Name: 小鼠胰岛细胞筛选致糖尿病环境化学物质的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学习小鼠胰岛细胞分离技术，用于筛选诱导活性氧产生的环境化学物质并评估其致糖尿病潜力。该方法支持体外分析化学物质对胰腺生理功能的影响。

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本工作得到了由美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）资助的CREH中心试点项目基金以及国家自然科学基金（编号：31572626）的支持。

所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本实验方案在德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行。&amp;#38;M基因组医学研究所
1. 溶液配制
<ol>
	<li>将10倍浓度的Hank's平衡盐溶液用双蒸水稀释至1倍浓度2O，并在4 °C下保存。</li>
	<li>通过加入 HEPES（10 mM）、MgCl₂（5 mM）和牛血清白蛋白（0.1%）配制分离溶液2 （1 mM）和葡萄糖（5 mM）。将pH值调节至7.4，并置于冰上保存。</li>
	<li>使用胶原酶IV型配制胶原酶溶液。 
	注意： 具体而言，IV型胶原酶每毫克干重含有160单位。将1 g IV型胶原酶溶于5 mL双蒸水中2O，浓度为200 mg/mL。将2 mL稀释后的胶原酶加入30 mL冰浴分离液中，每只小鼠分装6 mL胶原酶溶液至50 mL离心管中。</li>
	<li>通过加入 1 mM CaCl₂ 制备洗涤液2 加入分离溶液中。</li>
	<li>使用冷的聚蔗糖/泛影酸钠溶液（1.1119 g/mL，5 mL）配制纯化溶液。</li>
	<li>在 RPMI 培养基中加入 L-谷氨酰胺（20 mM）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）和胎牛血清（FBS）（10%），配制 500 mL 胰岛培养基。</li>
	<li>将DCFH-DA粉末溶于蒸馏水中，配制成200 µM的储备液，于-20 °C保存。 
	注意： ROS染色液需新鲜配制，将DCFH-DA储备液用RPMI稀释至终浓度为5 µM。该试剂需避光保存。</li>
</ol>
2. 手术准备
<ol>
	<li>对小鼠进行腹腔注射（I.P.）戊巴比妥钠（2.5% avertin，0.4 mL/20 g）。待小鼠完全麻醉且对后肢足部夹捏无反应后，实施安乐死，并将小鼠转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将已安乐死的小鼠仰卧放置，用70%乙醇喷洒皮肤以进行消毒。</li>
	<li>在上腹部做一约1 cm的U形切口，打开腹腔，并将皮肤向头侧胸部方向牵拉，以充分暴露腹腔。</li>
</ol>
3. 胰腺灌注与摘除
<ol>
	<li>如图1所示，找到壶腹部的位置。使用一对弯镊在靠近奥迪括约肌的位置夹闭十二指肠。用另一对弯镊夹闭十二指肠壁，以阻断胆汁在十二指肠内的通路。 
	注意：此步骤中尚未插入导管。该步骤旨在阻断十二指肠内的胆汁通路。</li>
	<li>调整小鼠体位，使其头部朝向研究人员近端，足部朝向远端。</li>
	<li>找到胆总管，使用30 G针头和5 mL注射器缓慢注入3 mL胶原酶溶液。确保注射后胆总管和胰腺充分膨胀。</li>
	<li>使用弯镊和精细剪刀将膨胀的胰腺从降结肠、肠道、胃和脾脏中分离并取出。将胰腺置于含有3 mL胶原酶溶液的50 mL离心管中，并置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 胰腺消化
<ol>
	<li>将每个50 mL离心管放入37 °C水浴中，孵育15 - 20分钟（时间因小鼠品系和年龄而异）。</li>
	<li>使用涡旋振荡器振荡离心管。</li>
	<li>将4 - 5个消化后的胰腺组织合并置于一个大型无菌水槽滤网中，用刮勺充分捣碎胰腺组织。使用含有洗涤液的23 G针头和10 mL注射器，用力将消化后的细胞从滤网上冲洗下来。将洗涤液收集至50 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以97 × g离心1分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向离心管中加入25 mL洗涤液，轻轻涡旋重悬组织。在4 °C下以97 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此步骤3次。注意不要使沉淀的组织脱落。</li>
</ol>
5. 胰岛的纯化
<ol>
	<li>向洗涤后的组织沉淀中加入10 mL纯化液，并轻轻重悬内容物。</li>
	<li>将5 mL分离液轻轻覆盖在纯化液上方。注意保持两层溶液之间形成清晰的液-液界面。</li>
	<li>将离心管在4 °C条件下以560 × g离心15分钟，采用慢加速且不启用刹车。将移液器插入界面处，收集胰岛层至新的50 mL离心管中。</li>
	<li>按照步骤3.5所述方法洗涤胰岛。</li>
</ol>
6. 胰岛细胞的铺板与处理
<ol>
	<li>将胰岛用10 mL胰岛培养液重悬，轻轻混匀，使用多通道移液器将100 µL/孔加入96孔板中。每孔约放置5个胰岛。</li>
	<li>将板置于组织培养箱中孵育12小时。</li>
	<li>将96孔板以112 × g离心，弃去培养基。</li>
	<li>用胰岛培养基稀释环境化学物质。将每种化学物质的稀释液各100 µL分别加入板中不同孔内。重悬各孔中的胰岛，并在37 °C孵育12小时（不同环境化学物质的浓度有所不同）。</li>
</ol>
7. 活性氧染色与检测
<ol>
	<li>&#160;胰岛处理后，用1× PBS洗涤（每孔96孔板使用200 µL）。 
	注意： 化学物质的浓度如下：AFB1：3 µM，莠去津（Atrazine）：100 µM，苯并[a]芘（BaP）：10 µM，双酚A（BPA）：100 µM，β-雌激素，PCB126：10 µM，壬基酚（Nonylphenol）和双酚A（BPA）：100 µM。</li>
	<li>使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为抗氧化剂以淬灭活性氧（ROS）。向诱导ROS的化学物质稀释液中加入5 mM NAC，并在37 °C孵育12小时。</li>
	<li>将96孔板以112 × g离心，然后在37 °C下与5 µM荧光探针溶液（H2-DCFH-DA溶于RPMI培养基中）孵育60分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤处理后的胰岛细胞3次，并在488 nm激发波长下使用酶标仪检测530 nm处的荧光强度。 
	注意： 当样品在488 nm激发时，细胞内DCF的积累可通过530 nm处荧光强度的增加进行测定。</li>
	<li>对经ROS诱导型异源物质处理和未处理的胰岛进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验9，以评估异源物质对胰岛生理功能的影响。</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

越来越多的证据表明，接触环境化学物质在2型糖尿病（T2DM）的发生发展中起着重要作用。外源性化学物质诱导产生的活性氧（ROS）已被认为是导致T2DM发生的潜在病因因素之一。人类暴露于多种多样的外源性化学物质之中，因此迫切需要开发新的研究技术，以有效识别对胰腺具有毒性的物质，并深入探究其对胰腺细胞特异性的毒性作用机制。
在本研究中，依据已发表的实验方案14我们已开发出一种从小鼠中分离胰岛并使用外源性化学物质筛选胰腺细胞氧化应激损伤的实验方案。我们还利用该方法研究外源性化合物诱导的胰腺特异性毒性反应。为获取小鼠胰腺，我们优先选用阿佛丁（avertin）作为麻醉剂，因其不会改变血糖水平，也不会影响胰腺的血管系统。15,16,17我们发现，密度梯度离心步骤对于高纯度胰岛的分离至关重要。应小心操作以获得多蔗糖/钠溶液与分离缓冲液相之间的清晰界面，从而获得不含碎...

近年来，2型糖尿病（T2DM）患病率的上升已成为全球性的健康危机，对公共卫生构成严重威胁1。许多因素已被发现与T2DM的发生有因果关系，其中反复出现的研究结果表明，这些因素的一个共同交汇点是诱导氧化应激，从而导致过量活性氧（ROS）的产生2,3。
已发现多种环境化学物质（包括多氯联苯、二噁英和苯并[a]芘）可诱导氧化应激，这可能损害胰腺β细胞功能，并导致胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2DM）4。尽管生理水平的活性氧（ROS）在细胞功能中发挥重要作用，但当ROS暴露超过抗氧化系统的清除能力时，就会导致细胞/组织损伤并引发疾病5。胰腺β细胞表达的抗氧化酶水平较低，因此对氧化应激介导的损伤尤为敏感6,7。长期暴露于高水平的ROS已被证实可引起应激诱导的胰腺细胞功能障碍5，以及肝脏和脂肪组织中的胰岛素抵抗8。
本项目的主要目标是开发一种基于细胞的检测方法，通过检测化学物质在胰腺细胞中诱导活性氧（ROS）的产生能力，筛选其潜在的致糖尿病风险。胰腺缺乏代谢解毒能力，因而易受外源性物质诱导的损伤6,7因此，通过直接测量胰腺细胞中产生的活性氧（ROS），该检测方法可对化学物质引起的胰腺损伤提供直接的评估。为建立该方法，我们分离了小鼠胰岛，将分离的胰岛在细胞培养条件下与化学物质共同孵育，并以化学物质诱导的ROS生成作为检测指标。该方法操作简便、效果显著，可用于鉴定在分离胰岛中诱导ROS产生的化学物质，并可进一步拓展用于研究针对胰腺特异性的毒性作用机制。 体外.

<table><tbody><tr><td>10&amp;times;Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>聚蔗糖/泛影酸钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-二氯荧光素（DCFH-DA）</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>荧光酶标仪&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>戊四醇</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>用于96孔板离心</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>用于荧光检测</td></tr></tbody></table>

用于筛选致糖尿病环境化学物的小鼠胰岛细胞筛选模型

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

暴露于某些环境化学物质可导致人和动物胰腺β细胞的细胞损伤，进而引发2型糖尿病（T2DM）。尽管化学物质诱导β细胞损伤的机制尚不明确且可能较为复杂，但一个反复出现的研究发现是，这些化学物质会诱导氧化应激，导致过量活性氧（ROS）的产生，从而对β细胞造成损伤。为识别潜在的致糖尿病环境化学物，我们从C57BL/6小鼠中分离胰岛细胞，并将胰岛细胞接种于96孔细胞培养板中；随后用不同化学物质处理胰岛细胞，并利用2',7'-二氯荧光素（DCFH-DA）荧光染料检测ROS的生成。通过该方法，我们发现双酚A（BPA）、苯并[a]芘（BaP）和多氯联苯（PCBs）均可诱导高水平的ROS生成，提示它们可能对胰岛细胞具有潜在损伤作用。该方法可用于筛选致糖尿病的外源性化学物质。此外，培养的胰岛细胞也可适用于 体外 胰腺细胞中化学物诱导毒性的分析

健康分离胰岛的显微图像如图所示 图2，其中胰岛呈圆形或椭圆形，大小相对均匀（尽管不同品系间大小均匀性可能存在差异）。接下来，我们研究了胰腺胰岛在一种 体外 通过分离胰岛并在培养的胰岛中刺激胰岛素分泌来进行检测。 图3 展示了我们对C57BL/6小鼠分离胰岛进行葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验的典型分析结果，分别由3.3 mM和16.7 mM葡萄糖诱导9.
采用平板筛选法，我们已鉴定出多种可导致胰岛细胞内活性氧（ROS）显著诱导的异源物质（图4）。我们将分离的胰岛用不同化学物质处理12小时，发现莠去津（Atrazine）、双酚A（BPA）、苯并[a]芘（BaP）、多氯联苯126（PCB126</su...

本文介绍了一种分离小鼠胰腺胰岛细胞的实验方案，用于筛选外源性化学物质诱导的活性氧（ROS）生成，以鉴定潜在的致糖尿病外源性化学物质。

暴露于某些环境化学物质已被发现可导致人和动物胰腺β细胞的细胞损伤，进而引发……

胰腺细胞是活性氧（ROS）诱导损伤的敏感靶点，这与2型糖尿病的发生有关。基于胰腺细胞的检测方法将有助于识别诱导活性氧产生的化学物质。该技术的主要优势在于利用分离的胰腺胰岛细胞，简便有效地鉴定可能具有额外致糖尿病潜力的活性氧诱导化学物。该方法也可用于体外分析化学物质对胰腺生理功能的影响，例如葡萄糖刺激的胰岛素分泌。使用一对弯镊在靠近壶腹括约肌的位置夹住十二指肠。用另一对弯镊夹住十二指肠壁以阻断胆汁通路。找到胆总管，使用30号针头和5毫升注射器，缓慢注入3毫升胶原酶溶液。然后，重新放置小鼠，使其头部朝向近端，足部朝向远端。注射后确保胆总管和胰腺膨胀。使用弯头镊子和精细剪刀，将肿大的胰腺从降结肠、肠道、胃和脾脏上分离并取出。然后将器官置于含有 3 毫升胶原酶溶液的 50 毫升离心管中，并置于冰上。将每个 50 毫升离心管放入 37 摄氏度水浴中，孵育 15 至 20 分钟。涡旋混匀试管，然后将四到五个已消化的器官放入一个大的无菌水槽滤网中，用刮勺彻底将胰腺组织捣碎。使用装有洗涤液的23号针头和10毫升注射器，用力通过滤网反复吹打，使消化后的细胞脱离滤网。随后，将洗涤液收集至50毫升离心管中。将离心管在97g、4摄氏度条件下离心1分钟，然后倾去上清液。向离心管中加入25毫升洗涤液，通过轻轻涡旋重悬组织。随后离心沉淀组织，倾去上清液。重复洗涤三次，注意不要使沉淀的组织松动。为了纯化胰岛，向洗涤后的组织沉淀中加入10 mL纯化液，并轻轻重悬。将5 mL分离液轻轻覆盖在纯化液上方。确保两种溶液之间保持清晰的液相界面。将离心管在4°C条件下以560g离心15分钟，采用慢加速且不刹车。然后将移液器插入界面处，收集胰岛层。将溶液转移至新的50毫升离心管中，然后按照刚刚演示的方法洗涤胰岛。去除最后一次洗涤液后，加入10毫升胰岛培养液，轻轻且充分混匀以重新悬浮胰岛。随后，使用多通道移液器将每孔100微升的悬浮液转移至96孔板的各孔中。将培养板置于组织培养箱中孵育12小时。然后以112g离心培养板并移除培养基。用胰岛培养基稀释环境化学物质。将每种化学稀释剂各100微升加入到培养板的不同孔中。重悬各孔中的胰岛，并将培养板在37摄氏度孵育12小时。胰岛经化学处理后，使用1×PBS洗涤样品。然后，向孔中加入5毫摩尔的N-乙酰半胱氨酸（NAC），作为抗氧化剂以清除活性氧（ROS），并将培养板在37摄氏度下孵育12小时。将96孔板以112 ×g离心，然后加入5微摩尔的荧光探针溶液，并在37摄氏度下孵育60分钟。用PBS洗涤处理过的胰岛细胞3次，并使用酶标仪在480纳米波长下检测荧光强度。最后，对经ROS诱导型外源性物质处理和未处理的胰岛进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）检测，以评估该外源性物质对胰岛生理功能的影响。图中所示为从C57 Black/6小鼠分离得到的健康胰岛，呈圆形或椭圆形，大小相对均一。在此GSIS检测中，使用分离的胰岛在葡萄糖刺激下分泌胰岛素，观察到剂量依赖性反应。当分离的胰岛暴露于此处列出的外源性化学物质时，包括莠去津（Atrazine）、苯并[a]芘（BaP）、双酚A（BPA）和多氯联苯（PCB）在内的多种化学物质均显著诱导了活性氧（ROS）的产生。然而，加入NAC后能够有效抑制这些化学物质所引发的ROS生成。此外，经PCB126和BPA预处理的胰岛与对照组相比，胰岛素分泌显著减少，进一步证实了活性氧在损害胰腺β细胞生理功能并导致2型糖尿病（T2DM）发生中的重要作用。一旦掌握，若操作得当，胰腺胰岛的分离可在两小时内完成。在进行该操作时，重要的是使用梯度离心法将胰岛与其他胰腺碎片分离纯化。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，以探究化学物质对胰腺胰岛生理功能的影响等更多科学问题。该技术建立后，为毒理学领域的研究人员探索环境化学物对小鼠胰腺胰岛细胞致糖尿病潜力提供了可能。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离小鼠胰腺胰岛，并利用这些胰岛细胞进行鉴定。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠胰岛细胞筛选致糖尿病环境化学物质的研究

小鼠胰岛分离

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。...

Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

糖尿病研究领域面临的关键挑战是阐明调控胰岛β细胞复制的分子机制，并开发出促进β细胞再生的方法。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和评估小分子促进β细胞复制的活性。...

高内涵 体外 胰腺胰岛β细胞复制发现平台

我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。...

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

本研究建立了一种简化方法，可高效提取小鼠胰腺中的功能性原代胰岛细胞和腺泡细胞，为研究急性胰腺炎诱导糖尿病发病机制中的细胞间通讯提供了有价值的工具。...

一种从小鼠中同时分离原代胰岛和原代胰腺腺泡细胞的简便快速方法

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外...

采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

开发了一种针对热稳定性工程领域的新型定向进化方法，并在溶菌酶上得到了验证。经过仅一轮的随机诱变，获得的进化型溶菌酶PlyC...

一种用于定向进化耐热性溶菌酶的新筛选方法

学习小鼠胰岛细胞分离技术，用于筛选诱导活性氧产生的环境化学物质并评估其致糖尿病潜力。该方法支持体外分析化学物质对胰腺生理功能的影响。

用于筛选致糖尿病环境化学物的小鼠胰岛细胞筛选模型

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