Name: 黑色素瘤细胞衍生因子对骨髓脂肪分化的双重影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解黑色素瘤细胞衍生因子对骨髓脂肪细胞分化的双重影响。本研究建立二维共培养系统，揭示肿瘤微环境中细胞间相互作用机制，为骨转移研究提供新工具。

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我们感谢以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所 Dov Zipori 提供小鼠骨髓基质细胞系 14F1.1。本研究得到中国国家自然科学基金（编号：81771729）和重庆医科大学附属永川医院（编号：YJQN201330；YJZQN201527）资助。

注意：本方案中使用的所有细胞在从冻存细胞复苏后，应至少培养三代以上。
1. 收集黑色素瘤细胞来源的因子
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>获取B16F10细胞及小鼠黑色素瘤细胞系。 
		注：本实验所用小鼠黑色素瘤细胞系购自中国科学院干细胞库。</li>
		<li>配制B16F10细胞培养用完全培养基（100 mL）。使用含10%胎牛血清（FBS）、50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
		<li>配制无血清培养基用于B16F10细胞的饥饿处理（50 mL）。使用不含FBS、含50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的DMEM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备黑色素瘤条件培养基（CM）
	<ol>
		<li>在100 mm培养皿中加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，接种2.0 × 105个B16F10细胞，然后将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养24小时。</li>
		<li>当细胞融合度达到约80%时，吸除培养液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（1×，pH 7.4）洗涤细胞两次，然后更换为10 mL无血清培养基进行饥饿处理。</li>
		<li>将细胞放回培养箱继续培养18–24小时。</li>
		<li>饥饿处理结束后，用移液器收集条件培养基（CM），转移至新的50 mL离心管中。 
		注：条件培养基即B16F10细胞培养后的上清液。收集CM前需确保B16F10细胞状态良好。</li>
		<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸取上清液，转移至新的无菌管或无菌瓶中。 
		注：避免吸取管底沉淀物。</li>
		<li>为去除细胞碎片，使用连接注射器的0.45 µm滤器将CM过滤至无菌瓶或无菌管中。 
		注：使用0.22 µm滤器过滤CM效果更佳。</li>
		<li>将过滤后的上清液于-20 °C保存备用。 
		注：上清液在-20 °C保存不宜超过一个月。如需长期保存用于脂肪细胞分化实验，建议存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 由黑色素瘤细胞衍生因子诱导骨髓脂肪细胞
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>配制100 mL脂肪诱导培养基28使用完全DMEM培养基，添加5 µg/mL胰岛素、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1 µM地塞米松。4 °C保存，最多可存放两周。</li>
		<li>配制100 mL脂肪诱导维持培养基。使用完全DMEM或与50%黑色素瘤条件培养基混合，并添加5 µg/mL胰岛素。</li>
		<li>配制油红O储备液。将30 mg油红O粉末溶解于10 mL异丙醇（≥ 99.5%）中，充分涡旋混匀。 
		注意：在 4 °C 下保存，最长可保存 1 年。</li>
		<li>配制 Oil Red O 工作液。在通风橱中，将 Oil Red O 储存液（来自步骤 2.1.3）与去离子水按 3:2 的比例稀释。室温孵育混合液 15 分钟，使用前经 0.22 µm 滤膜过滤。 
		注意：新鲜配制的工作液须在2小时内使用完毕。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪细胞分化
	<ol>
		<li>培养小鼠骨髓基质细胞系14F1.129 在37 °C、5% CO₂培养箱中，于60 mm培养皿内用完全DMEM培养基培养至80%汇合度2. 
		注意：也可用原代骨髓来源的间充质细胞替代14F1.130.</li>
		<li>在培养箱中用1.5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞1–2分钟。</li>
		<li>加入5 mL含10% FBS的培养基至细胞中，使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后将细胞密度调整至约1–2 × 105/mL</li>
		<li>接种 5 × 104 每孔加入0.5 mL成脂诱导培养基，接种14F1.1细胞至24孔板中。培养两天后，细胞融合度达到约90%。 
		注意：此步骤非常关键。骨髓基质细胞必须在成脂诱导培养基中才能被诱导分化为脂肪细胞。</li>
		<li>移除诱导培养基，每次用1 mL PBS洗涤细胞，共洗涤两次。</li>
		<li>更换为1 mL成脂维持培养基，继续培养细胞直至脂肪细胞成熟。 
		注意：在显微镜下，脂肪细胞看起来像小或大的肥皂泡，非常容易辨认。通常，成熟的脂肪细胞在第6天出现th 或 8th 天</li>
		<li>用油红O染色成熟脂肪细胞，或收集脂肪细胞进行定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪细胞染色
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗已分化的 14F1.1 细胞 2 次，然后用 3.7% 多聚甲醛固定 1 小时。</li>
		<li>用60%异丙醇冲洗细胞，并使其完全干燥。</li>
		<li>向孔中加入0.2 mL Oil Red O工作液，在室温下孵育0.5至2小时。</li>
		<li>用清水洗涤细胞，以去除未结合的染料。</li>
		<li>在光学显微镜下拍摄染色的脂肪细胞照片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 黑色素瘤细胞与骨髓脂肪细胞的共培养
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>制备成熟的骨髓脂肪细胞：将14F1.1细胞在24孔板中使用脂肪诱导培养基诱导分化为成熟的骨髓脂肪细胞，持续2天，随后在脂肪维持培养基中继续培养6–8天。</li>
		<li>制备B16F10细胞：在60 mm培养皿中加入5 mL DMEM培养基培养B16F10细胞。</li>
		<li>润湿膜插件（例如 transwell）：向孔径为0.4 µm的膜插件中加入150 µL不含FBS的DMEM培养基，并将其浸入已装有500 µL不含FBS的DMEM培养基的24孔板孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共培养设置
	<ol>
		<li>缓慢吸去每个插件中的培养基。 
		注意：去除培养基时切勿破坏膜结构。</li>
		<li>将B16F10细胞（0/103/105/106）接种至步骤3.2.1中的0.4 µm孔径膜插件中。</li>
		<li>将步骤3.1.1中含成熟骨髓脂肪细胞的孔内脂肪维持培养基更换为600 µL完全DMEM培养基。</li>
		<li>将含有B16F10细胞的插件（来自步骤3.2.2）转移至含有成熟骨髓脂肪细胞的孔（来自步骤3.2.3）上，进行共培养实验。</li>
		<li>将共培养体系置于37 °C、5% CO2条件下孵育2天。</li>
		<li>孵育48小时后，移除共培养插件，然后用500 µL 1x PBS洗涤脂肪细胞两次。 
		注意：如有需要，可选择性收集插件中的B16F10细胞用于后续分析。</li>
		<li>使用油红O工作液对脂肪细胞进行染色，或收集脂肪细胞用于qPCR分析。 
		注意：染色步骤详见步骤2.3。</li>
		<li>在光学显微镜下拍摄染色后的脂肪细胞图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脂肪细胞特异性基因特征的qPCR分析
<ol>
	<li>在24孔板中每个待检测成熟脂肪细胞的孔中加入0.5 mL即用型RNA提取试剂。</li>
	<li>按照标准流程进行RNA提取和cDNA合成31。</li>
	<li>以18S和GAPDH的引物作为对照，CEBPα/β、PPARγ、FABP4、leptin、Pref-1或adiponectin的引物用于检测脂肪细胞特异性基因表达特征（表1）。</li>
	<li>在PCR仪中运行以下反应程序：95 °C预变性20 s，随后进行40个循环（95 °C变性1 s，60 °C退火延伸20 s）。</li>
	<li>采用2-ΔΔCt法计算基因表达的倍数变化32。</li>
</ol>

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<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

使用插入式共培养装置已广泛用于研究细胞间相互作用。二维共培养系统是观察两种细胞之间相互交流的有效方法。 体外，我们在此展示了癌细胞对骨髓脂肪细胞的两种不同驱动效应。许多实验室已采用该方法研究脂肪细胞与癌细胞之间的相互作用。6,12,27,39.
因此，通常情况下，二维共培养是研究细胞间相互作用最直接的方法。然而，在为后续研究准备未分化细胞系时，存在一些独特的挑战。在本方案中，骨髓基质细胞的健康状况和功能状态对脂肪细胞的分化至关重要。该方案可进行修改，将14F1.1细胞替换为原代骨髓间充质干细胞。此外，将14F1.1细胞在成脂诱导培养基中预孵育数天是另一个关键步骤。若缺少此预孵育步骤，骨髓基质细胞将无法分化为脂肪细胞，这一现象已在我们及其他研究者的实验中被观察到40...

骨转移在晚期癌症患者中十分常见，但目前尚无治愈性治疗方法。除了以脂肪形式储存能量的专有功能外，脂肪细胞还能支持肿瘤在骨髓及其他器官中的生长和转移1,2,3,4,5,6。此外，脂肪细胞在调控癌细胞生物学特性7,8,9,10 和代谢过程4,11,12,13,14,15,16 以及骨转移的发生发展方面也发挥着重要作用1,4,12。在骨髓微环境中，脂肪细胞还可影响癌细胞的生物学行为4,6,17。骨髓脂肪细胞与具有嗜骨特性的癌细胞之间的相互作用，对于理解骨转移机制具有重要意义，然而目前对此知之甚少。
根据目前的研究，多种方法已应用于脂肪细胞，包括二维或三维（2/3D）以及离体（ex vivo）培养体系17,18,19,20,21。最近，Herroon et al. 设计了一种新的三维培养方法，用于研究骨髓脂肪细胞与癌细胞之间的相互作用22。尽管三维共培养体系在模拟脂肪细胞与癌细胞在体内（in vivo）的生理相互作用方面具有优势，但其可重复性较差22,23。与二维共培养系统相比，三维共培养系统可能产生不同的细胞表型，例如细胞形态21,22,24,25,26。此外，分离的松质骨组织碎片的离体（ex vivo）培养可促使培养的骨髓细胞中脂肪细胞显著生长17。
然而，与上述这些先前的模型相比，二维细胞培养模型仍是一种经典、可靠且简便的技术，可用于快速筛选候选分子以及体外脂肪细胞或癌细胞中发生改变的表型in vitro1,4,6,12,15,27。 为了更深入地理解骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞之间的相互作用，本文提供了一种骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞二维共培养体系的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&amp;ndash;044</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室</td><td>Millipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL 移液器吸头</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

黑色素瘤细胞来源因子对骨髓脂肪细胞分化的双重作用

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

骨髓脂肪细胞与肿瘤细胞之间的相互作用可能在骨转移过程中发挥关键作用。目前有多种方法可用于研究这种重要的相互作用，但二维Transwell共培养系统仍是研究该相互作用的经典、可靠且简便的方法。本文提供了一项详细的操作方案，展示骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞的共培养过程。这种共培养系统不仅有助于研究骨髓脂肪细胞诱导的癌细胞信号转导，还可为未来揭示骨转移的分子机制提供支持，从而发现骨转移新的治疗靶点。

在骨髓中，脂肪细胞可能在肿瘤微环境的早期阶段出现1,13,33,34,35，通过分泌可溶性因子或激活破骨细胞生成来支持肿瘤进展6,12,36，尤其是在肥胖6,12和/或衰老37的背景下。我们之前的研究1指出，在黑色素瘤骨转移的早期阶段，骨髓脂肪细胞的数量会...

本文介绍了一种可靠且简便的二维（2D）共培养系统，用于研究肿瘤细胞与骨髓脂肪细胞之间的相互作用。该系统揭示了黑色素瘤细胞分泌因子对骨髓脂肪细胞分化具有双重作用，同时也为骨转移机制研究提供了一种经典方法。

骨髓脂肪细胞与肿瘤细胞之间的串扰可能在骨转移过程中发挥关键作用。多种方法……

该方法有助于回答骨转移研究领域中的关键问题，例如在癌症微环境中骨髓脂肪细胞的生长及其发育会发生哪些变化。该技术的主要优势在于操作简便，并且能够快速获得候选分子。该方法可为骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞之间的相互作用提供深入见解。该方法也可应用于其他细胞类型，例如成骨细胞。首先在100毫米培养皿中接种2 × 10⁵个B16F10黑色素瘤细胞，加入10毫升DMEM培养基（含10% FBS），于37°C、5% CO₂条件下培养24小时。次日，用5毫升PBS洗涤约80%融合的细胞培养物两次，每次洗涤使用5毫升PBS，随后在细胞培养箱中加入10毫升无血清培养基对细胞进行饥饿处理，持续18至24小时。第二天，使用移液器将条件培养基上清液转移至50毫升锥形管中进行离心，并将培养基装入配备0.45微米孔径滤器的注射器中。然后，将溶液过滤至无菌容器内，以去除任何残留的细胞碎片，并将条件培养基在-20摄氏度保存，最长可保存一个月。为诱导骨髓脂肪细胞，将小鼠F14 1.1骨髓基质细胞在60毫米培养皿中用完全DMEM培养基培养至80%融合度。在培养的适当阶段，于37摄氏度条件下，使用1.5毫升0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞1至2分钟。当细胞脱落后，加入5毫升含10%FBS的培养基以终止酶反应，并用新鲜的含血清培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁵至2×10⁵个细胞。在24孔板中，每孔接种5×10⁴个细胞，溶于0.5毫升成脂诱导培养基中，将细胞放回细胞培养箱继续培养2天，直至细胞融合度达到约90%。然后，每孔加入一毫升脂肪诱导维持培养基以替换上清液，并继续培养细胞直至脂肪细胞成熟。当细胞在光学显微镜下呈现从小到大的肥皂泡样形态时，用 PBS 洗涤成熟脂肪细胞两次，随后加入 0.2 毫升 3.7% 甲醛固定一小时。用 60% 异丙醇冲洗固定后的细胞，并将各孔完全晾干。向细胞中加入 0.2 毫升 Oil Red O 工作液，在室温下孵育 30 至 120 分钟，然后用水洗涤细胞以去除未结合的染料，随后通过光学显微镜观察脂肪细胞。或者，在细胞成熟后，向每个脂肪细胞培养孔中加入 0.5 毫升即用型 RNA 提取试剂，并使用相应的引物确认细胞的脂肪细胞特异性基因表达特征。然后，按照指定的程序在PCR仪中运行反应。为建立骨髓来源脂肪细胞与黑色素瘤细胞的共培养体系，首先向孔径为0.4微米的膜插件内室中加入150微升无血清DMEM培养基，并将每个插件放入含有500微升无血清培养基的24孔板的孔中。将80%融合度的B16F10黑色素瘤细胞用新鲜无血清培养基稀释至实验所需的适当浓度，并用含细胞的150微升培养基替换每个插件内室中的原有培养基。接着，将90%融合的成熟骨髓脂肪细胞培养物各孔中的脂肪诱导维持培养基上清液更换为600微升完全DMEM培养基，然后将含有黑色素瘤细胞的插件转移至成熟脂肪细胞培养板的各个孔中。当所有插入物转移完毕后，将培养板放入细胞培养箱中。两天后，取出插入物，每次用500 µL PBS洗涤每个孔的底部，共洗涤两次。然后，用油红O工作液对脂肪细胞进行染色，或按照所示方法通过定量PCR分析脂肪细胞的基因表达。在肿瘤条件培养基中分化的成熟脂肪细胞含有脂滴，因此可通过油红O染色轻松鉴定这些已分化的脂肪细胞。这些细胞的脂肪细胞特异性基因表达特征也可通过定量PCR加以确认。当脂肪细胞与大量黑色素瘤细胞共培养时，可观察到脂质储存减少，同时脂肪细胞表型发生去分化，表现为这些原本成熟的细胞中脂肪细胞特异性基因表达水平降低。观看本视频后，您应能够充分了解如何设计和建立二维共培养系统，以研究两种不同类型细胞之间的相互作用。

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癌症研究

黑色素瘤细胞衍生因子对骨髓脂肪分化的双重影响

本视频展示了骨髓基质细胞（BMSCs）向脂肪细胞的分化过程。该过程分为两步：在特定生长因子和激素存在下，未分化的BMSCs首先分化为前脂肪细胞；第二步通过葡萄糖和胰岛素处理，最终形成含有多个脂滴的成熟脂肪细胞。...

体外小鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞的分化

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。...

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞的反应。插入式共培养系统提供了一种简单的方法，可在无细胞间直接接触的情况下评估分泌的可溶性因子所介导的变化。...

一种非细胞接触式双细胞共培养插件系统的开发

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

评估脂肪生成分化的传统方法成本低廉且易于使用，但无法特异性检测基因表达的变化。我们开发了一种利用谱系特异性标记物来定量间充质细胞分化为成熟脂肪细胞的检测方法。该方法在基础研究和临床医学中具有广泛的应用前景。...

利用谱系特异性标记物对间充质细胞成脂分化潜能的可视化与定量分析

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

以下实验方案描述了一种利用基因工程小鼠模型，在小鼠背部皮肤中实现黑色素细胞肿瘤发生时空控制的方法。本方案详细说明了肉眼可见及显微镜下的皮肤黑色素瘤起始过程。...

由突变黑色素细胞干细胞启动小鼠黑色素瘤的空间与时间控制

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。...

稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了一种从黑色素瘤相关软脑膜病（M-LMD）患者脑脊液中分离循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）并进行扩增的实验方案，旨在建立用于研究M-LMD的临床前模型。...

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，VEGF-A，IGF信号通路，MAPK信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

了解黑色素瘤细胞衍生因子对骨髓脂肪细胞分化的双重影响。本研究建立二维共培养系统，揭示肿瘤微环境中细胞间相互作用机制，为骨转移研究提供新工具。

黑色素瘤细胞来源因子对骨髓脂肪细胞分化的双重作用

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