利用3'端cDNA快速扩增技术绘制癌症中的转录本图谱

本实验的总体目标是利用转录本特异性的嵌套引物，通过两轮连续的 PCR 扩增，并对纯化的 PCR 产物进行测序，从而确定 mRNA 转录本从 3' 末端至蛋白质编码区内部区域的序列。该方法有助于回答遗传学领域的关键问题，例如确定转录本的多聚腺苷酸化信号、终止密码子以及 3' 非翻译区的序列。该技术的主要优势在于，只要已知开放阅读框小片段的序列，即可应用于任何转录本。该技术的应用前景延伸至癌症诊断领域，因为它能够检测肿瘤特异性的融合基因和剪接变异体。

我们最初在鉴定出具有先前未表征的3'非翻译区的新型转录本时，产生了本方法的构想。开始实验前，将苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物置于冰上解冻。解冻后，在PCR操作台中向微量离心管加入100微升氯仿。

将样品涡旋震荡10至15秒，直至混合物呈粉红色且不透明。接着，将样品置于冰上孵育15分钟。孵育结束后，在4°C条件下以20,800 g离心15分钟。

小心移除上层无色的水相，并将其转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。随后进行沉淀步骤，向样品中加入等体积的异丙醇。向样品中加入 1 微升共沉淀剂，作为 RNA 的载体，并有助于在后续步骤中观察 RNA。

将样品在 80 摄氏度下孵育至少 4 小时。孵育结束后，将样品转移至预冷的离心机中，在 20,800 g 和 4 摄氏度条件下离心 35 分钟。离心后，RNA 将以管底的蓝色沉淀物形式出现。

小心地从样品中去除异丙醇。加入 500 µL 80% 乙醇，通过短暂涡旋振荡 3 秒使沉淀重悬。再次离心样品。

将样品中的乙醇完全去除，并让样品在空气中干燥约10分钟。样品干燥后，用35 µL无RNase的水重悬样品。然后将样品置于加热块上。

设置为 65 摄氏度，持续五分钟，以确保 RNA 完全溶解。加热后，立即将离心管置于冰上。对于 50 微升的最终反应体系，向新离心管中加入四微克总 RNA，并加水至总体积为 22 微升。

从10微摩尔的引物溶液中加入2微升的Oligo dT 25引物。从反转录试剂盒中加入2微升RNase抑制剂、8微升5×反应缓冲液、4微升10毫摩尔的dNTPs以及2微升反转录酶。设置一个不加反转录酶的反应体系作为阴性对照。

将试管在 42 摄氏度下孵育 1 小时。孵育结束后，立即将试管转移至冰上，然后运送至加热块。随后，在 75 摄氏度下加热试管 5 分钟。

在75摄氏度加热后，将离心管置于冰上。取2 µL cDNA转移至新的0.5 mL PCR管中。从10 mmol/L的引物溶液中加入1 µL上游引物和1 µL下游引物。

加入8.5微升无核酸酶水，使总体积达到12.5微升，然后加入12.5微升2x PCR预混液至凝胶主混合液中。随后，输入屏幕上列出的PCR热循环条件并运行PCR。PCR结束后，制备含溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶。

在250毫升锥形瓶中，将1克琼脂糖溶解于100毫升三乙酸盐缓冲液或TAE缓冲液中。用微波炉加热煮沸溶液。让凝胶冷却1分钟，然后在通风橱中加入7.5微升溴化乙锭溶液。

轻轻旋转锥形瓶充分混匀。将内容物倒入水平凝胶电泳装置中，于通风橱内室温下静置至少30分钟，使凝胶完全凝固。用1×TAE缓冲液覆盖凝胶，随后将10微升PCR产物与3至5微升DNA分子量标准品一同上样至琼脂糖凝胶孔中。

以175伏电压电泳10分钟。在第一次PCR反应中，取1微升cDNA加入PCR管中，再加入5微升10x Pfu反应缓冲液。加入1微升第一轮嵌套正向引物、1微升T7 Oligo dT 25引物，以及来自10毫摩尔溶液的1微升dNTPs。

加入40微升水，使总体积达到49微升。加入1微升Pfu DNA聚合酶，充分混匀。然后进行PCR反应。

接下来，准备第二次PCR反应。将第一次PCR反应产物的2微升转移至新的PCR管中，并加入5微升10x Pfu Ultra II反应缓冲液。然后加入1微升第二轮巢式PCR引物、1微升T7引物和1微升dNTPs。

加入39微升水，使总体积达到49微升，再加入1微升Pfu DNA聚合酶。使用与第一次PCR相同的PCR程序进行扩增。或者，在两次不同的PCR中，可以使用嵌合DNA聚合酶代替Pfu DNA聚合酶。

取五到十微升第二次PCR产物，在琼脂糖凝胶上进行电泳。最后，使用成像仪观察结果。该琼脂糖凝胶显示了两个使用相同正向引物但不同反向引物的PCR产物，以及一个具有独特正向和反向引物的独立PCR产物。

用于基于PCR反应的最佳引物是能够产生一条明确PCR产物的引物。尽管在3'端RACE中采用了不同的PCR循环条件，使用Pfu DNA聚合酶和嵌合DNA聚合酶进行的第二次PCR反应所产生的PCR产物大小相同。逆转录酶阴性对照显示，用于cDNA合成以及后续下游反应的RNA中均无基因组污染。

将凝胶纯化的PCR产物送样进行测序。通过序列色谱图中一条典型的Sanger测序结果，可确定终止密码子、推测的多聚腺苷酸化信号序列、位点以及三端RACE产物中poly A尾的位置。在进行该实验操作时，务必始终佩戴防护装备和手套。

此外，试剂管和其他一次性耗材应使用无菌的 DNase 和 RNase。请注意，使用苯酚和氯仿可能具有极高危险性。进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中使用这些试剂，并将废弃物放入指定的废液容器中。