凝胶序列: 一种同时测序库的方法用水凝胶基质制备 DNA 和 RNA
2018年3月26日
凝胶序列使研究人员能够同时为 DNA 和 RNA 的存储提供从 100-1000 细胞开始使用简单的水凝胶装置的可忽略的额外成本。本文给出了该装置的制作方法, 以及生成配对库的生物协议。
本实验的总体目标是从小细胞群的 DNA 和 RNA 生成下一代测序文库，而无需在任何点分离样品。该方法为研究人员提供了一种研究 DNA 结构变异对基因表达影响的新方法。当我们第一次想到 Gel-seq 时，没有同时对同一样品中的 DNA 和 RNA 进行测序的方案。
幸运的是，现在有三种已发布的方法可以解决这个问题。该技术的主要优点是可以从同一组细胞中获得基因组和转录组信息，而增加的成本可以忽略不计。Gel-seq 最初是使用正置凝胶盒开发的，但是，该方案可以适应与任何标准凝胶电泳盒一起使用。
在三个试管中制备填料、高密度和低密度前驱体混合物。按所述顺序添加试剂，涡旋混合物。不要过早添加 APS 或 Temed。
等待指示。接下来，首先将针头插入瓶盖，对每种凝胶单体溶液进行脱气。然后将针头连接到室内真空管路，并将该组件浸入超声波浴中。
等待大约一分钟，直到液体中不再出现气泡。接下来，向填料前驱体混合物中加入 Temed 和 APS 并短暂涡旋。在 3 分钟内，使用 1 mm 移液器向每个凝胶盒中加入 6 mm，而不会溢出。
通过将包埋盒直立放置在水平台上，确保流体水平。然后，逐渐用脱气的电离水加满包埋盒，注意尽量减少聚合混合物与水的混合。然后，让聚合物固化一小时至过夜。
聚合物固化后，倒出水覆盖层，然后从 6 英寸远处使用温和的压缩空气流干燥凝胶表面。接下来，将 Temed 和 APS 添加到高密度凝胶前体中，并短暂涡旋。在 3 分钟内，将 320 μL 转移到每个凝胶盒中，并通过来回摇动凝胶盒几次将其涂抹在填充凝胶层上。
然后，用去离子脱气水加满包埋盒，让聚合物固化约一小时。固化后，像以前一样擦干聚合物。最后，将 Temed 和 APS 添加到低密度凝胶前体混合物中，并涡旋。
然后，用这种混合物快速填充凝胶盒的剩余部分，并在凝胶开始固化之前插入凝胶梳。现在，在聚合过程中将过量的储备前驱体添加到要吸附的梳子上。固化后，包扎盒即可使用。
将 RNA 转化为 cDNA 后，使用凝胶回收目标组分。首先，使用几毫升 DNA 去除产品和无绒湿巾彻底清洁电泳室。然后，用干净的零点 5 XTBE 填充腔室，并将整个设备放入 254 纳米的紫外线交联烘箱中，消毒 15 分钟。
现在，将 Gel-seq 盒插入电泳室并将其锁定到位。然后，轻轻向上拉，不要撕裂凝胶，慢慢取下凝胶梳。现在，使用移液器加载样品。
上样时，将吸头完全插入孔中，以尽量减少孔之间污染的机会。在 Gel-seq 盒上施加 250 伏特的电场 30 分钟，以分离 gDNA 和 cDNA/RNA 杂交体。上样、运行和收集凝胶后，使用手术刀将凝胶切成两半，就在高密度层下方，丢弃填充凝胶的一半。
然后，小心使用刮擦工具轻轻地从凝胶盒上剥离剩余的凝胶。使用凝胶文档验证分离后，使用透射仪切除条带。gDNA 应位于低密度凝胶的起始处，而 cDNA 应位于低密度和高密度区域的界面处。
现在，用手术刀切出含有 gDNA 和 cDNA 的凝胶区域。还要从阴性对照泳道中删除相同的部分。使用钝镊子，轻轻地将凝胶切片转移到条状管中。
如果凝胶破裂，找到所有破损的碎片并将其转移到试管中。接下来，用圆周运动研磨每块凝胶，并用移液器吸头按压。在去除吸头之前，向 gDNA 中加入 40 微升无核酸酶的水，向 cDNA 样品中加入 80 微升水。
然后，小心地取出并丢弃尖端。现在，将联排管固定在 37 摄氏度的涡旋混合器上，并摇晃 8 到 12 小时。因此，DNA 将从凝胶中逃脱。
摇动后，将样品移液到 8 微米网状滤板中。然后，将板以 2， 600 g 离心 5 分钟，以过滤出凝胶片段。接下来，将网状过滤板从壳板上提起，并使用移液器将无凝胶样品从板转移到新的 200 μL 联管中。
向每个含有 gDNA 的样品中加入 1 微升蛋白酶，并上下移液以充分混合。然后，将样品在 50 摄氏度下孵育 15 分钟。然后在 70 摄氏度下加热 15 分钟。
这个核小体耗竭步骤很关键。接下来，使用 18 号针头在每个样品管的盖子上戳一个孔。然后，使用真空离心将 gDNA 样品减少至 5 μL，将 cDNA 样品减少至 10 μL。
如果体积低于目标水平，请根据需要添加不含核酸酶的水。使用 Gel-seq 设备对 gDNA 和 cDNA/RNA 杂交体进行物理分离。阴性对照在界面处没有凝胶的自发荧光。
DNA 分子量标准仅在低密度膜和高密度膜之间的界面处显示一条暗带，表明小片段可以穿过低密度凝胶。来自 500 个 PC3 细胞的生物样品显示基因组 DNA 和 cDNA/RNA 杂交体的所需分离。低密度膜顶部的暗带是兆碱基规模的基因组 DNA，而 cDNA/RNA 杂交体堆积在低密度和高密度区域的界面处。
低于 100 个碱基对的小片段是逆转录过程中引物寡核苷酸产生的脱靶产物，这是意料之中的。从 500 个 PC3 细胞或 750 个 HeLa 细胞生成文库。将从 Gel-seq 生成的匹配文库的片段分布与使用标准方案生成的不匹配样品进行比较。
两种方法的核苷酸片段分布相似。将 PC3 细胞文库的测序结果与传统方法进行比较。比较了全基因组拷贝数变异。
从统计学上讲，这两种方法获得了相似的结果。观看本视频后，您应该对如何从同一起始样品中生成 DNA 和 RNA 的配对下一代测序文库有很好的了解。与任何低起始量测序实验一样，必须记住保持清洁的工作环境。
您应该特别注意对管子进行消毒和清洁手套。即使采取了这些预防措施，实验偶尔也会因污染而失败。值得一提的是，聚丙烯酰胺凝胶的普遍性和安全性使人们很容易忘记制造前体是危险的神经毒素。
您应该始终在通风橱中使用这些试剂，并立即清理任何溢出物。我们将 Gel-seq 设计为易于研究人员在自己的实验室中实施，我们希望这将促进这项技术的快速采用。
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概述
Gel-seq是一种新方法，可以在不分离样本的情况下，从小细胞群体中同时制备DNA和RNA测序文库。这种技术为研究DNA结构变异与基因表达之间的关系提供了一种经济有效的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 转录组学
背景
- Gel-seq能够从单个样本中生成配对文库。
- 之前不存在同时进行DNA和RNA测序的协议。
- 现在有三种已发表的方法解决了这个挑战。
- 该方法可以适用于各种凝胶电泳盒。
研究目的
- 开发一种从小细胞群体中生成测序文库的协议。
- 研究DNA结构变异对基因表达的影响。
- 为多组学研究提供一种经济有效的解决方案。
使用的方法
- 利用水凝胶装置进行文库制备。
- 从同一样本中同时提取DNA和RNA。
- 应用标准凝胶电泳技术。
- 提供详细的制作和生物协议。
主要结果
- 成功从100-1000个细胞中生成配对的DNA和RNA文库。
- 同时进行测序的额外成本可以忽略不计。
- 该协议可适应各种电泳设置。
- 通过结构变异增强了对基因表达调控的理解。
结论
- Gel-seq代表了测序技术的重大进步。
- 该方法促进了全面的基因组和转录组分析。
- 它为基因表达和结构变异的研究开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Gel-seq enables simultaneous DNA and RNA library preparation from small cell populations without sample splitting, addressing a key bottleneck in multi-omics discovery workflows. This capability supports target validation by linking genomic structural variations to transcriptional responses in disease-relevant systems, enhancing predictive confidence in early-stage R&D. The method’s compatibility with standard electrophoresis equipment and low input requirements (100–1000 cells) facilitates scalable adoption in preclinical screening and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating DNA copy number variations with gene expression changes in the same cellular context.
- Operational Value: Eliminates sample splitting, reducing variability and preserving biological fidelity for target de-risking.
- Scientific Value: Supports functional validation of genomic targets through paired genomic-transcriptomic readouts from identical samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative nucleic acid outputs suitable for assay normalization and cross-platform comparison.
- Operational Value: Uses familiar WTA and library prep kits, minimizing training overhead and enabling rapid integration into existing genomics workflows.
- Scientific Value: Generates reproducible fragment distributions comparable to standard methods, ensuring data reliability for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving native DNA-RNA relationships in disease models.
- Operational Value: Adaptable to standard gel cassettes, allowing seamless transfer across labs and core facilities without specialized equipment.
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by enabling direct observation of how structural variants influence expression profiles in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
Gel-seq fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and enabling scalable input into lead identification through multi-omic profiling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking structural DNA alterations to transcriptional outcomes without sample division.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative DNA and RNA libraries with consistent fragmentation profiles for reliable compound screening.
- Analytics: Generates paired-end sequencing data allowing integrated analysis of copy number variation and expression changes.
- Translational Research: Preserves biological context from primary samples through preclinical models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Leverages widely available electrophoresis infrastructure, positioning Gel-seq as a reusable, low-barrier capability across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized hydrogel-based separation and minimal hands-on variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling earlier, more biologically grounded target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing multi-omic evidence from limited, precious samples.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in nucleic acid handling and gel-based techniques.
- Depends on standard gel electrophoresis chambers, power supplies, and UV crosslinking equipment.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation and fractionation protocols.
- Involves handling neurotoxic acrylamide precursors, requiring fume hood use and safety training.
- Performance may vary with input quality and gel polymerization consistency, necessitating QC steps.
