CRISPR 介导的小脑颗粒细胞在宫内电穿孔基因转移中的功能分析损失
June 9th, 2018
传统的功能丧失基因的研究使用挖空动物往往是昂贵和耗时。基于电穿孔的 CRISPR 介导体细胞诱变是了解体内基因功能的有力工具。在这里, 我们报告了一个方法来分析的淘汰赛表型的小脑增殖细胞。
这种基于电穿孔的体内基因转移方法的总体目标是使用 CRISPR 介导的功能丧失分析来评估目标基因在小脑颗粒细胞分化中的作用。这种方法可以帮助回答发育神经科学和神经肿瘤学中的关键问题，例如用于识别对正常小脑发育和脑肿瘤形成很重要的分子。宫内电穿孔程序将由 Peter Lichter 教授实验室的博士后 Lena Herbst 博士演示，然后以下免疫组织化学将由 Haikun Di 博士实验室的博士后 Weijun Feng 博士进行。
这种方法的主要优点是努力使用 CRISPR-cas9 技术可行地敲除小脑细胞中的目标基因，而不是产生敲除动物的组合。虽然这种方法可以深入了解正常小脑发育过程中的基因功能，但它也可以应用于其他系统，例如其他物理脑区的发育和脑肿瘤建模。首先将硼硅酸盐玻璃毛细管装入微量移液器拉拔器中，然后拉动以形成细头。
用黑色墨水标记毛细管尖端，以便在注射过程中更好地观察，并在玻璃上画出刻度。在立体显微镜下工作，使用尺子和锋利的针镊将尖端修剪成约 6 毫米的长度，并形成锋利的单侧斜边。通过零点 22 微米过滤器过滤 1% fast green 储备液，以去除溶液中的染料颗粒。
将单向导 RNA 质粒与荧光素酶报告基因质粒等量混合，使每个质粒的最终浓度至少为 1 μg/mL。用终浓度为 0.5% 的固绿给质粒溶液着色用异氟醚麻醉怀孕的 CD-1 小鼠后，将小鼠仰卧在加热垫上，并给予镇痛药。涂抹眼药膏以防止手术过程中眼睛干涩。
用胶带固定镜片，并用消毒剂对腹部消毒。用纱布盖住鼠标，只露出手术区域。做一个约 2 厘米长的皮肤切口后，找到白线，用钝头组织剪刀在腹膜上做一个稍小的第二个切口。
用预热的无菌 PBS 润湿打开的腹腔。接下来，使用环形镊子小心地从腹腔中取出子宫角。抓住两个相邻胚胎的卵黄囊之间的间隙处的子宫壁，然后轻轻拉动。
在将胚胎拉过切口时，避免对胚胎施加任何压力。提取子宫角后，用准备好的玻璃毛细管吸出大约 10 至 15 微升的有色质粒溶液。在此过程中避免任何气泡。
用环形镊子轻轻握住胚胎并找到颈部区域。用玻璃毛细血管的尖端慢慢穿透背侧后脑，并进入第四脑室。注射约 1 微升质粒混合物。
确认染色的 DNA 没有从大脑中泄漏，并且显示为菱形结构。在这里，最重要的是用质粒溶液填充第四脑室的整个区域，以将 DNA 也递送到小脑原基的远端部分。同时，请确保在此过程中不要引起任何出血。
将配备 5 毫米直径电极板的铂镊子横向放在胚胎头部上方，负极覆盖耳朵，正极位于子宫壁上方的小脑原基处，并施加方形电脉冲。当所有胚胎都电穿孔后，小心地将子宫角放回腹腔，并填充无菌 PBS。让子宫角滑入自然位置。
关闭麻醉并将动物腹部朝下放入新笼子中恢复。冷冻切片前，在 4 摄氏度下，每个大脑用 5 毫升 4% PFA 的 PBS 溶液固定小脑过夜。第二天，将固定的小脑转移到每个大脑的 10 毫升 30% 蔗糖的 PBS 中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。
第二天，在组织沉到管底后，从蔗糖中取出大脑，并用一张纤维素滤纸吸收剩余的蔗糖溶液。接下来，将每个小脑浸入一次性塑料模具中的最佳切割温度化合物中，并在干冰上冷冻。使用低温恒温器将低温块切成 10 微米厚的切片，并将切片保持在零下 80 摄氏度直至使用。
准备进行免疫染色时，首先在室温下干燥玻片 30 分钟，然后在 PBS 中洗涤两次，每次 10 分钟。用液体封闭笔圈出切片，并在室温下将切片在封闭溶液中孵育 1 小时。在封闭溶液中加入针对目标分子的一抗，并在 4 摄氏度下孵育过夜。
用含 PBS 的 0.1% Triton 洗涤玻片 3 次，每次 10 分钟。然后加入在含有 DAPI 的封闭溶液中稀释的荧光团偶联二抗，并在室温下避光孵育切片 1 小时。在 PBS-T 中洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟，然后安装载玻片，并保持在 4 摄氏度直至成像。
用表达 sgRNA 和靶向质粒转染稳定表达化脓性链球菌 Cas9 的 hek293T 细胞。转染后 48 小时，使用荧光细胞成像仪监测活细胞中 GFP 的表达。该图显示了基于 GFP 表达的受影响的 sgRNA 序列。
该图像显示了由于无效的 sgRNA 序列而导致的 GFP 表达缺失。这些图像显示了 p7-rosa26-LSL-cas9 敲入小鼠小脑中 GFP、Ki67 和 p27 的免疫染色，该小鼠具有絮凝终止盒和下游双顺反子 cas9 和 EGFP 序列，该序列在 E13.5 处使用表达对照 sgRNA 的 Cre 质粒进行电穿孔。该切片用 DAPI 复染。
注意 Ki67 标记的外颗粒细胞层中表达 GFP 的细胞。一旦掌握，每只小鼠可以在不到 30 分钟的时间内完成这种手术。在尝试此程序时，重要的是要记住非常小心地处理胚胎，始终使用尖锐的毛细血管，并将电极放置在精确的角度，以确保将电脉冲传递到第四脑室的顶部。
发展后，这项技术为医学领域的研究人员探索神经系统疾病的致病因素铺平了道路，包括小鼠小脑中的脑肿瘤。
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概述
本文介绍了一种基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变方法，用于分析小脑颗粒细胞中的基因功能。该方法允许高效评估基因在正常小脑发育和脑瘤形成中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因功能分析
- 发育生物学
背景
- 传统的基因敲除研究通常成本高且耗时。
- CRISPR技术实现了靶向基因编辑。
- 小脑对运动控制和认知功能至关重要。
- 了解基因的作用可以阐明发育和病理过程。
研究目的
- 评估基因在小脑颗粒细胞分化中的功能。
- 识别对小脑发育重要的分子。
- 使用基因敲除技术模拟脑瘤的形成。
使用的方法
- 体内电穿孔用于基因转移。
- CRISPR-Cas9技术用于基因敲除。
- 免疫组织化学用于分析细胞变化。
- 多个研究实验室之间的合作。
主要结果
- 证明了在小脑细胞中敲除基因的可行性。
- 提供了关于小脑发育期间基因功能的见解。
- 显示了该方法在其他脑区和肿瘤模型中的潜在应用。
- 突出了该方法相对于传统敲除模型的优势。
结论
- 该方法提供了一种快速的体内研究基因功能的方法。
- 它可以显著推进发育神经科学的研究。
- 未来的应用可能扩展到各种神经系统疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
CRISPR-mediated somatic mutagenesis in cerebellar granule cells via in utero electroporation enables rapid, cost-effective functional interrogation of disease-relevant genes in neurodevelopmental and neuro-oncology research. This approach bypasses the time and resource constraints of germline models, supporting earlier target validation and mechanistic de-risking in the discovery pipeline. The method's quantitative phenotyping and chimeric modeling facilitate predictive confidence for portfolio triage and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct loss-of-function analysis of candidate genes implicated in brain malformations and tumors.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene function in disease-relevant neural cell populations.
- Facilitates rapid hypothesis testing without the need for full germline knockout model generation.
- Provides functional validation of genetic findings from patient-derived tissue sequencing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chimeric brain tissue systems for downstream phenotypic screening and quantitative analysis.
- Delivers reproducible, GFP-labeled cell populations for standardized imaging and immunohistochemistry workflows.
- Enables scalable assessment of multiple sgRNA constructs for gene targeting efficiency.
- Supports robust comparison of gene knockout versus control conditions in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant somatic mutation modeling for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from genetic discovery to preclinical validation in neurodevelopmental and tumor contexts.
- Reduces late-stage biological risk by enabling early functional assessment of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging genetic target identification with in vivo functional validation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for candidate neurodevelopmental genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene knockout effects using immunohistochemistry and GFP-based readouts.
- Translational Research: Facilitates modeling of somatic mutations relevant to human brain disorders and tumors.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function interrogation across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurobiological pathways.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and supports scalable gene function studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental and neuro-oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero electroporation and CRISPR-Cas9 gene editing techniques.
- Demands access to specialized surgical, imaging, and molecular biology infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of plasmid design, delivery, and phenotypic analysis protocols.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require protocol optimization.
- Practical limitations include surgical skill requirements and potential variability in electroporation efficiency.
