应用流式细胞仪对人体脂肪组织免疫细胞的表征
2018年3月6日
本文介绍了一种用流式细胞仪从脂肪组织中分离免疫细胞来分析脂肪组织免疫细胞含量的方法和后续分析。
该程序的总体目标是使用流式细胞术从人类脂肪组织中分离基质血管部分，以对脂肪组织中发现的不同免疫细胞群进行表型分析。这种方法可以帮助回答代谢研究中的关键问题，例如哪些免疫细胞在肥胖个体的脂肪组织中积累以及积累的程度。该技术的主要优点是它允许同时测量免疫细胞上的多个标志物，并识别和定量脂肪组织中的这些免疫细胞。
虽然这项技术可以提供对脂肪组织炎症的重要见解，但它也可以应用于其他器官和组织。通常，刚接触这项技术的个体在染色过程中主要与基质血管细胞污染和细胞损失作斗争。我的两位博士生 Suzan Wetzels 和 Mitchell Bijnen 将执行该方案。
首先用手术刀将一克脂肪组织活检切成大约 2 平方毫米的小块。将碎片转移到 50 毫升离心管中，并向样品中加入 10 毫升胶原酶溶液。将组织片段在 37 摄氏度的水浴中以每分钟 60 次循环孵育 60 分钟。
然后通过 200 微米过滤器过滤到新的 50 毫升锥形管中。离心前用 7 ml PBS 冲洗过滤器。然后使用移液管去除上清液，不要将整个移液器吸头浸入溶液中。
沉淀应清晰可见，并去除几乎所有上清液，以避免基质血管部分被脂肪细胞污染。我们用 5 毫升新鲜 PBS 悬浮基质血管细胞沉淀，并通过 70 微米过滤器将基质血管部分过滤到新管中。离心后，我们将洗涤后的基质血管组分沉淀悬浮在 3 mL 红细胞裂解缓冲液中，在冰上悬浮 5 分钟。
然后用 7 ml PBS 阻止裂解，并通过离心沉淀细胞。为了对基质血管组分进行流式细胞术分析染色，将沉淀重悬于 90 μL 的 4 摄氏度荧光激活细胞分选或 FACS 缓冲液中，并用 10 μL 人 IgG 封闭非特异性染色。将细胞悬液分装到 96 孔 V 形底板的两个孔中，并将细胞置于冰上 15 分钟。
在孵育结束时，用 100 微升 FACS 缓冲液洗涤每个样品，以一个平稳的动作将板倒置，无需敲击以在离心结束时丢弃上清液。在将板倒置之前，请确保您可以清楚地看到板底部的沉淀，以防止在手术过程中丢失细胞。对于第一个 FACS 面板，将第一个沉淀重悬于 29.5 微升抗体混合物中，将第二个沉淀重悬于 23 微升抗体混合物中，用于第二个 FACS 面板。
在黑暗中冰上放置 30 分钟后，用每孔 150 微升 FACS 缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀固定在 150 微升 1% 甲醛溶液中。将细胞悬液从每个孔转移到相应的 FACS 管中，并将样品置于冰上。在分析之前，将未染色的阴性对照加载到流式细胞仪上，以设置前向散射和侧向散射参数。
然后根据制造商的说明调整流式细胞仪的电压，直到所有感兴趣的群体在前向散射和侧向散射图中可见，并且可以区分碎片和活细胞。设置完所有参数后，以 800 rpm 的速度涡旋第一个实验样品，以彻底重悬细胞并将样品加载到细胞仪上。在实时门中读取至少 50， 000 个事件，然后涡旋并加载第二个样品进行分析，如刚才所示。
为了能够分析该代表性实验中的脂肪组织巨噬细胞群，排除了其他免疫细胞，如 T 细胞、B 细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞，以揭示 CD11b + CD11c + 巨噬细胞、CD11B + CD11C 巨噬细胞和 CD11Blow-CD11C + 树突状细胞的存在。这些细胞的主要荧光强度定量显示，CD11B + CD11C + 和 CD11Blow-CD11C + 细胞上浆细胞样树突状细胞和通用树突状细胞标志物的表达，在 CD11Blow-CD11C + 细胞上观察到两种标志物的表达较高，证实 CD11Blow-CD11C + 细胞实际上是树突状细胞。CD45 阳性细胞设门显示 CD19 阳性 B 细胞群和 CD3 阳性 T 细胞群，后者可进一步细分为 CD3+CD4+T 辅助细胞、CD3+CD8+细胞毒性 T 细胞亚群和 CD3-CD56+自然杀伤细胞。
然后计算每个受试者的活免疫细胞百分比，显示肥胖成年男性受试者内脏脂肪组织中促炎 CD11B + CD11C + 巨噬细胞的百分比显着增加。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此过程时，将缓冲液和细胞组分保存在冰上很重要，并且在用抗体标记细胞时，将它们放在黑暗中非常重要。
开发后，这项技术允许代谢研究领域的研究人员探索人类脂肪组织中的免疫细胞改变。看完这个视频后，您应该对如何分离脂肪组织免疫细胞以及如何对这些细胞进行流式细胞术有了很好的了解。请记住，您正在使用可能具有传染性的人体材料和物质，例如甲醛，这可能很危险。
始终佩戴手套和安全眼镜采取预防措施。
概述
本文描述了一种通过分离免疫细胞并使用流式细胞术分析脂肪组织免疫细胞含量的方法。该技术提供了关于脂肪组织中免疫细胞种群的洞察，特别是在肥胖的背景下。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 代谢研究
- 细胞生物学
背景
- 了解脂肪组织中的免疫细胞动态对于代谢研究至关重要。
- 流式细胞术允许同时测量多种免疫细胞标记。
- 识别免疫细胞种群可以帮助阐明肥胖中炎症的作用。
- 挑战包括基质血管细胞污染和染色过程中细胞损失。
研究目的
- 从人体脂肪组织中分离并分析免疫细胞。
- 确定肥胖个体中免疫细胞种群的组成。
- 提供可供代谢研究研究人员使用的协议。
使用的方法
- 将切碎的脂肪组织用胶原酶消化以分离基质血管部分。
- 用特定的抗体对细胞进行染色以进行流式细胞术分析。
- 在流式细胞仪上设置参数以区分活细胞和碎片。
- 进行免疫细胞种群的定量以评估炎症水平。
主要结果
- 在肥胖受试者的内脏脂肪组织中观察到促炎巨噬细胞的显著增加。
- 成功识别了不同的免疫细胞种群，包括T细胞和B细胞。
- 该技术允许对脂肪组织中的免疫细胞进行详细的表型分析。
- 结果有助于理解肥胖中的免疫改变。
结论
- 该方法为研究脂肪组织中的免疫细胞提供了可靠的方法。
- 它可以应用于其他组织和器官进行类似的分析。
- 正确执行该协议可在四小时内得出结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative immune cell profiling in human adipose tissue is critical for de-risking metabolic disease targets and clarifying inflammatory mechanisms in obesity-linked pathologies. Flow cytometry-based characterization of the stromal vascular fraction enables high-content, reproducible immune subset analysis, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing robust, quantitative data on immune cell dynamics in disease-relevant tissues.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell accumulation and phenotype in adipose tissue relevant to metabolic disease hypotheses.
- Supports biological de-risking by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage subsets and other immune populations.
- Provides quantitative immune profiling to inform target validation and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immune cell subset identification for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates assay reproducibility and standardization through multiparametric flow cytometry panels.
- Enables scalable, quantitative readouts for immune cell composition in tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant human tissue, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling immune monitoring in human samples.
- De-risks mechanistic assumptions about inflammation in metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust immune cell analysis in human adipose tissue biopsies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell infiltration and phenotype in metabolic disease.
- Screening: Provides standardized, quantitative immune cell subset data for assay readiness.
- Analytics: Delivers multiparametric measurements and gating strategies for comparative immune profiling.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics in human tissue to preclinical and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues and marker panels, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-driven disease models.
- Operational Value: Standardizes immune cell phenotyping with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and inflammatory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and immune cell marker selection.
- Needs access to high-parameter flow cytometers and validated antibody panels.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and gating strategies.
- Adaptable to other tissues but may require protocol optimization for different sample types.
- Attention to cell loss and contamination is critical for reproducibility and data quality.
