Name: 含脂肪酸脂质体的制备、纯化及应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习制备、纯化和应用含脂肪酸脂质体的方法，用于合成生物学和生命起源研究。该方案可高效生产单分散囊泡，为人工原始细胞构建提供可靠技术。

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J.W.S. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本工作部分由西蒙斯基金会向 J.W.S. 提供的资助（编号 290363）支持。A.E.E. 和 K.P.A. 均感谢明尼苏达大学启动资金的支持。

1. 囊泡制备
<ol>
	<li>薄膜的制备
	<ol>
		<li>使用气密性注射器将一定量的脂质（如表1.1所述）转移至玻璃小瓶中的氯仿中。</li>
		<li>在通风橱中，用氮气或氩气气流蒸发所得溶液。</li>
		<li>将所得的薄膜置于真空环境中至少2小时，以去除任何残留的氯仿。此时脂质可继续在真空中放置过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡的水化
	<ol>
		<li>通过将31 mg荧光素粉末溶解于2.5 mL 1 M tris-HCl pH 8.0缓冲液中，并加入7.5 mL去离子水（DI水），配制10 mL 5 mM荧光素、250 mM tris-HCl pH 8.0的水化缓冲液。</li>
		<li>用移液器将250 µL上述水化缓冲液加入空管中，并加入1.875 µL 10 M NaOH，使最终碱浓度为75 mM（相当于总脂肪酸的½当量）。将该溶液转移至干燥脂质薄膜中，形成总脂质浓度为0.15 M的囊泡。</li>
		<li>使用高速（&#62;3000 rpm）涡旋振荡器涡旋混合物4–5秒。</li>
		<li>将脂质-缓冲液混合物置于低速（约30 rpm）旋转摇床上进行水化，至少过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡尺寸均一化（可选）
	<ol>
		<li>使用镊子将一个滤膜支撑片分别安装至挤出器注射器端口的内表面。</li>
		<li>用250 mM tris-HCl（pH 8）润湿每个滤膜支撑片。</li>
		<li>使用镊子将一张径迹蚀刻的100 nm聚碳酸酯膜安装至挤出器的一个O型圈及滤膜支撑片上。注意避免撕裂或穿孔，轻轻将膜推入O型圈，确保膜与O型圈之间良好接触。</li>
		<li>组装挤出器，注意不要移动膜和滤膜支撑片。</li>
		<li>用约0.5 mL 250 mM tris-HCl（pH 8）填充一个挤出器注射器，并将该注射器插入挤出器的一侧。</li>
		<li>将一个空注射器插入挤出器的另一侧。</li>
		<li>手动缓慢推动含有缓冲液的注射器活塞（≤ 50 µL/s），并确认有阻力感，表明径迹蚀刻膜已正确安装且完好无损。建议在不安装膜的情况下练习此步骤，以判断预期的阻力水平。</li>
		<li>取出并排空两个注射器。由于注射器中残留的缓冲液与脂质体样品成分相同，此阶段无需清洗。</li>
		<li>将脂质体样品装入两个注射器之一。</li>
		<li>重新组装挤出器，将含有囊泡样品的注射器置于左侧，空注射器置于右侧。</li>
		<li>手动非常缓慢地推动含有囊泡样品的注射器活塞（10–25 µL/s）。</li>
		<li>仔细观察挤出器右侧的注射器；最初会有透明缓冲液进入右侧（约50 µL，这是由于挤出器内部的死体积所致），随后出现少量挤出的脂质体。此时立即停止推动，取下右侧注射器并弃去其中溶液。</li>
		<li>更换挤出器右侧的注射器，继续挤出直至左侧注射器排空。</li>
		<li>调换挤出器方向，重复步骤13。根据需要进行指定次数的循环（通常为7、9或11次）；始终使用奇数次循环，以确保不会从最初装载未均一化脂质体样品的注射器中收集到未挤出的脂质体。</li>
		<li>将右侧注射器中的内容物轻柔地转移至一个Eppendorf管中，并将该管置于低速（约30 rpm）旋转摇床上约0.5小时。</li>
		<li>按照第2节所述进行囊泡纯化。挤出后的囊泡应在24小时内使用，或在下次使用前重新挤出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 囊泡纯化
<ol>
	<li>囊泡纯化流动相的制备
	<ol>
		<li>取1.25 mL 1 M tris-HCl pH 8缓冲液和3.75 mL去离子水加入15 mL Falcon管中，配制5 mL 250 mM tris-HCl pH 8水合缓冲液。然后向水合缓冲液中加入37.5 µL 10 M NaOH（相对于未酯化脂肪酸为½当量的碱）。用移液器将235 µL纯油酸直接加入Falcon管中，得到总脂浓度为0.15 M的囊泡溶液。</li>
		<li>使用高速（&#62;3000 rpm）涡旋振荡器将混合物涡旋4–5秒，然后在低速旋转摇床上翻转至少2小时。此时脂质样品可在旋转摇床上过夜孵育。使用前通过0.22 μm针头滤器过滤流动相，以去除任何可能的聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Sepharose上纯化囊泡
	<ol>
		<li>用移液器从瓶中取出约5 mL乙醇中的Sepharose 4B浆液，并将其转移至一次性10 mL层析柱中。</li>
		<li>让浆液沉降，使乙醇流穿，直至乙醇液面接近树脂床顶部。</li>
		<li>向树脂顶部加入5 mL去离子水，并让其流穿，以洗去残留的乙醇。</li>
		<li>将250 mM tris-HCl pH 8缓冲液以1–2 mL为一份，分批加入树脂顶部，每次待液体液面接近树脂床顶部时再加入下一份。重复此步骤3–5次。</li>
		<li>将层析柱夹在铁架台上，然后用带有活塞接头和管路的出口连接至组分收集器。再加入一份缓冲液冲洗管路，当柱内液面接近树脂床顶部时关闭活塞。</li>
		<li>使用200 µL移液器将第1节中制备的挤出囊泡加至树脂顶部，注意尽可能均匀地将囊泡样品加样到树脂表面，避免接触树脂床或柱壁。</li>
		<li>打开活塞开始洗脱，并开始将组分收集至96孔板中。当缓冲液逐渐耗尽时，以0.5–1 mL为一份向树脂床顶部添加囊泡纯化流动相，注意防止树脂床干涸。以每五滴为一份进行收集，至少收集36个孔（即96孔板的三行）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化组分的荧光表征
	<ol>
		<li>取上一步骤中的96孔板，在酶标仪上读取荧光信号（λex=485 nm，λem=515 nm）。</li>
		<li>将所得荧光数据绘制成荧光强度随组分编号变化的曲线图。囊泡首先被洗脱，随后是未包封组分（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复纯化以监测囊泡泄漏
	<ol>
		<li>重复第2.2和2.3节中的纯化与表征步骤。保持内容物完整的囊泡将不出现未包封溶质的峰，或仅出现非常小的峰（约为囊泡峰强度的5–10%）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 镁存在下囊泡的使用
<ol>
	<li>使用未配位的镁
	<ol>
		<li>按照第1、2.1和2.2节所述方法制备并纯化囊泡。</li>
		<li>在250 mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中配制1 mL 50 mM MgCl2溶液：将250 µL 1 M Tris-HCl pH 8.0缓冲液和50 µL 1 M MgCl2加入700 µL去离子水中，涡旋混匀。</li>
		<li>为获得所需的5 mM镁浓度，将0.9 mL纯化后的囊泡与100 µL镁溶液混合，并迅速搅拌，以尽量减少囊泡因短暂暴露于局部高浓度镁而造成的破坏。 
		注意：镁溶液的快速混合对维持囊泡稳定性至关重要。若未立即通过涡旋快速混合镁溶液与囊泡，部分囊泡将暴露于较高浓度的镁中，导致样品间结果不一致。</li>
		<li>在按照2.4节所述进行再纯化以检测内容物泄漏前，将囊泡样品置于旋转仪上至少30分钟。在再纯化流动相中加入与囊泡样品中相同浓度的镁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用配位镁
	<ol>
		<li>按照第1、2.1和2.2节所述方法制备并纯化囊泡。 
		注意：使用½当量KOH代替NaOH去质子化脂肪酸；研究发现，在螯合的MgCl2体系中，这能产生更稳定的脂质体。</li>
		<li>配制2 M柠檬酸钾溶液，并用KOH调节pH至8.0。</li>
		<li>在250 mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中，按指定比例（对于稳定的油酸囊泡约为1:4）预先混合MgCl2与柠檬酸钾。</li>
		<li>将预混的柠檬酸镁溶液加入囊泡样品中，短暂涡旋。 
		注意：必须始终预先混合镁与配体溶液。切勿让囊泡单独接触未螯合的镁溶液。</li>
		<li>在按照2.4节所述进行再纯化前，将囊泡样品置于旋转仪上至少30分钟。在再纯化流动相中加入与囊泡样品中相同浓度的镁和柠檬酸根。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 搭载于囊泡中的非酶促RNA复制
<ol>
	<li>制备单一分散的RNA包封囊泡
	<ol>
		<li>按照第1.1节所述方法制备干燥的油酸薄膜。</li>
		<li>用含有50 µM荧光标记的RNA引物、150 µM RNA模板和250 mM Tris-HCl（pH 8.0，相对于油酸含有½当量KOH）的缓冲液配制囊泡重悬缓冲液。</li>
		<li>向脂质膜中加入250 µL重悬缓冲液，并按照步骤1.2.2和1.2.3操作，制备总脂浓度为0.15 M的囊泡。</li>
		<li>为制备小单层单一分散囊泡，按照第1.3节进行囊泡挤出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柠檬酸镁添加及囊泡纯化
	<ol>
		<li>预先混合镁和柠檬酸盐储备液，然后将其与囊泡样品混合，使最终脂浓度为0.1 M。</li>
		<li>使用Sepharose 4B尺寸排阻柱对囊泡进行纯化，流动相为250 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 M脂质以及指定浓度的镁和柠檬酸盐。</li>
		<li>按照第2.3节收集囊泡组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引物延伸反应
	<ol>
		<li>用250 mM Tris-HCl（pH 8.0）配制200 mM 2-MeImpG（鸟苷5'-单磷酸2-甲基咪唑酯）储备液。（注：2-MeImpG的合成请参照先前发表的方案10。）</li>
		<li>为启动引物延伸反应，将150 µL 2-MeImpG储备液加入450 µL囊泡样品中，使最终脂浓度为75 mM，活化单体浓度为50 mM。启动计时器，并始终保持反应样品在旋转混合状态。</li>
		<li>（可选）为实现持续补充新鲜单体，将300 µL反应溶液转移至实验室自制的小体积脂质体透析装置11的一个腔室中，并在另一腔室中加入300 µL补料溶液。补料溶液应包含与反应溶液相同浓度的所有组分，但需用空囊泡替代含RNA的囊泡。每轮透析持续1–24小时，具体时间取决于分析物和所用膜。</li>
		<li>进行动力学研究时，在每个时间点取100 µL等分试样，并通过Sepharose 4B尺寸排阻柱（以250 mM Tris-HCl pH 8.0为流动相）重新纯化该试样。</li>
		<li>将囊泡组分收集至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>用移液器加入Triton，使其终浓度约为0.1%（v/v）。</li>
		<li>向管中加入0.5 mL冷乙醇，在-20 °C下孵育至少2小时。</li>
		<li>将所有样品在16.1×1000 rcf（16.1 × g）下离心10分钟，轻柔吸弃上清液。用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀，再次离心5分钟。弃去液体，将含有RNA沉淀的离心管置于80 °C金属浴中加热2分钟以蒸发残留乙醇。将沉淀溶解于50 µL含1×TBE上样缓冲液的8 M尿素溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PAGE分析
	<ol>
		<li>通过混合200 mL UreaGel体系浓缩液、25 mL UreaGel体系稀释液、25 mL 10×TBE缓冲液、80 µL TEMED和250 mg过硫酸铵，配制20% PAGE凝胶。迅速将凝胶混合物倒入夹紧的凝胶板（35 cm × 45 cm）之间，插入梳子。静置至少30分钟，直至完全聚合。</li>
		<li>将凝胶板安装到电泳装置上，向电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液。取出梳子，并用注射器冲洗加样孔。以60 W预电泳30分钟。</li>
		<li>将样品在80 °C金属浴上加热2分钟，每孔上样5 µL。</li>
		<li>开启电泳仪，设定恒功率60 W，电泳2.5小时。</li>
		<li>从电泳装置上拆下凝胶板，擦净玻璃表面，将整块凝胶板放入凝胶扫描仪中开始扫描。</li>
		<li>使用ImageQuant TL 1D软件对凝胶进行定量分析。绘制在给定时间点剩余引物量与初始引物量之比的自然对数随时间变化的曲线，拟合为直线，并计算伪一级反应速率（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 水泡中的锤头状RNA自切割反应
<ol>
	<li>囊泡中核酶的制备与纯化
	<ol>
		<li>按照第1.1节方法制备脂质薄膜（油酸:单甘油酯 = 9:1），组分见表1.2。注意：使用前需将单甘油酯加热至至少60 °C以完全熔化。</li>
		<li>配制囊泡重悬缓冲液，其中包含每种锤头状核酶链5 µM，以及250 mM Tris-HCl（pH 8.0）。</li>
		<li>向脂质膜中加入250 µL重悬缓冲液，并按照步骤1.2.2和1.2.3操作，制备总脂浓度为0.15 M的囊泡。</li>
		<li>为获得小单层均一分散囊泡，请参照第1.3节进行囊泡挤出。</li>
		<li>使用Sepharose 4B尺寸排阻柱对囊泡进行纯化，流动相为250 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.15 M混合脂质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>锤头状核酶自切割反应
	<ol>
		<li>配制镁溶液，并按照第3.1节所述方法与纯化后的囊泡混合，以启动自切割反应。</li>
		<li>进行动力学研究时，于每个时间点取100 µL反应混合物，直接通过Sepharose 4B尺寸排阻柱（流动相为250 mM Tris-HCl，pH 8.0）对该等分试样进行再纯化，收集囊泡组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PAGE分析
	<ol>
		<li>按照步骤4.3.6至4.3.8制备RNA上样样品。</li>
		<li>将市售预制的15% TBE-尿素凝胶放入电泳槽中，并用1×TBE电泳缓冲液充满电泳槽。</li>
		<li>将样品在80 °C金属浴中加热1分钟，每孔上样5 µL。</li>
		<li>以恒定200 V电压电泳约1小时。</li>
		<li>扫描凝胶。</li>
		<li>使用分析软件（如ImageQuant TL 1D）对凝胶进行定量，通过比较剩余底物RNA条带与切割后RNA片段条带的强度来测定切割程度（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用于显微镜观察的巨型脂肪酸囊泡
<ol>
	<li>巨型脂肪酸囊泡的制备
	<ol>
		<li>按照第1.1节和表1.3制备油酸薄膜，并加入0.2 mol%荧光标记的脂质，以便更好地观察膜结构。</li>
		<li>用500 µL 250 mM Tris-HCl（pH 8.0）水合脂质薄膜，使囊泡样品中总脂质浓度达到10 mM。缓冲液中可根据需要添加荧光染料或RNA分子。将囊泡样品在旋转仪上轻轻翻转过夜。</li>
		<li>通过将470 µL油酸与150 mL含½当量NaOH的250 mM Tris-HCl（pH 8.0）混合，配制含总脂质10 mM的150 mL纯脂肪酸透析缓冲液。</li>
		<li>将囊泡样品通过10 µm聚碳酸酯膜挤出，以去除大的聚集体。</li>
		<li>如前所述，将囊泡样品转移至1 µm大孔透析盒中。12</li>
		<li>将透析盒放入含有30 mL透析缓冲液的100 mL烧杯中，在台式摇床上以80–100 rpm轻柔振荡。</li>
		<li>每30分钟更换一次透析缓冲液，共更换5次，以去除游离染料或RNA以及小囊泡。</li>
		<li>用注射器小心地从透析盒中取出囊泡样品，并转移至Eppendorf管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜观察
	<ol>
		<li>取10 µL囊泡溶液滴加到洁净的标准显微镜载玻片上，覆盖盖玻片，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜，配合适用于荧光标记膜、RNA或包封染料的激光光源，采用60X油镜或类似物镜观察囊泡（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

许多研究者提出，由脂肪酸形成的脂质体因其高通透性和动态特性，可作为原始细胞的潜在模型。单链脂肪酸的羧基头部基团仅能在有限的pH范围内自发组装形成膜结构，且所形成的膜对盐类的存在非常敏感。因此，与磷脂囊泡相比，脂肪酸囊泡需要采用不同的制备和操作方法。
在本实验方案中，尽管我们以油酸为例进行脂质体的制备，但其他长链不饱和脂肪酸（C14）及其衍生物（如肉豆蔻油酸、棕榈油酸以及相应的醇类和甘油酯）只要总脂质浓度高于临界胶束浓度（cmc），且水合缓冲液的pH接近膜中脂肪酸的pKa值，也可通过薄膜水化法形成囊泡。除本方案中使用的Tris-HCl缓冲液外，已有文献报道其他缓冲体系（如双异丙基甘氨酸（bicine）、磷酸盐、硼酸盐）也支持脂肪酸囊泡的形成，但在磷酸盐或硼酸盐缓冲液中形成的囊泡通常通透性较高13。水化后得到的脂肪酸囊泡具有多分散性和多层结构，但如文中所述，可通过挤出法轻松转化为小尺寸、单分散的单层囊泡。与超声处理这一替代方法相比，挤出法可通过选用不同孔径的膜来更灵活地控制囊泡尺寸。挤出后的囊泡通常略大于膜的孔径，但通过增加挤出循环次数，可获得粒径分布更窄、平均粒径接近膜孔径的囊泡。
为了合成具有功能的原始细胞，脂肪酸囊泡需要容纳由RNA或其他构建模块封装所引发的特定生化反应。薄膜再水化法为形成含有目标封装物质的囊泡提供了一种简便方法。然而，该方法的封装效率相对较低，在纯化过程中通常会损失大量珍贵材料（如RNA）。在某些情况下，挤出前进行多次冻融循环可适度提高封装效率。用于高产率制备磷脂脂质体的微流控方法可实现近100%的封装效率，但目前尚未开发出适用于脂肪酸囊泡的类似方法。
在处理含有螯合态或游离态 Mg2+ 的原始细胞时，每次添加镁溶液后进行纯化，并在每个时间点前重新纯化，可确保去除可能影响囊泡内反应速率测量准确性的泄漏包封物质。由于每次纯化至少需要 10 分钟才能实现良好的分离并收集囊泡组分，因此难以分析快速反应，必须在柱层析重新纯化前终止反应。
本文介绍的方案非常适用于构建含有脂肪酸的脂质体，用于模拟原始细胞中可能发生的反应。我们的方案还可为开发生物医学递送系统及其他生化反应的生物反应器提供潜在应用前景。

脂质体，或称囊泡——由两亲性脂质构成的双层膜所包围的区室——已被广泛应用于多种生物医学领域，例如作为药物递送载体、细胞膜模型以及合成细胞的构建。我们及其他研究者还曾将脂质体用作早期生命中原始细胞膜的模型1,2,3,4。通常在这些系统中，我们采用仅含一条脂质烃链的单链两亲分子（例如，油酸），因为相较于现代细胞所依赖的编码蛋白酶促合成途径，这些分子的化学合成更为简单。
由单链脂质组成的脂质体与由二酰基磷脂形成的脂质体相似例如1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）不同，其边界由双层膜构成。由这两类脂质形成的脂质体均可包载溶解态的有效成分，并可通过不同技术进行减小粒径和纯化。单链脂质独特的化学特性导致若干重要差异。磷脂形成的囊泡在较宽的pH范围内稳定，而脂肪酸囊泡仅在中性至弱碱性pH（约7–9）下稳定，因此囊泡制备时需要特定的pH缓冲体系。大多数情况下，该缓冲液还可含有用于囊泡包封的特定可溶性分子，这些分子可以是功能性材料（例如，RNA）进行区室化的生化反应或使用简单的荧光染料（例如，钙黄绿素（calcein）用于囊泡表征。
仅含一条烃链的结构会形成通透性更高且动态性更强的膜。此外，脂肪酸中的羧酸头基使其形成的囊泡对盐和二价阳离子（例如，Mg2+）更为敏感。在生命起源研究中的原始细胞中，镁是催化生化反应最重要的二价阳离子之一。在生命早期，复杂的蛋白质酶尚未进化出来之前，RNA可能因其兼具自我复制和催化功能的双重能力而成为主导的生物大分子。一个典型的依赖镁离子的RNA相关反应是无酶参与的RNA复制，该反应最早于20世纪60年代被证实。5 当化学活化的RNA核苷酸（即 2-甲基咪唑核苷酸）结合到已存在的引物-模板复合物上时，引物的3'-羟基攻击相邻活化单体的5'-磷酸基团，取代离去基团（即 2-甲基咪唑），从而形成新的磷酸二酯键。这种RNA复制化学反应需要高浓度的Mg2+，但为了与脂肪酸原始细胞相容，必须对该离子进行螯合处理。6 另一个依赖Mg2+的反应是由锤头状核酶（hammerhead ribozyme）催化的反应，该核酶可能是目前表征最充分的催化性RNA。这种核酶可由两条短寡核苷酸重建，能进行自我切割反应，并可通过凝胶迁移实验方便地监测其活性，因此常被用作生命起源研究中的模型核酶。7 由于该核酶需要游离的镁离子，通常需将脂质体构建为脂肪酸与脂肪酸甘油酯的混合体系，以增强其对镁离子的稳定性。8,9 在本实验方案中，我们介绍了自行开发的此类囊泡的制备、操作和表征技术，并展示了将这些囊泡作为原始细胞模型，用于承载无酶RNA复制和锤头状核酶催化的应用。

<table><tbody><tr><td>sephorose 4B</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>4B200</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>C0875-10G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl（pH 8.0）</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>AM9851</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>251275-500G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>71690-250G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma</td><td>30614</td><td></td></tr><tr><td>油酸</td><td>Nu-Chek</td><td>U-46-A</td><td></td></tr><tr><td>单油酸甘油酯</td><td>Nu-Chek</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>丽丝胺罗丹明-PE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>L1392</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>sequagel 浓缩液</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-830</td><td></td></tr><tr><td>sequagel 稀释液</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-840</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-尿素凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC68852BOX</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNA 引物</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td><td></td></tr><tr><td>RNA 模板</td><td>IDT</td><td>5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td><td></td></tr><tr><td>锤头状核酶底物链</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td><td></td></tr><tr><td>锤头状核酶链</td><td>IDT</td><td>5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td><td></td></tr><tr><td>囊泡挤出装置套装</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>Gilson, Inc.</td><td>171041</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Fisher</td><td>NC9995941/675</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax i3</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R MP Confocal</td><td></td></tr><tr><td>凝胶扫描仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon 9410 scanner</td><td></td></tr></tbody></table>

含脂肪酸脂质体的制备、纯化与应用

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

含有单链两亲性分子（特别是脂肪酸）的脂质体由于这些两亲性分子独特的化学性质，表现出与含有二酰基磷脂的脂质体不同的特性。具体而言，由于单链两亲性分子相对较高的溶解度，脂肪酸脂质体具有更强的动态特性。同样，由于羧酸头部基团与金属离子之间存在强相互作用，含有游离脂肪酸的脂质体对盐和二价阳离子更为敏感。本文介绍了部分或完全由单链两亲性分子（例如，油酸）组成的脂质体的制备、纯化及使用方法。

我们通常使用尺寸排阻柱进行脂质体纯化。典型的脂质体制备物含有某种荧光染料。当脂质体生成并经过挤出后，待包封的物质会同时存在于脂质体内外。通过在尺寸排阻树脂（Sepharose 4B）上纯化脂质体，未包封的小分子溶质会被树脂孔隙截留，而较大的脂质体则无法进入孔隙，因而先被洗脱出来（图1A）。收集洗脱组分并绘制荧光强度相对于组分编号的曲线（图1B），通常会得到双峰图谱，其中先洗脱的组分对应脂质体，收集这些组分即可用于后续实验应用。
我们经常研究非酶促引物延伸反应，这类反应可能是核酶和蛋白质依赖性RNA聚合酶出现之前RNA复制的可能途径。这些反应通常使用荧光标记的引物（图2A），由活化单体实现引物的延伸。可通过凝胶电泳监测这些反应（图2B），并对所得电泳图进行积分，以获得特定反应条件下的反应速率常数（图2C）。
为了证明RNA可以在原始细胞内发挥功能，我们采用锤头状核酶的自我切割反应（图3A）作为RNA催化反应的模型。该反应需要游离的Mg2+来促进催化，因此我们使用油酸/单油酸甘油酯（OA/GMO）囊泡，因为它们在含有5 mM Mg2+的条件下仍保持稳定。与引物延伸反应类似，锤头状核酶的自我切割反应也可通过凝胶电泳进行监测（图3B），随后可进一步分析以获得特定条件下的反应速率常数（图3C）。
我们采用荧光和透射光对脂质体进行成像。脂质体可通过荧光脂质标记，从而实现膜标记（图4A），或在其管腔内使用荧光溶质（图4B）。透射光也可用于观察囊泡（图中同样显示） 图4B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">表 1.1 氯仿中的纯油酸</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">油酸</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>11.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">氯仿</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">表 1.2 氯仿中的油酸与单油酸甘油酯（9:1）混合物</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">油酸</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>10.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">单油酸甘油酯</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>1.4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">氯仿</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">表 1.3 含 0.2 mol% 罗丹明-PE 的氯仿油酸溶液</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">油酸</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>1.6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">氯仿中的罗丹明-PE</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">氯仿</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 脂肪酸氯仿溶液。
<img alt="钙黄绿素囊泡分离、SDS-PAGE图谱、荧光图展示峰分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 囊泡纯化及纯化组分的荧光表征。A. 在Sepharose 4B柱上将含有钙黄绿素的囊泡与游离钙黄绿素分离。B. 通过绘制各孔收集组分的荧光值相对于孔号的曲线，检测囊泡和游离钙黄绿素的峰。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA延伸过程、凝胶电泳、衰减分析；实验、时间过程结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 油酸囊泡内非酶促RNA复制。A. 非酶促RNA引物延伸示意图。B. 纯油酸囊泡内引物延伸反应的PAGE图像，反应条件同第4节。C. 在30小时内，给定时间点剩余引物量与初始引物量比值的自然对数相对于时间的线性拟合。反应速率由ln(P/P0)对时间曲线的斜率计算得出，为0.058 h-1。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA切割示意图、凝胶电泳图、动力学分析图；显示底物转化情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. OA/GMO囊泡中的锤头状核酶切割反应。A. 荧光标记底物链被锤头状核酶切割的示意图（上方）。B. 在含5 mM Mg2+的OA/GMO囊泡内进行锤头状核酶切割反应的PAGE图像。C. 囊泡内核酶活性。前4小时中，剩余底物量与初始底物量比值的自然对数随时间变化的线性拟合。由ln(S/S0)对时间曲线的斜率计算得到的反应速率为0.36 h-1。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，荧光检测在细胞研究中比较红色和绿色标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 用于显微镜观察的巨型脂肪酸囊泡。A. 罗丹明PE标记的油酸囊泡的共聚焦显微镜图像，比例尺为 10 μm。B. 含有Alexa488标记RNA的油酸囊泡的共聚焦显微镜图像，膜结构显示在透射检测器（TD）通道中，比例尺为 5 μm。

含有单链两亲性分子（特别是脂肪酸）的脂质体由于单链两亲性分子独特的化学性质，表现出与含有二酰基磷脂的脂质体不同的特性。本文介绍了部分或完全由这些两亲性分子组成的脂质体的制备、纯化及使用方法。

含有单链两亲分子（尤其是脂肪酸）的脂质体与含有二酰基磷脂的脂质体相比，表现出不同的特性，原因在于……

本实验的总体目标是制备、纯化并使用部分或完全由脂肪酸组成的脂质体。该方法有助于回答合成生物学和生命起源研究中的关键问题，例如定义最小细胞和构建人工原始细胞。本方案的主要优势在于，它提供了一种简单且低成本的方法，可在多种实验条件下高效地制备单一分散的脂肪酸囊泡并对其进行操作。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为脂肪酸囊泡比磷脂囊泡更脆弱，尤其是在存在氯仿的情况下。为制备干燥脂质的薄膜，应使用气密性注射器将特定量的氯仿脂质溶液转移至玻璃小瓶中。在通风橱中，用氮气或氩气气流吹扫以蒸发氯仿。随后将所得的脂质薄膜置于实验室真空条件下至少两小时，以去除任何残留的氯仿。此时可将脂质在真空条件下静置过夜。为使囊泡重新水化，用移液器将250微升水化缓冲液加入一支空试管中，然后加入1.875微升10摩尔的氢氧化钠溶液，得到终浓度为75毫摩尔的碱液。将该溶液转移至干燥脂质薄膜中，形成总脂肪酸浓度为0.15摩尔的囊泡，随后使用高速涡旋振荡器将所得混合物涡旋4至5秒。将脂质缓冲液混合物置于低速旋转摇床上，过夜复水。为制备大小均一的囊泡，使用镊子将一个滤膜支撑片分别贴附在脂质体挤出器注射器端口的内表面。用 250 毫摩尔/升 Tris-HCl（pH 8）润湿每张滤膜支撑片。使用镊子将一张孔径为100纳米的核孔滤膜（track etch）贴附在挤出器O型圈和滤膜支撑架之一上。注意避免撕裂或刺穿滤膜，轻轻将滤膜推入O型圈内，确保滤膜与O型圈表面之间充分接触。接着组装挤出器，注意不要使滤膜和支撑架发生移位。用约 0.5 毫升 250 毫摩尔/升 Tris-HCl（pH 8）填充挤出器注射器。将该注射器插入挤出器的一侧。将一个空注射器插入挤出器的另一侧。用手缓慢推动含有缓冲液的注射器活塞，检查是否感受到阻力，以确认核孔膜已正确安装且完好无损。建议在不安装膜的情况下练习此步骤，以判断预期的阻力程度。随后取下并排空两个注射器。目前无需清洗这两个注射器，因为它们所含缓冲液的成分与脂质体制剂相同。接下来，将脂质体制剂装入两个注射器中的一个。重新组装挤出器，使装有囊泡样品的注射器位于左侧，空注射器位于右侧。然后用手非常缓慢地推动装有囊泡样品的注射器的活塞。仔细观察挤出器右侧的注射器。由于挤出器内部存在死体积，最初会有澄清的缓冲液进入挤出器右侧，随后出现少量被挤出的脂质体。此时立即停止推动。取下挤出器右侧的注射器并弃去溶液。更换挤出器右侧的注射器，继续挤出直至左侧注射器排空。反转挤出器的方向并重复更换注射器。按所需循环次数继续操作。循环次数始终采用奇数，以确保脂质体不会从最初含有未挤出脂质体的注射器中收集。最后，将右侧注射器中的内容物轻轻排入一个Eppendorf管中。将该管置于低速旋转摇床上，振荡约30分钟。为制备囊泡纯化流动相，在一个15毫升Falcon管中配制5毫升250毫摩尔/升Tris-HCl pH 8水合缓冲液。然后向水化缓冲液中加入 37.5 微升 10 摩尔的氢氧化钠。用移液器将 235 微升纯油酸加入 Falcon 管中，得到总脂浓度为 0.15 摩尔的囊泡溶液。接下来，使用高速涡旋振荡器将混合物涡旋 4 至 5 秒。然后在低速旋转摇床上翻转至少两小时。此步骤中，脂质制剂可在旋转摇床上放置过夜。通过0.22微米注射器滤器过滤流动相，以去除任何可能的聚集体。为了纯化囊泡，首先按照文本方案中所述制备 Sepharose 4B 柱，并将其固定在铁架台上。然后将柱子出口端通过夹管阀连接头与管道连接，并将管道另一端接入组分收集器。加入另一部分缓冲液以冲洗管道，当柱内液面接近树脂顶部时关闭夹管阀。接下来，使用200微升移液器将挤出的囊泡均匀地加至树脂顶部，注意尽量均匀地施加囊泡样品，避免接触树脂床或柱壁。打开活塞开始流速，并将洗脱组分收集至96孔板中。当缓冲液逐渐流尽时，以0.5至1毫升的分段向树脂床上层添加囊泡纯化流动相，注意防止树脂床干涸。然后以每五滴为一份收集洗脱液，至少收集36个组分。为表征纯化组分，使用酶标仪读取96孔板。将获得的荧光数据绘制成荧光强度相对于组分序号的曲线图。囊泡首先洗脱，随后是未包封组分。使用配体结合的镁时，将氯化镁和柠檬酸钾按指定比例在250毫摩尔/升 Tris-HCl pH 8缓冲液中预先混合。此处，稳定油酸囊泡采用1比4的比例。务必始终预先混合镁离子溶液和配体溶液。切勿将脂肪酸囊泡单独暴露于未螯合的镁离子中。将预先混合的柠檬酸镁溶液加入囊泡样品中。短暂涡旋混合物。将囊泡样品置于滚转仪上至少30分钟，然后再按照文本方案中所述进行重新纯化。务必向重新纯化的流动相中加入与囊泡样品中相同浓度的镁和柠檬酸盐。按照文本方案所述，将镁溶液与纯化的囊泡混合，以启动自切割反应。进行动力学研究时，于每个时间点取100微升混合液，并直接通过以250毫摩尔/升 Tris-HCl（pH 8）为流动相的Sepharose 4B凝胶过滤柱重新纯化该等分试样。收集囊泡组分。按照文本方案中的描述制备RNA上样样品。将 commercially-casted 15% TBE 尿素胶放入电泳槽中，并用1X TBE电泳缓冲液充满电泳槽。将样品在80摄氏度的加热块上加热一分钟后，每孔上样5 µL。以恒定的 200 伏电压电泳约一小时。最后，扫描凝胶并使用分析软件进行定量。为了证明 RNA 可在原始细胞内发挥功能，采用带有荧光标记底物链的锤头状核酶自切割作为模型 RNA 催化反应。该反应需要游离镁离子以促进催化。因此，使用了油酸/单油酸甘油酯囊泡，因为它们在 5 毫摩尔镁离子存在下仍保持稳定。锤头状核酶的自切割反应可通过凝胶电泳进行监测。在对页面图像进行定量后，绘制底物在给定时间点的剩余量与初始量之比的自然对数相对于时间的线性拟合曲线。该图可用于核酶活性的计算。一旦掌握，包封有染料或RNA的脂肪酸脂质体可在24小时内完成制备和纯化。在进行该实验操作时，重要的是要记住在合适的 pH 范围内形成脂肪酸脂质体，并保持总脂质浓度高于脂质的临界聚集浓度，以避免囊泡溶解。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备脂肪酸脂质体，以及如何利用它们来承载生化反应。

preparation-purification-and-use-of-fatty-acid-containing-liposomes

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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