利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

本方法的总体目标是可视化启动型caspase激活过程中的最初步骤之一。该步骤被称为诱导性邻近效应，发生在细胞凋亡过程中caspase分子聚集形成有活性的二聚体时。该方法有助于回答caspase研究领域中的关键问题，例如特定的启动型caspase在何时、何处以及以多高的效率被激活。

该技术的主要优势在于能够实时观察活细胞中caspase激活复合物的组装过程。这种生物分子荧光互补方法利用了与caspase融合的甲状腺素蛋白Venus的两个片段。这些片段本身不具有荧光，但当caspase发生诱导性接近时，两个Venus半分子会相互靠近并恢复荧光信号。

转染细胞时，首先在无菌离心管中加入12 µL转染试剂至750 µL低血清培养基中。室温孵育混合物5分钟。然后，为每个待转染的孔，在无菌1.5 mL离心管中加入10 ng报告质粒。

向每根试管中加入20纳克的每种caspase BiFC质粒。加入减血清培养基，使每根试管的总体积达到100微升。使用P200移液器，将100微升转染试剂溶液逐滴加入质粒混合物中。

将质粒转染试剂混合物在室温下孵育20分钟后，使用移液器或抽吸装置吸去细胞中的培养基。然后使用P1000移液器，沿孔壁轻轻加入800微升无血清培养基。再使用P200移液器，将200微升DNA-脂质复合物逐滴加入每个孔中。

将细胞置于组织培养孵育箱中，在 37 摄氏度下孵育三小时。孵育结束后，通过抽吸或使用移液器小心吸除含有 DNA-脂质复合物的无血清培养基，注意避免破坏单层细胞。随后，沿每个孔的孔壁轻轻加入两毫升预热的完全培养基，然后按照文本方案所述条件继续孵育细胞。

在数据采集之前，按照文本方案中所述方法诱导caspase活化。根据制造商的说明打开显微镜，并启动采集软件。选择60x或63x油镜，并在物镜上滴加一滴镜油。

然后使用正确的培养皿支架将培养皿放置在显微镜载物台上。打开加热装置，并将温度设置为37摄氏度。使用RFP激光器或滤光片聚焦观察报告基因的荧光信号。

以50%的激光功率和100毫秒的曝光时间作为Venus和RFP的初始设置，用于确定实验所需的最优参数。开启实时采集，观察两个通道的成像结果及对应的直方图。如果信号较弱且图像难以辨认，可逐步增加激光功率百分比和/或曝光时间，直至信号强度和图像质量达到理想状态。

接下来，在显微镜软件中选择或打开Z轴层扫模块。沿一个方向调节焦距，直至细胞不再可见。将此位置设为顶部位置。

将焦距向相反方向调节，直至细胞再次不可见，并将此位置设为底部位置。选择最佳步长并开始采集。如有需要，调整显示直方图以改善荧光信号的视觉效果。

最后，使用三维重建软件来重构三维图像。如果有二氧化碳气源，将二氧化碳输送装置放置在载物台支架上方。在软件中将二氧化碳浓度设为5%，并开启二氧化碳控制器。

导航至转染细胞区域。使用RFP激光，通过相机获取并经由计算机屏幕上的采集软件显示的细胞活体图像进行观察。随后，输入RFP激光的激光功率百分比和曝光时间参数。

然后，设置YFP激光的激光功率百分比和曝光时间。对于板上的每个孔，选择若干个包含一个或多个表达报告基因的细胞的不同位置。输入时间 lapse 中每帧之间的间隔时间以及要采集的总帧数。

重新访问每个位置，根据需要校正和更新焦距。开始延时成像并保存数据。最后，按照文本方案中所述，使用现有的成像软件分析数据。

此处展示的是 DNA 损伤后 caspase-2 BiFC 的一个示例。细胞经拓扑异构酶 I 抑制剂：喜树碱（Camptothecin）处理。红色荧光蛋白 mCherry 用作报告分子，以显示细胞表达了 BiFC 探针，并有助于观察细胞总数。

Venus荧光显示为绿色，较大的斑点代表caspase-2诱导的邻近效应。为了高分辨率地展示caspase激活复合物的亚细胞定位，可对单个细胞进行三维成像。此处caspase-2的激活显示为绿色，细胞核显示为红色。

显示细胞的正交切片视图，可并排观察 xy 平面、yz 平面和 xz 平面。三维图像还可通过动画形式展示，使细胞绕 y 轴旋转。为了获得半胱天冬酶（caspase）BiFC 随时间变化的动力学数据，可采用时间 lapse 成像技术。

本视频展示了使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理后，绿色显示的caspase-2激活过程。线粒体以红色显示。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用caspase BiFC技术实时追踪caspase激活复合物的组装过程，并明确判断所形成复合物的大小、形状及定位。

本方案概述了几种基于显微镜的方法，用于获取半胱天冬酶（caspase）BiFC实验的结果；但需要注意的是，这些方法可进行多种变化和组合，以创造性地探究半胱天冬酶激活通路。在实施该实验时，必须注意设置对照，以排除显微镜成像过程中可能产生的伪影，例如光毒性和光漂白效应。随附的文字版实验方案中包含了实现这一目标的实用建议。

选择何种采集和分析方法将取决于待研究的范围以及仪器设备和成像软件的可及性。按照本实验流程，可采用成像分析方法来解读数据。您可以测量荧光强度随时间的变化，或荧光标记细胞所占的百分比。

也可以计算焦点数量或物体大小。