Gel-seq：一种利用水凝胶基质同时进行DNA和RNA测序文库构建的方法

本实验的总体目标是从少量细胞的 DNA 和 RNA 中生成新一代测序文库，且在整个过程中无需对样本进行任何分割。该方法为研究人员提供了一种研究 DNA 结构变异对基因表达影响的新途径。当我们最初提出 Gel-seq 时，尚无任何可从同一样本中同时测序 DNA 和 RNA 的实验方案。

幸运的是，目前已有三种已发表的方法可解决这一问题。该技术的主要优势在于，可以从同一组细胞中以几乎无需额外成本的方式获得基因组和转录组信息。Gel-seq 最初是使用直立式胶板开发的，但本实验方案可适用于任何标准的凝胶电泳胶板。

在三个离心管中分别制备填充胶、高密度前体混合物和低密度前体混合物。按照所述顺序加入试剂，并涡旋混匀。切勿过早加入APS或TEMED。

等待指示后继续操作。接下来，通过将针头插入瓶盖，然后将针头连接至实验室真空管线，并将此装置浸入超声波浴中，对每种凝胶单体溶液进行脱气处理。

等待约一分钟，直至液体中不再有气泡冒出。接着，在填充液前体混合物中加入 Temed 和 APS，短暂涡旋振荡。三分钟内，使用一毫米移液器向每块凝胶盒中加入六毫米溶液，避免洒出。

将盒体直立放置于水平桌面上，确保液体处于水平状态。然后，逐渐用脱气的离子水加满盒体，注意尽量减少聚合混合物与水的混合。接着，让聚合物固化1小时至过夜。

聚合物固化后，倒掉上层的水，然后从六英寸远处用轻柔的压缩空气流吹干凝胶表面。接着，向高密度凝胶前体中加入TEMED和APS，短暂涡旋混匀。三分钟内，将320微升溶液转移至每个胶盒中，并通过来回轻轻摇动胶盒数次，使溶液均匀覆盖在填充凝胶层上。

然后，用去离子脱气水加满胶盒，让聚合物固化约一小时。固化后，如前所述将聚合物擦干。最后，向低密度凝胶前体混合液中加入 TEMED 和 APS，并涡旋混匀。

然后，迅速用该混合物填充胶盒的剩余部分，并在凝胶开始固化前插入梳子。现在，在梳子上方加入过量的储备前体，以便在聚合过程中被吸附。固化后，胶盒即可使用。

将RNA反转录为cDNA后，使用凝胶回收目标片段。首先，用数毫升DNA去除剂和无尘擦拭布彻底清洁电泳槽。然后，向电泳槽中加入洁净的0.5×TBE缓冲液，将整个装置放入254纳米的紫外交联仪中，紫外灭菌15分钟。

现在，将 Gel-seq 胶块插入电泳槽中并固定到位。然后，轻轻向上拔出梳子，注意不要撕裂凝胶。接着，使用移液器上样。

加样时，将枪头完全插入孔中，以尽量减少孔间污染的风险。在 Gel-seq 试剂盒上施加 250 伏电压，电泳 30 分钟，以分离基因组 DNA 与 cDNA/RNA 杂交体。加样、电泳并收集凝胶后，使用手术刀在高密度层下方将凝胶切成两半，并弃去填充凝胶的一半。

然后，小心使用刮刀工具从胶盒上轻轻剥离剩余的凝胶。使用凝胶成像系统确认分离效果后，利用透射紫外灯切下目标条带。基因组DNA应位于低密度凝胶的起始位置，而互补DNA应位于低密度与高密度区域的交界处。

现在，使用解剖刀切下含有gDNA和cDNA的凝胶区域。同时从阴性对照泳道中切下相同位置的凝胶条带。用钝头镊子轻轻将凝胶条带转移至条状离心管中。

如果凝胶断裂，请找到所有碎片并将其全部转移至离心管中。接着，使用移液器吸头以环形运动方式研磨每块凝胶，并施加压力。在移除吸头之前，向gDNA样品中加入40 µL无核酸酶水，向cDNA样品中加入80 µL无核酸酶水。

然后，小心移除并丢弃枪头。现在，将条带管固定在37摄氏度的涡旋振荡器上，振荡8至12小时。DNA将由此从凝胶中释放出来。

振荡后，用移液器将样品转移至孔径为八微米的滤膜板中。随后，以2,600 ×g离心五分钟，以去除凝胶碎片。接着，将滤膜板从底板上取下，并用移液器将不含凝胶的样品从板中转移至新的200微升条状管中。

向每个含有基因组DNA的样品中加入一微升蛋白酶，用移液器吹打混匀。然后将样品在50摄氏度下孵育15分钟。接着在70摄氏度下加热激活15分钟。

这一核小体耗竭步骤至关重要。接下来，使用18号针头在每个样品管的管盖上刺一个孔。然后，使用真空浓缩仪将基因组DNA样品浓缩至5 µL，互补DNA样品浓缩至10 µL。

如果体积低于目标值，需添加无核酸酶水。使用 Gel-seq 装置对基因组 DNA 和 cDNA/RNA 杂交体进行物理分离。阴性对照在界面处无凝胶的自发荧光。

DNA标准品仅在低密度和高密度膜的界面处显示出一条深色条带，表明小片段能够通过低密度凝胶。来自500个PC3细胞的生物样品显示出基因组DNA与cDNA/RNA杂交体的理想分离效果。低密度膜顶部的深色条带为兆碱基规模的基因组DNA，而cDNA/RNA杂交体则积聚在低密度与高密度区域的界面处。

小于100个碱对的小片段是逆转录过程中由引物寡核苷酸产生的非靶向产物，属于正常现象。文库由500个PC3细胞或750个HeLa细胞生成。将Gel-seq方法生成的配对文库的片段分布与采用标准流程生成的非配对样本进行了比较。

两种方法所得核苷酸片段的分布相似。将PC3细胞文库的测序结果与传统方法进行了比较，并对全基因组范围的拷贝数变异进行了比较。

从统计学角度来看，这两种方法获得了相似的结果。观看本视频后，您应能充分理解如何从同一样本起始材料中制备配对的DNA和RNA二代测序文库。与任何低起始量测序实验一样，务必牢记保持清洁的实验环境。

应仔细注意试管的灭菌和手套的清洁。即使采取了这些预防措施，实验仍可能因污染而偶尔失败。需要特别注意的是，聚丙烯酰胺凝胶虽然普遍且使用安全，但其制备前体为危险的神经毒素，这一点容易被忽视。

应始终在通风橱中操作这些试剂，并立即清理任何溢出物。我们设计的 Gel-seq 旨在便于研究人员在各自实验室中实施，希望这将促进该技术的快速推广应用。