利用滴定ELISA法测定受体-配体相互作用解离常数的方法 关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

本滴定 ELISA 方法的总体目标是利用一种新型算法，以可重复且高效的方式确定两个结合配体之间的亲和常数。该方法不仅有助于解答蛋白质-配体相互作用和受体研究领域中的关键问题，也可应用于药物研究和药理学等生命科学应用领域。该技术的主要优势在于，可通过在 ELISA 板上用配体滴定受体，并结合一种新型评估算法，简便地测定受体-配体相互作用的亲和常数。

开始实验时，将整合素α2 A结构域的储备液用TBS氯化镁缓冲液稀释至终浓度为每毫升5微克。本实验将同时使用野生型和突变型整合素α2 A结构域。取半区微量滴定板的一整行，每孔加入50微升整合素α2 A结构域包被液。

每次滴定至少重复两次。本示例中，每行滴定设置四个重复。用封口膜密封酶标板，并于4°C过夜孵育。

次日，移除包被液，并向每孔中加入 15 微升 TBS 氯化镁缓冲液。移除洗涤液，再向孔中加入新的洗涤液。洗涤步骤将去除未通过物理吸附固定在塑料表面的可溶性受体分子。

下一步是向每个孔中加入50微升含1% BSA的TBS氯化镁缓冲液，以阻断非特异性结合位点。重新密封酶标板，并在室温下孵育1小时。在微孔板孔内用BSA封闭的同时，对配体Rhodocetin进行系列稀释。

本实验中，起始浓度为 243 微摩尔的釉质腐蚀罗得青素，稀释倍数为 2.3。针对本实验中的八条滴定曲线，需在 1% BSA 的 TBS 氯化镁溶液中，于 1 号试管中配制 920 微升最高浓度的罗得青素溶液。将 1% BSA 的 TBS 氯化镁溶液各 520 微升分别加入编号为 2 至 11 的其余十个试管中。

将400微升罗丹明结合蛋白（Rhodocetin）溶液从1号试管转移至2号试管。通过反复吹打混匀两种溶液，然后从此混合液中取出400微升转移至3号试管。继续进行系列稀释，直至11号试管。

为了确保本实验步骤的成功，必须迅速向每个孔中加入溶液，以防止孔壁干燥。在完成一小时的孵育后，移除微孔板各孔中的封闭液。立即向第一列各孔中加入50微升第一支试管中的Rhodocetin溶液，向第二列各孔中加入第二支试管中的溶液，并依次加至第十一列。

向第12列的孔中加入50 µL含1% BSA的TBS氯化镁溶液作为无配体对照。重新密封酶标板，并在室温下孵育1.5小时。为去除未结合的配体分子，移除结合溶液，并向每孔中加入50 µL HBS氯化镁缓冲液。

然后移除 HBS 缓冲液并加入新的 HBS 缓冲液。为了化学固定受体及其结合的配体，向微孔板的每个孔中加入 50 微升含 2.5% 戊二醛的 HBS 氯化镁缓冲液。将微孔板在室温下孵育 10 分钟。

通过移除固定液，并向每孔加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液，以去除并灭活过量的戊二醛。移除洗涤缓冲液，向每孔加入新的洗涤缓冲液。开始本检测时，从微孔板的所有孔中移除洗涤缓冲液，并向每孔加入 50 µL 一抗溶液，该溶液用含 1% BSA 的 TBS 氯化镁缓冲液按 1:2000 比例稀释。

重新密封酶标板，并在室温下孵育。吸去所有孔中的初级抗体溶液，每孔加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液。用 TBS 氯化镁缓冲液洗涤 3 次。

随后，向每个孔中加入 50 µL 二抗溶液，该溶液用含 1% BSA 的 TBS 氯化镁缓冲液按 1:2000 比例稀释。重新密封酶标板，并在室温下静置孵育。移除各孔中的二抗溶液，然后向每个孔中加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液。

洗涤三次。第三次洗涤后，将微孔板轻拍在纱布上，以去除所有残留液体。使用多通道移液器，立即向微孔板的每个孔中加入50 µL碱性磷酸酶检测试剂，尽可能同时启动酶促反应。

将酶标板在室温下孵育，直至最高配体浓度孔中的溶液变为黄色。根据信号强度，孵育时间可能在5分钟至1小时之间变化。使用多通道移液器按照碱性磷酸酶检测试剂的添加顺序，向每个孔中加入50 µL 1.5 M的氢氧化钠溶液，以终止磷酸酶底物的显色反应。

静置平板数分钟，以确保两种溶液充分混合且无划痕。使用酶标仪测定各孔在405纳米处的光密度。通过打开原始数据表格开始数据分析。

从 Excel 文件中复制各列，打开 Graph Pad Prism Five，在主菜单中新建项目文件，在“新建数据与图表”下选择 XY 格式。选择“为 Y 轴每个值输入并绘制单个数据点”的选项，并将数据分别作为 X 和 Y 值粘贴到 Graph Pad Prism 的数据表中。将 405 纳米处的光密度值转置为列格式。

在数据表中，第一列代表作为 X 值加入的配体浓度，右侧各列包含八条滴定曲线的信号值作为 Y 值。由于将绘制半对数图，因此删除最后一行，即配体未添加（浓度为零）对照组的信号值。Graph Pad Prism 将绘制出图形部分所示的曲线图。

对于 X 轴，选择半对数刻度。X 轴显示在 405 纳米处测得的以 OD 值表示的信号值。通过双击任意符号，可将其选中并以简单的形状和颜色标记。

野生型的滴定值用不同深浅的红色圆圈标出，而突变型的滴定信号则用蓝色方块标记。打开分析子程序，在“X Y 分析”中选择“非线性回归”选项，并点击“新建”按钮以创建新方程。将滴定曲线方程输入新打开的模板表格中，并定义适当的约束条件。

通过选择新创建的用户自定义方程来分析数据表中的数值。打开包含计算所得近似值的表格，该表格显示在软件屏幕左侧的结果部分下方。在此代表性的滴定 ELISA 微孔板中，碱性磷酸酶底物转化后呈现的黄色表明，结合的配体量随着添加的 Rhodocetin 浓度降低而减少。

未添加Rhodocetin的孔中缺乏颜色，表明背景信号较低。一种新型算法对405纳米波长下的光度定量原始数据进行处理，以计算信号随添加的Rhodocetin总浓度的变化关系。每种受体形式、类型及突变体的四条滴定曲线高度可重复，几乎完全重叠。

相比之下，两组滴定曲线明显分离。突变型α2A结构域的滴定曲线向更高的Rhodocetin浓度方向偏移，表明Rhodocetin与突变受体的结合亲和力较低。将八条滴定曲线的解离常数进行作图，并按α2A结构域的野生型和突变型分组。

Rhodocetin 与野生型 alpha 2 A 结构域结合的亲和常数为 5.80 ± 0.15 纳摩尔，而 Rhodocetin 与突变受体结合的亲和力显著降低，为 9.68 ± 0.18 纳摩尔。该技术一旦优化用于常规操作，可在六至七小时内完成。在进行此操作时，需注意戊二醛可能影响配体与受体的结合，并可能破坏配体的抗原表位，从而影响抗体的检测。

这必须事先进行测试。如果具备表面等离子共振设备，可采用SPR方法作为替代方案，但SPR是通过评估动力学数据来确定亲和常数。本滴定ELISA方法结合新型评估算法具有广泛适用性，例如可用于比较不同配体的亲和力，分析构效关系，并揭示蛋白质-配体相互作用的分子机制。

观看本视频后，您应能充分理解如何进行滴定 ELISA 以及如何实施这种新颖的评估算法，从而能够轻松、常规地确定任意蛋白质-配体相互作用的亲和常数，甚至可同时处理多个配体。请务必注意，使用戊二醛可能存在危险，因此在执行本方案的固定步骤时，必须始终采取安全措施，例如佩戴手套和护目镜。