3 ' 快速扩增 CDNA 末端, 以图记录癌症
March 28th, 2018
在这里描述的两种不同的 3 ' 快速扩增的 cDNA 结束 (3 ' 种族) 协议使用两种不同的 DNA 聚合酶来映射序列, 包括开放阅读框架 (ORF) 的一部分, 停止密码子, 和整个 3 ' UTR 的成绩单使用 RNA从不同的癌细胞系获得的。
该程序的总体目标是通过在随后的两次 PCR 中使用转录本特异性嵌套引物并对纯化的 PCR 产物进行测序，确定从三引物末端到蛋白质编码区内区域的 mRNA 转录本序列。这种方法可以帮助回答遗传领域中的关键问题，例如确定多聚腺苷酸化信号、终止密码子和转录本的三素数非翻译区的序列。该技术的主要优点是，如果开放阅读框的小区域的序列是该技术的含义延伸到癌症诊断，因为它可以检测肿瘤特异性融合基因和剪接变体。
当我们鉴定具有先前未表征的 3 次引发未翻译区域的新转录本时，我们首先想到了这种方法。要开始该方案，请在冰上解冻苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物。解冻后，将 100 微升氯仿添加到 PCR 罩中的微量离心管中。
涡旋样品 10 到 15 秒，直到混合物呈粉红色和不透明。接下来，将样品在冰上孵育 15 分钟。孵育后，将样品在 20、800 g 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。
小心去除上层无色水相，并将其转移到新的 1.5 ml 微量离心管中。然后，继续沉淀并向样品中加入等体积的异丙醇。向样品中加入 1 μL 共沉淀剂，作为 RNA 的载体，并帮助在后续步骤中观察 RNA。
将样品在 80 摄氏度下孵育至少 4 小时。孵育后，将样品转移至冷却的离心机中，在 20、800 g 和 4 摄氏度下旋转 35 分钟。离心后，RNA 将在试管底部显示为蓝色规格。
小心地从样品中取出异丙醇。加入 500 微升 80% 乙醇，短暂涡旋 3 秒，重悬沉淀。再次离心样品。
从样品中取出所有乙醇，让样品风干约 10 分钟。样品干燥后，将其重悬于 35 μL 不含 RNase 的水中。然后，将样品放在加热块上。
在 65 摄氏度下放置 5 分钟，以确保 RNA 完全溶解。加热后，立即将试管置于冰上。对于 50 μL 的最终反应体积，将 4 μg 总 RNA 加入新试管中，加水至总体积为 22 μL。
从 10 微摩尔引物溶液中加入 2 微升 Oligo dT 25 引物。从逆转录试剂盒中，加入 2 μL RNase 抑制剂、8 μL 5x 反应缓冲液、4 μL 10 毫摩尔 dNTP 和 2 μL 逆转录酶。设置不含逆转录酶的反应作为阴性对照。
将试管在 42 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，将试管直接转移到冰上，然后再将其运输到加热块中。然后，将试管在 75 摄氏度下加热 5 分钟。
加热 75 摄氏度后，将管子放在冰上。将 2 μL cDNA 转移到新的 0.5 mL PCR 管中。从 10 毫摩尔引物溶液中加入 1 微升正向引物和 1 微升反向引物。
加入 8.5 μL 无核酸酶水，制备多达 12.5 μL，并向凝胶预混液中加入 12.5 μL 的 2x PCR。然后，输入屏幕上列出的 PCR 热循环条件并运行 PCR。PCR 后，制备用溴化乙锭染色的 1% 琼脂糖凝胶。
将1 克琼脂糖溶于 250 mL 培养瓶中的 100 mL 三乙酸酯或 TAE 缓冲液中。在微波炉中煮沸内容物。让凝胶冷却 1 分钟，然后在通风橱中加入 7.5 μL 溴化乙锭溶液。
通过旋转培养瓶充分混合。将内容物倒入卧式凝胶装置中，让凝胶在室温下在通风橱中凝固至少 30 分钟。用 1x TAE 缓冲液覆盖凝胶，并将 10 微升 PCR 产物与 3 至 5 微升 DNA 分子量标准一起加载到琼脂糖凝胶上。
在 175 伏电压下运行凝胶 10 分钟。对于第一次 PCR，将 1 μL cDNA 转移到 PCR 管中，并加入 5 μL 10x Pfu 反应缓冲液。从 10 毫摩尔溶液中加入 1 微升第一个嵌套正向引物、1 微升 T7 Oligo dT 25 引物和 1 微升 dNTP。
加入 49 微升水，最多可补充 40 微升的总体积。加入 1 微升 Pfu DNA 聚合酶并充分混合。然后，运行 PCR。
接下来，准备第二次 PCR。将第一次 PCR 中的两微升产物转移到新的 PCR 管中，并与 5 微升 10x Pfu ultra two 反应缓冲液混合。加入 1 微升第二个巢式 PCR 引物、1 微升 T7 引物和 1 微升 dNTP。
加入 39 μL 水和 1 μL Pfu DNA 聚合酶，形成高达 49 μL 的总反应体积。使用与第一次 PCR 设置相同的 PCR 配置文件运行 PCR。或者，在两种不同的 PCR 中可以使用嵌合 DNA 聚合酶来代替 Pfu DNA 聚合酶。
取 5 至 10 μL 第二种 PCR 产物，在琼脂糖凝胶上运行。最后，在成像仪上可视化结果。该琼脂糖凝胶显示两种不同的 PCR 产物，它们使用相同的正向引物但不同的反向引物，以及一种不同的 PCR 产物，它们具有不同的正向和反向引物。
用于基于 PCR 的反应的理想引物是产生一种不同 PCR 产物的引物。使用 Pfu DNA 聚合酶和嵌合 DNA 聚合酶进行第二次 PCR 反应的产物产生了相同大小的 PCR 产物，尽管三引物 RACE 的 PCR 循环条件不同。逆转录酶阴性对照显示 cDNA 合成以及后续下游反应中使用的 RNA 没有基因组污染。
将凝胶纯化的 PCR 产物送去测序。序列色谱图中的代表性 Sanger 序列确定了终止密码子的位置、推定的多聚腺苷酸化信号和位点以及三引物 RACE 产物中的多聚腺苷酸化 A 尾。尝试此程序时，请务必记住始终佩戴防护装备和手套。
此外，将无菌 DNase 和 RNase 用于您的试剂管和其他一次性用品。不要忘记，使用苯酚和氯仿可能非常危险。在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如在通风橱中使用试剂和将材料丢弃在指定的废物容器中。
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概述
本文描述了两种不同的3' RACE协议，利用不同的DNA聚合酶来映射来自癌细胞系的mRNA序列。重点是识别转录本的开放阅读框、终止密码子和3' UTR。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 癌症研究
背景
- 3' RACE是一种用于扩增RNA序列的技术。
- 它有助于理解转录本的结构和功能。
- 识别多聚腺苷酸信号和剪接变体对于癌症诊断至关重要。
- 该方法可以应用于具有已知序列的各种转录本。
研究目的
- 确定mRNA序列从3'端到编码区。
- 研究转录变体在癌症中的影响。
- 增进对转录本特征的理解。
使用的方法
- 使用转录本特异性嵌套引物进行PCR。
- 对纯化的PCR产物进行测序。
- 使用不同的DNA聚合酶进行扩增。
- 分析来自各种癌细胞系的RNA。
主要结果
- 成功映射mRNA序列，包括ORF和UTR。
- 识别肿瘤特异性融合基因。
- 表征先前未表征的转录本。
- 证明该方法适用于不同转录本。
结论
- 3' RACE技术对转录本分析有效。
- 它提供了对癌症相关遗传变异的洞察。
- 该方法可以促进转录组学的未来研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mapping transcript architecture from the 3' end into coding regions enables precise characterization of mRNA isoforms, a critical step in target validation for oncology drug discovery. By identifying tumor-specific fusion genes and splice variants, this method supports mechanistic de-risking and improves predictive confidence in early-stage target selection. The approach enhances translational continuity by linking molecular findings to functional transcript stability elements such as miRNA binding sites and AU-rich regions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping full-length transcript structures including ORF and 3' UTR.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through detection of tumor-specific fusion genes and aberrant splice variants in cancer models.
- Scientific Value: Facilitates prediction of post-transcriptional regulatory elements such as miRNA binding sites and destabilizing AU-rich sequences that influence transcript stability.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Generates sequence-validated biological systems suitable for downstream assay standardization and reproducibility testing.
- Operational Value: Provides quantitative nucleotide-level outputs that enable precise comparison of transcript variants across experimental conditions.
- Operational Value: Supports platform reuse by establishing a reliable method for transcript mapping applicable to diverse cancer-associated genes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links discovery-phase transcript identification to preclinical validation by characterizing UTR elements that affect mRNA stability and translation.
- Translational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating transcript variants with functional outcomes in disease-relevant systems.
- Translational Value: Supports biomarker alignment through detection of sequence features in the 3' UTR associated with post-transcriptional regulation in cancer.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly when transcript integrity influences target druggability or biomarker potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving full mRNA structures from 3' end to coding regions.
- Screening: Enables assay readiness by generating sequence-confirmed transcript variants for use in functional screening platforms.
- Analytics: Delivers precise nucleotide sequence data, including stop codons, polyadenylation signals, and UTR elements, to support comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying UTR-based regulatory elements that influence transcript half-life and protein expression.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable capability for transcript characterization across multiple oncology targets and models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcript structure and function.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through nested primer design and controlled PCR amplification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of biologically relevant transcript variants in cancer.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through molecular de-risking of targets based on transcript fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and PCR optimization.
- Depends on access to thermocyclers, agarose gel electrophoresis, and Sanger sequencing capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of primer design and contamination controls, particularly when working with hazardous reagents like phenol and chloroform.
- Involves adaptation considerations for varying transcript abundance and GC content across different cancer models.
- Includes practical limitations related to RNA quality and the need for RNase-free environments to prevent degradation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Cell Lysis and RNA Precipitation
3:12
cDNA Synthesis
4:21
Primer Search for Gene Transcript
6:00
Optimization and Verification of 3' RACE to Map the 3' UTR Using Two Different Enzymes
7:46
Results: Nested Forward Primer Search
8:12
Results: Successful Mapping of Cancer Transcripts
9:03
Conclusion
