电穿孔操作将由彼得·利希特教授实验室的博士后研究员Lena Herbst博士演示，随后的免疫组织化学实验将由Di Haikun博士实验室的博士后研究员冯伟军博士完成。

该方法的主要优势在于，利用CRISPR-Cas9技术，可在小脑细胞中尽可能地实现目标基因的敲除，而无需构建多种基因敲除动物的组合。尽管该方法可用于研究基因在正常小脑发育过程中的功能，也可应用于其他系统，例如其他脑区的发育以及脑肿瘤建模。首先将一根硼硅酸盐玻璃毛细管装入微电极拉制仪中，拉制成细尖端。

用黑色墨水标记毛细管尖端，以便在注射过程中更清晰地观察，并在玻璃上绘制刻度。在体视显微镜下操作，使用直尺和尖头镊子将尖端修剪至约六毫米长，并制成锋利的单面斜面边缘。将1%快绿储备液通过0.22微米滤膜过滤，以去除溶液中的染料颗粒。

将单导向RNA质粒与荧光素酶报告质粒等量混合，使每种质粒的终浓度至少为每毫升一微克。用快绿染料对质粒溶液进行染色，快绿的终浓度为0.5%。使用异氟烷麻醉怀孕的CD-1小鼠后，将小鼠仰卧置于加热垫上，并给予镇痛剂。涂抹眼膏以防止手术期间眼睛干燥。

用胶带固定镜头，用消毒剂对腹部进行消毒。用纱布覆盖小鼠，仅暴露手术区域。在皮肤上做一个约两厘米长的切口后，找到白线，使用钝头组织剪在腹膜上做一个稍小的第二道切口。

用预热的无菌 PBS 润湿打开的腹腔。接着，使用环形镊子小心地将子宫角从腹腔中取出。在两个相邻胚胎的卵黄囊间隙处夹住子宫壁，并轻轻牵拉。

在将胚胎通过切口拉出时，避免对其施加任何压力。子宫角取出后，用准备好的玻璃毛细管吸取约10至15微升的有色质粒溶液。此过程中应避免产生任何气泡。

用环形镊子轻轻夹住胚胎，找到颈部区域。将玻璃毛细管的尖端缓慢刺入后脑背侧，进入第四脑室。注入约一微升的质粒混合液。

确认染色的 DNA 未从脑组织中泄漏，并呈现为菱形结构。在此过程中，最重要的是用质粒溶液充分填充第四脑室的整个区域，以确保 DNA 也能递送至小脑原基的远端部分。同时，务必避免操作过程中引起任何出血。

将带有直径为五毫米电极板的铂金镊子横向置于胚胎头部，负极覆盖耳部，正极置于子宫壁上方的小脑原基处，施加电方波脉冲。当所有胚胎完成电穿孔后，小心地将子宫角放回腹腔内，并用无菌 PBS 填充。让子宫角自然滑入其正常位置。

关闭麻醉，将动物腹部朝下放入新的笼子中恢复。在冷冻切片前，将小脑组织在每脑5毫升的4%PFA PBS溶液中，4摄氏度下固定过夜。第二天，将固定后的小脑组织转移至每脑10毫升的30%蔗糖PBS溶液中，4摄氏度下继续孵育过夜。

次日，待组织沉入管底后，将脑组织从蔗糖溶液中取出，并用一片纤维素滤纸吸去残留的蔗糖溶液。接着，将每个小脑浸入一次性塑料模具中的最佳切割温度包埋剂中，并在干冰上冷冻。使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚的切片，并将切片保存在-80 °C条件下，直至使用。

准备进行免疫染色时，首先将载玻片在室温下干燥30分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。用液体阻断笔在组织周围画圈，并在室温下用封闭液孵育组织1小时。在封闭液中加入针对目标分子的一抗，于4摄氏度孵育过夜。

用含0.1% Triton的PBS洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤三次。然后加入用封闭液稀释的含DAPI的荧光标记二抗，在室温避光条件下孵育一小时。用PBS-T洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤三次，随后封片，并于4摄氏度保存直至成像。

将表达化脓性链球菌Cas9的HEK293T细胞稳定转染表达并靶向GFP的sgRNA质粒。转染48小时后，使用荧光细胞成像仪监测活细胞中的GFP表达。该图像显示基于GFP表达水平受影响的sgRNA序列。

此图像显示了由于非有效sgRNA序列导致的GFP表达缺失。这些图像展示了在E13.5时期通过表达对照sgRNA的Cre质粒进行电穿孔处理的p7-rosa26-LSL-cas9基因敲入小鼠（带有floxed终止盒以及下游的双顺反子cas9和EGFP序列）的小脑组织中GFP、Ki67和p27的免疫染色结果。该切片经DAPI复染。

注意在外颗粒细胞层中由 Ki67 标记的表达 GFP 的细胞。掌握该手术后，每只小鼠的操作可在 30 分钟内完成。进行该操作时，需牢记要非常小心地处理胚胎，始终使用尖端锋利的毛细管，并将电极置于精确的角度，以确保电脉冲传递至第四脑室的顶壁。

该技术问世后，为医学领域研究人员探索神经系统疾病（包括小鼠小脑中的脑肿瘤）的致病因素铺平了道路。