Name: CRISPR 介导的小脑颗粒细胞在宫内电穿孔基因转移中的功能分析损失 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解基于电穿孔的CRISPR体内基因转移技术，用于分析小脑颗粒细胞分化中的基因功能。该方法结合宫内电穿孔和免疫组织化学，为发育神经科学和脑肿瘤研究提供快速高效的基因功能研究手段。

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感谢 Laura Sieber、Anna Neuerburg、Yassin Harim 和 Petra Schroeter 在技术方面的协助。同时感谢 K. Reifenberg 博士、K. Dell 博士和 P. Prückl&#160;在 DKFZ 动物实验中提供的有益帮助；感谢 DKFZ 成像核心设施以及 DKFZ 内卡尔蔡司成像中心提供的共聚焦显微成像支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，项目编号 KA 4472/1-1（资助对象：D.K.）。

所有动物实验均按照动物福利法规进行，并已获得主管部门（卡尔斯鲁厄政府，批准编号：G90/13、G176/13、G32/14、G48/14 和 G133/14）的批准。
1. 构建 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 质粒
<ol>
	<li>根据先前发表的方案设计靶向目标基因的sgRNA14. 
	注意：本实验中设计了两种sgRNA以靶向小鼠 Top2b 基因和非靶向对照sgRNA（表1）。为了利用CRISPR技术敲除基因，需要设计靶向基因编码序列5'区域或蛋白质关键功能结构域的sgRNA。一个便捷的起点是测试公开可用的预设计sgRNA序列，例如GeCKO v2小鼠基因敲除文库15 来自张实验室。或者，可使用公开可用的软件设计sgRNA，例如以下网站：crispr.mit.edu。</li>
	<li>将sgRNA克隆至pU6-sgRNA-Cbh-Cre载体中。 
	注意：pU6-sgRNA-Cbh-Cre 载体12 本研究中使用的质粒源自原始的 pX330 质粒16 通过将 SpCas9 的编码序列替换为 Cre 重组酶
	<ol>
		<li>合成两条DNA寡核苷酸，序列如下： 
正义链：5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'； 
反义链：3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'。 
		注意：上述 20 个 N 代表 sgRNA 序列。</li>
		<li>用以下试剂在37 °C下用BbsI酶切pU6-sgRNA-Cbh-Cre 30分钟，将酶切产物上样至1%琼脂糖凝胶，使用凝胶回收试剂盒进行纯化。使用3 µg质粒；3 µL BbsI；1 µL FastAP；5 µL 10X 消化缓冲液；加入 ddH₂O 至终体积2O，使总体积达到50 µL。</li>
		<li>使用以下试剂（总体积10 µL）对每对sgRNA寡核苷酸进行磷酸化和退火：1 µL定制的正义寡核苷酸（100 mM）；1 µL定制的反义寡核苷酸（100 mM）；1 µL 10X T4连接酶缓冲液；6.5 µL ddH₂O2O；0.5 µL T4 PNK。在热循环仪中37 °C孵育30分钟，95 °C孵育5分钟，然后以5 °C/min的速率降温至25 °C。</li>
		<li>设置以下连接反应，室温孵育10分钟（总体积10 µL）：X µL Bbs我将质粒（50 ng）、1 µL 磷酸化并退火的寡核苷酸双链（1:200 稀释）、5 µL 2X 连接缓冲液和 X µL ddH₂O 混合进行连接反应。2O；1 µL 快速连接酶。</li>
		<li>将 2 µL 连接产物加入 50 µL 感受态 DH5α 菌中 大肠杆菌 细胞。冰上孵育30分钟后，在42 °C热激90秒，再于冰上孵育2分钟。加入100 µL LB培养基，涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB平板上。 
		注意：将sgRNA序列整合到pU6-sgRNA-Cbh-Cre质粒中的操作需参照pX330质粒的克隆步骤进行14.</li>
		<li>接种两个菌落，分别置于2 mL LB培养基中，在37 °C下培养至少6 h，然后使用试剂盒进行质粒小提DNA提取。</li>
		<li>使用hU6-Forward引物对质粒小提DNA进行Sanger测序，并通过与步骤1.2.1中所示序列比对，鉴定含有正确插入sgRNA的菌落。引物序列如下所示 表1本研究中使用的质粒命名为 pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre、pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre 和 pU6-sgControl-Cbh-Cre。</li>
		<li>接种正确鉴定的菌落，并纯化无内毒素质粒DNA 在子宫内 使用试剂盒进行电穿孔 例如，购自Qiagen。使用ddH₂O稀释的无内毒素TE缓冲液洗脱DNA2O 在 1:10（10% TE 缓冲液）条件下。质粒的 DNA 浓度需高于 2 mg/mL。 
		注意：请勿使用常规的大型质粒提取试剂盒进行DNA制备。质粒溶液若需短期常规使用（不超过4周），可保存于4 °C；如需长期保存，应分装成约25 µL的体积，置于-20 °C储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 EGxxFP 质粒系统检测 sgRNA 的效率
注意：通常使用Surveyor或T7E1（T7内切酶I）检测sgRNA的编辑效率。本方案中采用了一种简便且高效的替代方法。该方法的关键在于使用pCAG-EGxxFP质粒，该质粒包含被一段含有sgRNA靶向位点的DNA序列分隔开的重叠EGFP片段17。当pCAG-EGxxFP质粒与sgRNA及Cas9共同在转染细胞中表达时，Cas9在靶序列处诱导产生双链断裂（DSB），该断裂通过细胞内源性的同源依赖性修复机制进行修复，从而重建EGFP表达盒。
<ol>
	<li>设计引物以扩增以sgRNA靶向序列为中心的基因组区域。PCR扩增子长度约为500 bp。在本实验中，采用DNA组装方法将PCR扩增片段克隆至pCAG-EGxxFP质粒中。 
	注意：也可在PCR引物的5'端添加适当的限制性酶切位点。pCAG-EGxxFP载体中可用的限制性酶切位点包括BamHI、NheI、PstI、SalI、EcoRI和EcoRV。</li>
	<li>使用以下体系和PCR参数，以设计的引物扩增基因组DNA。将样品（19.7 µL H2O；0.3 µL 10 ng/µL小鼠基因组DNA；2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F；2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R；25 µL 2X PCR预混液；总体积50 µL）上样至1%琼脂糖凝胶，并使用凝胶回收试剂盒对PCR片段进行凝胶纯化。采用以下反应条件：95 °C 3 min；然后进行35个循环：98 °C 20 s，60 °C 15 s，72 °C 20 s，最后72 °C延伸1 min；4 °C保存。 
	注意：在本实验中，扩增了Top2b基因第一外显子中的一个区域；引物序列见表1。</li>
	<li>使用限制性内切酶BamHI和EcoRI在37 °C下对pCAG-EGxxFP载体消化2 h，随后将样品上样至1%琼脂糖凝胶，并使用凝胶回收试剂盒对载体骨架进行凝胶纯化。使用以下试剂（总体积50 µL）：X µL质粒（3 µg）；2 µL BamHI；2 µL EcoRI；5 µL 10X缓冲液；X µL ddH2O。</li>
	<li>根据制造商说明书设置DNA组装反应18，并转化至DH5α感受态E. coli中。</li>
	<li>挑取两个单菌落，分别接种于2 mL LB培养基中，在37 °C下培养至少6 h，使用试剂盒进行质粒小提（例如，Qiagen试剂盒），并通过Sanger测序（使用EGxxFP-Top2b-F引物）鉴定含有正确插入片段的菌落（此后称为pCAG-EG-Top2b-FP）。</li>
	<li>转染HEK293T细胞。
	<ol>
		<li>转染前24 h，将HEK293T细胞接种至24孔板中。 
		注意：细胞在含10% FBS和1%青霉素/链霉素、并补充谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。确保转染当天细胞融合度达到60%。在本实验中，我们使用了自行构建的稳定表达SpCas9的HEK293T细胞来测试pU6-sgRNA-Cbh-Cre。然而，若同时提供SpCas9表达载体，也可使用野生型HEK293T细胞。</li>
		<li>使用聚乙烯亚胺（PEI）试剂转染HEK293T细胞。在24孔板中，每孔转染120 ng pCAG-EG-Top2b-FP质粒12和120 ng pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre或pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre质粒。将质粒DNA与1.8 µL PEI试剂加入80 µL含谷氨酰胺但无其他添加剂的DMEM培养基中，涡旋混匀后室温孵育15 min。</li>
		<li>转染6 h后，吸除培养基并更换为新鲜培养基。</li>
		<li>转染48 h后，使用荧光显微镜在20倍放大下观察GFP+活细胞的存在情况。 
		注意：GFP+细胞数量反映sgRNA的靶向效率。有效与无效sgRNA（分别为sgTop2b-1和sgTop2b-2）的结果见图2A。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 执行 子宫内 电穿孔
<ol>
	<li>繁殖6至8周龄的小鼠并准备相关工具 在子宫内 电穿孔。将雄性纯合子杂交 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 将小鼠与雌性CD-1小鼠交配。以检测到阴道栓的当天记为CD-1小鼠妊娠的E0.5天。胚胎在E13.5天进行电穿孔。
	<ol>
		<li>使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.6–0.8 mm）拉制成微电极。拉制参数设置如下：P = 500，Heat = 560，Pull = 150，Vel = 75，Time = 250。用黑色墨水标记毛细管尖端，以便注射时更清晰地观察。在体视显微镜下，使用直尺和尖头镊子修剪毛细管锥形部分，将尖端修剪至长约6 mm。</li>
		<li>保持毛细管的完整性，以确保实验的可重复性。修整时应制成单侧斜面边缘，尖端应尽可能锋利，以便于穿透子宫壁并避免对胚胎组织造成损伤。 
		注意：也可使用微型研磨器将角度调整为35°19毛细管可在无病原条件下，于10 cm培养皿中室温保存。</li>
		<li>对手术器械进行高压灭菌。</li>
		<li>将sgRNA质粒与pT2K-IRES-Luc等体积混合，使每种质粒的终浓度至少为1 µg/µL，并加入快绿染料（终浓度0.05%）对质粒溶液进行染色。使用无内毒素的去离子水配制1%快绿储存液，经0.22 µm滤膜过滤，以去除溶液中的染料颗粒。 
		注意：共转染 pT2K IRES-Luc 为可选步骤，但可通过生物发光成像在出生后识别成功电穿孔的存活动物。详见步骤 3.5。根据拟手术的妊娠小鼠总数，准备足量的质粒混合物，每只小鼠使用约 15–20 µL 混合液（约对应 12 个胚胎）。配制完成后立即进行手术操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备小鼠以进行手术。
	<ol>
		<li>用异氟烷麻醉怀孕的CD-1小鼠。在诱导箱中使用3-4 vol-%异氟烷（氧气流速：1.5 L/min）诱导麻醉，并通过鼻罩在手术期间以2 vol-%异氟烷维持麻醉。 
		注意：完整的手术操作不应超过30分钟。如有必要，减少注射和电穿孔的胚胎数量。&#160;手术时使用无菌手套。</li>
		<li>将小鼠仰卧于加热垫上，并调整麻醉状态。</li>
		<li>注射镇痛剂（安乃近，800 mg/kg 体重，皮下注射（s.c.），24 小时缓释）。 
		注意：可使用其他经批准的镇痛药替代安乃近。</li>
		<li>手术期间涂抹眼膏以防止眼睛干涩。</li>
		<li>用胶带固定四肢，并用消毒剂对腹部进行消毒。用纱布覆盖小鼠，仅暴露手术区域。在手术区域及纱布上涂抹70%乙醇。</li>
		<li>做一个长约2 cm的皮肤切口，用直手术剪刀轻轻扩大切口。找到白线，使用钝头组织剪刀穿过腹膜做第二个稍小的切口。</li>
		<li>用预热的无菌1×PBS润湿打开的腹腔。</li>
		<li>使用环形镊子小心地从腹腔中取出子宫角。仅在两个相邻胚胎的卵黄囊之间的间隙处夹住子宫壁，轻柔牵拉。牵拉过程中避免对胚胎施加任何压力。必要时可扩大切口，并格外注意将子宫角放置于腹部时不要压迫子宫动脉的血流。 
		注意：在某些情况下，建议一次只取出一个子宫角，在处理第二个子宫角之前将其复位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒DNA的注射与电穿孔
	<ol>
		<li>用制备好的玻璃毛细管吸取约15 µL有色质粒溶液。此过程中应避免产生气泡。 
		注意：如果质粒溶液浓度过高，容易堵塞移液尖端。在注射前，先释放少量DNA以测试毛细管是否通畅。</li>
		<li>用环形镊子轻轻夹住胚胎，找到颈部区域。 
		注意：如果胚胎位置难以注射，可跳过该胚胎并选择下一个。频繁调整胚胎位置可能会增加对胚胎造成损伤的风险。</li>
		<li>用预先制备的玻璃毛细管尖端缓慢刺入第四脑室，穿透背侧后脑，随后注入约1 µL质粒混合物。确认染色的DNA未从脑组织泄漏，并可见呈菱形结构的染色区域。 
		注意：可选择使用2.5倍放大眼镜，以更清晰地观察第四脑室及周围血管。注射后应立即施加电脉冲，以防止质粒溶液扩散至其他脑室。</li>
		<li>施加电方波脉冲（5次脉冲，32 mV，开启50 ms，关闭950 ms），使用镊子状铂金镊子（参见 材料表）。将电极置于侧方，负极覆盖耳部，正极置于子宫壁上方的小脑原基处。使用直径为5 mm的电极板，以实现对E13.5胚胎的有效电穿孔。 
		注意：操作少于三分之二的幼崽以提高其存活率rd 每只母鼠的胚胎总数。避免选择过于靠近宫颈的胚胎，若对其进行操作，可能在分娩时引发并发症，并危及整窝幼仔。若电极过于靠近胚胎心脏，可能导致心脏骤停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔后与术后护理
	<ol>
		<li>将子宫角小心放回腹腔内，并用预热的无菌1×PBS填充。让子宫角自然滑入其正常位置。</li>
		<li>分别用连续单纯缝合法缝合腹膜和皮肤。 
		注意：缝合腹膜时需格外小心，避免穿透子宫壁。</li>
		<li>关闭麻醉装置，将动物腹部朝下放入新的笼子中。</li>
		<li>在动物苏醒期间进行观察，并在手术后24小时再次观察。如果动物在15分钟内颤抖未见改善且未开始理毛，应将笼子置于加热灯下。</li>
		<li>通过荧光素酶成像确认电穿孔成功。
		<ol>
			<li>确保手术处理的母鼠在规定时间（E19.5）产下胚胎。 
			注意：由于手术原因，出生日期可能会推迟至第二天。</li>
			<li>用2.5%异氟烷麻醉电穿孔后的幼鼠（P5-P7），并在成像前5分钟腹腔注射D-荧光素钠（3 mg/kg体重）。</li>
			<li>使用生物发光成像仪检测电穿孔幼鼠中的荧光素酶信号。 
			注意：1 分钟的曝光时间足以检测到荧光素酶信号。光通量（p/s/cm2/sr）约为 &#62;1 × 106.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 制备电穿孔小脑的冷冻切片
<ol>
	<li>处死电穿孔后的P7幼鼠，取出小脑。 
	注：可使用落射荧光体视显微镜观察GFP信号。</li>
	<li>将小脑在4 °C条件下，用每脑5 mL的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）固定过夜。</li>
	<li>将固定后的小脑在4 °C条件下，转移至每脑10 mL的30%蔗糖PBS溶液中，浸泡过夜。 
	注：组织在蔗糖溶液中孵育后应沉降至15 mL离心管底部。</li>
	<li>用一片纤维素滤纸吸去残留蔗糖溶液后，将小脑浸入一次性塑料模具中的最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在干冰上冷冻。冷冻组织块可于-80 °C保存至后续使用。 
	注：此步骤可作为暂停点。</li>
	<li>使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚的切片，并将切片保存于-80 °C备用。 
	注：在用PBS洗去OCT包埋剂后，可确认切片中的GFP表达情况。</li>
</ol>
5. 冷冻切片的免疫染色
<ol>
	<li>将载玻片在室温下干燥30分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。</li>
	<li>用液体阻断笔圈出组织区域，并在封闭液（含0.1% Triton-X100的PBS中加入10%正常驴血清）中室温孵育1小时。</li>
	<li>加入针对目标分子的一抗（例如，在封闭液中加入GFP和拓扑异构酶IIβ（Top2B），4 °C下孵育过夜。 
	注意：所用抗体的名称和浓度列于下表中 材料表为了增强GFP信号，可选择性地将抗GFP抗体与其他抗体一同使用。</li>
	<li>用含0.1% Triton的PBST洗涤载玻片3次，每次10分钟。将切片在含DAPI的封闭液中，于室温下与荧光标记的二抗孵育1小时。</li>
	<li>用 PBS 清洗载玻片 3 次，每次 10 分钟。封片后于 4 °C 保存，直至成像。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
6. 成像与分析
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜以 20 倍放大倍数对切片进行成像。</li>
	<li>计数失去目标蛋白表达的 GFP 阳性细胞数量。代表性图像见图 2B。</li>
	<li>通过免疫染色检测目标基因在颗粒神经前体细胞（GNPs）及其子代细胞中缺失后的分子表型12。</li>
</ol>

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<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用 子宫外 电穿孔，我们先前已报道基于siRNA的 体内 小脑颗粒细胞分化早期阶段 Atoh1 的功能分析8由于siRNA的稀释/降解以及胚胎在子宫外暴露，对电穿孔颗粒细胞的表型分析仅限于胚胎阶段。然而，当前方法实现了对出生后动物表型的分析。
我们之前的研究表明，Cas9介导的肿瘤抑制基因敲除 Ptch1 通过 在子宫内 电穿孔成功诱导了髓母细胞瘤2相比之下，当前方法具有两个主要优势：1）Cas9 无需与质粒共同递送，而是通过单个质粒携带多个sgRNA表达盒即可实现多基因靶向；2）靶细胞及其子代细胞可被GFP永久标记，从而实现对活细胞的可视化以及对转化肿瘤细胞行为的分析 体内.
该方案最关键的步骤是将质粒DNA准确地注射到正确位置，以及将电脉冲递送至大脑的适当区域。小脑神经元以出生时间依赖的方式，依次来源于小脑神经上皮。由于电穿孔技术仅在E1...

脑部疾病是最令人畏惧的致命疾病之一，通常由基因突变及其后续的调控失调引起。为了理解脑部疾病的分子机制，研究人员持续不断地对人类患者的基因组进行解析，已鉴定出多个潜在的致病基因。迄今为止，已利用生殖系基因工程动物模型开展相关研究 体内 功能获得（GOF）和功能缺失（LOF）分析是针对此类候选基因的常用方法。随着功能验证研究的快速发展，一种更为可行且灵活的 体内 用于研究基因功能的基因检测系统是可取的。
应用一个 体内 基于电穿孔的基因转移系统适用于发育中小鼠大脑的这一目的。事实上，已有多个研究采用了这种方法 在子宫内 电穿孔已显示出在发育中的大脑中进行功能分析的潜力1,2,3实际上，小鼠大脑的多个区域，例如大脑皮层4，视网膜5间脑6, 后脑7小脑8和脊髓9 迄今为止，已通过体细胞基因递送方法靶向了这些目标。
事实上，通过瞬时基因表达 体内 电穿孔技术长期被用于小鼠胚胎脑组织的基因功能获得（GOF）分析。近年来，基于转座子的基因组整合技术进一步实现了目的基因的长期和/或条件性表达。10,11，这有利于在发育过程中以时空特异性的方式解析基因功能。与功能获得（GOF）分析相比，功能缺失（LOF）分析更具挑战性。尽管已采用小干扰RNA（siRNA）和携带短发夹RNA（shRNA）质粒的瞬时转染方法，但由于外源引入的核酸（如质粒和双链RNA）最终会降解，基因LOF的长期效应难以保证。然而，CRISPR/Cas技术为LOF分析带来了突破性进展。编码荧光蛋白的基因（例如，GFP）或生物发光蛋白（例如，萤火虫荧光素酶）已与CRISPR-Cas9和sgRNA共转染，用于标记经历CRISPR-Cas9介导的体细胞突变的细胞。然而，该方法在增殖细胞的功能研究中可能存在局限性，因为外源性标记基因在长期增殖后会被稀释并降解。尽管转染细胞及其子代细胞的基因组发生了CRISPR诱导的突变，但其标记痕迹可能随时间而丢失。因此，遗传标记方法将适用于克服这一问题。
我们最近开发了一种基于CRISPR的脑颗粒细胞功能缺失研究方法，该细胞在分化过程中经历长期增殖12为了对转染细胞进行遗传标记，我们构建了一个质粒，该质粒携带一条sgRNA以及 Cre 并将质粒导入 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 小鼠的小脑中13 使用 在子宫内 电穿孔。与编码EGFP的常规质粒载体不同，该方法成功标记了转染的颗粒神经元前体细胞（GNPs）及其子代细胞。该技术为理解 体内 在正常脑发育及易发肿瘤背景下，研究目的基因在增殖细胞中的功能。

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 山羊抗鸡</td><td>ThermoFisher</td><td>A11039</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Alexa 568 驴抗小鼠</td><td>Life Technologies</td><td>A-10037</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Alexa 594 驴抗兔</td><td>ThermoFisher</td><td>A21207</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Alexa 647 驴抗兔</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶（FastAP）</td><td>ThermoFisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌指示带</td><td>Kisker Biotech</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>纤维素滤纸（Whatman）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>布巾</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>biovision</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>一次性塑料模具（Tissue-Tek Cyromold）</td><td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>31966047</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪（Electro Square Porator）</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素质粒大提试剂盒（Endofree Maxi Kit）</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏（Bepanthen）</td><td>Bayer</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料（Fast Green）</td><td>Merck</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>滤膜（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Merck</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>荧光细胞成像仪（ZOE）</td><td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>纱布（X100 ES-pads 8f 10 × 10 cm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>吉布森组装预混液（Gibson Assembly Master Mix）</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>带纤维的玻璃毛细管</td><td>Narishige</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件（ImageJ 和 Fiji）</td><td>NIH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器（B. Braun OMNICAN U-100）</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina LT Series III Caliper</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>Kalt 缝合针</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART READY mix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>光导指针</td><td>Photonic</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Kisker Biotech</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>安乃近</td><td>WDT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微电极研磨仪</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>显微镜软件 ZEN</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>非无菌丝线缝合线（0.12 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂（Tissue-Tek）</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>p27 抗体</td><td>BD bioscience</td><td>610241</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Roth</td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>pX330 质粒</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>快速连接试剂盒（Quick Ligation Kit）</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>环形止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（SuperFrost）</td><td>ThermoFisher</td><td>10417002</td><td></td></tr><tr><td>生物统计学软件（Prism 7）</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Spitacid</td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>钝头手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（Supramid 黑色 DS 16, 1.5 (4/0)）</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>钝头组织剪刀（11.5 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>TOP2B 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13059</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5 %）</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>带5mm &amp;Oslash; 圆盘电极的镊子，铂金材质</td><td>Xceltis GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>Dr&amp;auml;gerwerk AG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table>

使用crispr介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

脑部畸形通常由基因突变引起。解析患者来源组织中的突变已帮助识别出多种潜在致病因素。为了验证突变基因功能障碍对疾病发展的贡献，构建携带这些突变的动物模型是一种显而易见的方法。尽管生殖系基因工程小鼠模型（GEMMs）是常用的生物学工具且具有可重复的结果，但其应用受限于时间和成本。相比之下，非生殖系GEMMs通常能以更可行的方式探索基因功能。由于某些脑部疾病（例如，脑肿瘤）似乎由体细胞突变而非种系突变引起，因此正常细胞与异常细胞共存的非种系嵌合小鼠模型可能有助于开展与疾病相关的分析。在本研究中，我们报道了一种在小脑中诱导CRISPR介导的体细胞突变的方法。具体而言，我们使用了条件性基因敲入小鼠，其中 Cas9 和 GFP 处于慢性激活状态 CAG （CMV增强子/鸡ß-actin）启动子之后 Cre介导的基因组重组。将自设计的单导向RNA（sgRNAs）和Cre重组酶序列共同构建于同一质粒中，在胚胎期通过 在子宫内 电穿孔。因此，转染的细胞及其子代细胞均被绿色荧光蛋白（GFP）标记，从而便于进一步的表型分析。该方法不仅展示了基于电穿孔的基因递送技术在胚胎小脑细胞中的应用，还提出了一种评估CRISPR介导的功能缺失表型的新型定量方法。

对于 体内 功能分析中，关键是要鉴定出外源基因已导入的细胞。虽然在非增殖细胞中，标记物（如GFP）的表达可长期追踪，但在增殖细胞中，其信号会随着细胞分裂逐渐丢失。这一效应的示例如下所示： 图1为避免在功能缺失（LOF）分析中丢失转染细胞的痕迹，我们开发了一种新方法，将基于电穿孔的基因递送技术与CRISPR/Cas9技术相结合。
代表性结果如图2所示。通过将携带sgTop2b靶序列的质粒pU6-sgTop2b-Cbh-Cre和pCAG-EG-Top2b-FP17瞬时转染至稳定表达SpCas9的HEK293T细胞中，检测质粒构建物的功能（图2A）。由sgRNA引导的Cas9核酸酶活性可诱导EGFP表达盒发生双链断裂...

传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。 体内在此，我们报告一种用于分析小脑增殖细胞中基因敲除表型的方法。

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

脑部畸形通常由基因突变引起。解析患者来源组织中的突变已鉴定出潜在的致病因素……

本项基于电穿孔的活体基因转移技术的主要目标是利用CRISPR介导的功能缺失分析，评估目的基因在小脑颗粒细胞分化过程中的作用。该方法有助于解答发育神经科学和神经肿瘤学领域中的关键问题，例如鉴定对正常小脑发育及脑肿瘤形成具有重要作用的分子。子宫内电穿孔操作将由彼得·利希特教授实验室的博士后研究员Lena Herbst博士演示，随后的免疫组织化学实验将由Di Haikun博士实验室的博士后研究员冯伟军博士完成。该方法的主要优势在于，利用CRISPR-Cas9技术，可在小脑细胞中尽可能地实现目标基因的敲除，而无需构建多种基因敲除动物的组合。尽管该方法可用于研究基因在正常小脑发育过程中的功能，也可应用于其他系统，例如其他脑区的发育以及脑肿瘤建模。首先将一根硼硅酸盐玻璃毛细管装入微电极拉制仪中，拉制成细尖端。用黑色墨水标记毛细管尖端，以便在注射过程中更清晰地观察，并在玻璃上绘制刻度。在体视显微镜下操作，使用直尺和尖头镊子将尖端修剪至约六毫米长，并制成锋利的单面斜面边缘。将1%快绿储备液通过0.22微米滤膜过滤，以去除溶液中的染料颗粒。将单导向RNA质粒与荧光素酶报告质粒等量混合，使每种质粒的终浓度至少为每毫升一微克。用快绿染料对质粒溶液进行染色，快绿的终浓度为0.5%。使用异氟烷麻醉怀孕的CD-1小鼠后，将小鼠仰卧置于加热垫上，并给予镇痛剂。涂抹眼膏以防止手术期间眼睛干燥。用胶带固定镜头，用消毒剂对腹部进行消毒。用纱布覆盖小鼠，仅暴露手术区域。在皮肤上做一个约两厘米长的切口后，找到白线，使用钝头组织剪在腹膜上做一个稍小的第二道切口。用预热的无菌 PBS 润湿打开的腹腔。接着，使用环形镊子小心地将子宫角从腹腔中取出。在两个相邻胚胎的卵黄囊间隙处夹住子宫壁，并轻轻牵拉。在将胚胎通过切口拉出时，避免对其施加任何压力。子宫角取出后，用准备好的玻璃毛细管吸取约10至15微升的有色质粒溶液。此过程中应避免产生任何气泡。用环形镊子轻轻夹住胚胎，找到颈部区域。将玻璃毛细管的尖端缓慢刺入后脑背侧，进入第四脑室。注入约一微升的质粒混合液。确认染色的 DNA 未从脑组织中泄漏，并呈现为菱形结构。在此过程中，最重要的是用质粒溶液充分填充第四脑室的整个区域，以确保 DNA 也能递送至小脑原基的远端部分。同时，务必避免操作过程中引起任何出血。将带有直径为五毫米电极板的铂金镊子横向置于胚胎头部，负极覆盖耳部，正极置于子宫壁上方的小脑原基处，施加电方波脉冲。当所有胚胎完成电穿孔后，小心地将子宫角放回腹腔内，并用无菌 PBS 填充。让子宫角自然滑入其正常位置。关闭麻醉，将动物腹部朝下放入新的笼子中恢复。在冷冻切片前，将小脑组织在每脑5毫升的4%PFA PBS溶液中，4摄氏度下固定过夜。第二天，将固定后的小脑组织转移至每脑10毫升的30%蔗糖PBS溶液中，4摄氏度下继续孵育过夜。次日，待组织沉入管底后，将脑组织从蔗糖溶液中取出，并用一片纤维素滤纸吸去残留的蔗糖溶液。接着，将每个小脑浸入一次性塑料模具中的最佳切割温度包埋剂中，并在干冰上冷冻。使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚的切片，并将切片保存在-80 °C条件下，直至使用。准备进行免疫染色时，首先将载玻片在室温下干燥30分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。用液体阻断笔在组织周围画圈，并在室温下用封闭液孵育组织1小时。在封闭液中加入针对目标分子的一抗，于4摄氏度孵育过夜。用含0.1% Triton的PBS洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤三次。然后加入用封闭液稀释的含DAPI的荧光标记二抗，在室温避光条件下孵育一小时。用PBS-T洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤三次，随后封片，并于4摄氏度保存直至成像。将表达化脓性链球菌Cas9的HEK293T细胞稳定转染表达并靶向GFP的sgRNA质粒。转染48小时后，使用荧光细胞成像仪监测活细胞中的GFP表达。该图像显示基于GFP表达水平受影响的sgRNA序列。此图像显示了由于非有效sgRNA序列导致的GFP表达缺失。这些图像展示了在E13.5时期通过表达对照sgRNA的Cre质粒进行电穿孔处理的p7-rosa26-LSL-cas9基因敲入小鼠（带有floxed终止盒以及下游的双顺反子cas9和EGFP序列）的小脑组织中GFP、Ki67和p27的免疫染色结果。该切片经DAPI复染。注意在外颗粒细胞层中由 Ki67 标记的表达 GFP 的细胞。掌握该手术后，每只小鼠的操作可在 30 分钟内完成。进行该操作时，需牢记要非常小心地处理胚胎，始终使用尖端锋利的毛细管，并将电极置于精确的角度，以确保电脉冲传递至第四脑室的顶壁。该技术问世后，为医学领域研究人员探索神经系统疾病（包括小鼠小脑中的脑肿瘤）的致病因素铺平了道路。

crispr-mediated-loss-function-analysis-cerebellar-granule-cells-using

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

CRISPR 介导的小脑颗粒细胞在宫内电穿孔基因转移中的功能分析损失

在子宫内 电穿孔是一种用于转染神经前体细胞的有效方法 体内根据电极的位置和电穿孔的发育时间点，可以选择性地靶向特定的皮层细胞亚群。随后可对这些靶向细胞进行分析 体内 或 体外...

在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本视频展示了利用子宫内电穿孔技术将质粒DNA递送至小鼠胚胎小脑神经元细胞的方法。该技术有助于理解基因在正常脑发育过程中的体内功能，以及神经元细胞在肿瘤进展过程中基因表达的变化。...

基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

在本视频中，我们对鸡胚小脑切片进行报告基因质粒的电穿孔转染。该技术有助于可视化颗粒细胞前体的发育及其迁移以形成颗粒层的过程。...

离体电穿孔法转染鸡胚小脑切片：一种通过导入编码绿色荧光蛋白的质粒DNA以可视化颗粒细胞发育的方法

神经元形态发生和迁移是大脑正常发育过程中的关键事件。本文介绍了在培养的小脑颗粒神经元及发育中的小脑中进行遗传学操作的方法，用于评估神经元的形态特征和迁移特性。...

小脑颗粒神经元的遗传操作 体外 和 体内 研究神经元形态与迁移

神经元迁移受到多种细胞自主性和非细胞自主性因素的调控。本方案展示了如何 在子宫内 电穿孔可用于确定转基因小鼠的表型是源于细胞内在机制的破坏，还是源于神经元与其环境之间相互作用的受损。...

通过诱导实现蛋白质删除 子宫内 电穿孔法在转基因模型中界定神经元迁移缺陷

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体...

离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.

通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

本文描述了一种方法，用于在小鼠出生后脑发育过程中可视化颗粒神经元的突触发生，该时期这些细胞会精细调节其突触结构，并形成突触以整合到整个脑神经回路中。...

利用 体内 出生后电穿孔法研究小脑颗粒神经元形态及突触发育

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

了解基于电穿孔的CRISPR体内基因转移技术，用于分析小脑颗粒细胞分化中的基因功能。该方法结合宫内电穿孔和免疫组织化学，为发育神经科学和脑肿瘤研究提供快速高效的基因功能研究手段。

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞子宫内基于电穿孔的基因转移

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使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

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