Name: 滴定 ELISA 法测定受体配体相互作用的离解常数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 了解滴定ELISA法测定受体配体相互作用离解常数的新算法。该方法利用Integrin Alpha 2 A Domain与Rhodocetin结合实验，通过微孔板滴定和光密度测定实现高效数据分析，为蛋白质相互作用和药理学研究提供可靠工具。

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本方案和算法是在德国研究基金会（DFG 资助项目 SFB1009 A09 和 EB177/13-1）资助的项目中开发的。作者感谢 Barbara Schedding 和 Felix Schmalbein 提供的技术支持，以及 Niland 博士对稿件的审阅。

1. 储备溶液
<ol>
	<li>配制 100 mL 10x&#160;TBS pH 7.4 溶液：将 6.06 g TRIS 和 8.77 g NaCl 溶解于 90 mL 去离子水中，用 37% HCl 溶液调节 pH 至 7.4，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 100 mL 1 M HEPES/NaOH pH 7.4 溶液：将 23.83 g HEPES 溶解于 90 mL 去离子水中，用 1.5 M NaOH 调节 pH 至 7.4，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 100 mL 5 M NaCl 溶液：将 29.2 g NaCl 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 100 mL 1 M MgCl2 溶液：将 20.33 g MgCl2 · 6H2O 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 5% 热灭活 BSA 水溶液：在 50 mL 离心管中称取 2.5 g BSA（V 级，pH 7.0），溶于 45 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 50 mL，在 68 °C 水浴中加热 45 分钟，然后在冰浴中冷却，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制 25% 戊二醛水溶液。 
	注意：戊二醛吞食有害，吸入有毒，可引起灼伤。操作时需穿戴防护服、手套及眼/面部防护用具。</li>
	<li>按先前所述方法制备兔抗血清19。抗血清效价根据标准方案测定20。</li>
	<li>制备与碱性磷酸酶偶联的羊抗兔免疫球蛋白抗体。</li>
	<li>配制 100 mL 0.1 M 甘氨酸溶液：将 0.75 g 甘氨酸溶解于 90 mL 去离子水中，用 1.5 M NaOH 溶液调节 pH 至 10.4，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 100 mL 0.5 M Zn(II)-醋酸盐溶液：将 10.98 g Zn(II)-醋酸盐 · 2H2O 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
	<li>配制 100 mL 1.5 M NaOH 溶液：将 6.0 g NaOH 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。</li>
</ol>
2. 准备缓冲液和工作溶液
<ol>
	<li>取5 mL 10倍浓度的&#160;TBS（pH 7.4），加入45 mL去离子水中稀释，并加入100 µL 1 M MgCl2储备液。室温保存。该TBS缓冲液（pH 7.4，含2 mM MgCl2）用于受体的固定以及微孔板的洗涤。</li>
	<li>将10 mL 5%热灭活BSA水溶液与5 mL 10倍浓度的&#160;TBS（pH 7.4）用去离子水定容至50 mL，加入100 µL 1 M MgCl2储备液，充分混匀。置于冰上，后续实验可于-20 °C保存。注意每条滴定曲线需使用2.5 mL 1% BSA的TBS溶液（pH 7.4，含2 mM MgCl2）。</li>
	<li>取2.5 mL 1 M HEPES/NaOH（pH 7.4）和1.5 mL 5 M NaCl溶液，用去离子水稀释至50 mL，加入100 µL 1 M MgCl2溶液，充分混匀，配制50 mL HBS缓冲液（pH 7.4）：含50 mM HEPES/NaOH和150 mM NaCl。</li>
	<li>向5 mL 0.1 M甘氨酸溶液（pH 10.4）中加入5 µL 1 M MgCl2储备液和2 µL 0.5 M Zn(II)-乙酸盐储备液，配制碱性磷酸酶（AP）缓冲液（0.1 M甘氨酸溶液，pH 10.4，含1 mM MgCl2和0.2 mM Zn(II)-乙酸盐）。</li>
</ol>
3. 将受体（整合素α2A结构域）固定到微量滴定板上
<ol>
	<li>用 TBS 缓冲液（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）稀释整合素 α2A 结构域的储备液，使其终浓度为 5 µg/mL。 
	注意：包被溶液的体积为 650 µL，用于一个包含半区微孔板一整行 12 个孔的滴定曲线。</li>
	<li>向半区微孔板中每一行的各孔加入 50 µL/well 的 5 µg/mL 整合素 α2A 结构域包被溶液（野生型或突变型）。每个滴定行至少设置复孔（本示例中为四复孔）；参见 图 1 中微孔板的布局。</li>
	<li>用封口膜密封微孔板或盖上盖子，于 4 °C 过夜孵育。</li>
</ol>
4. 用 TBS（pH 7.4，2 mM MgCl2）将平板的包被孔洗涤两次
<ol>
	<li>为去除未通过物理吸附固定在塑料表面的可溶性受体分子，移除包被液，并向每孔中加入 50 µL TBS 缓冲液（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）。</li>
	<li>移除洗涤液，注意避免孔壁干燥。因此，切勿将微孔板倒置轻拍于纸巾上以去除残留液体。应使用多道移液器或单道移液器快速加液。</li>
	<li>重复上述洗涤步骤一次。</li>
</ol>
5. 封闭非特异性结合位点
<ol>
	<li>向每个孔中加入 50 µL TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）中的 1% BSA 溶液。</li>
	<li>用铝箔重新封住各孔，或盖上盖子。</li>
	<li>室温孵育 1 小时。 
	注意：本实验方案中的任何孵育步骤均可在摇床或振荡平台上进行，但此操作并非必需，且不会改变实验结果。</li>
</ol>
6. 配体蛇毒素的系列稀释制备
<ol>
	<li>改变豆蔻凝集素的起始浓度和系列稀释的稀释倍数，以获得合适的配体浓度范围，并记录具有最小和最大信号的完整滴定曲线。在本实验中，采用243 nM豆蔻凝集素作为起始浓度，稀释倍数为2.3。将豆蔻凝集素储备液稀释至系列稀释行中最高的配体浓度。对于每个稀释倍数为2.3的滴定曲线，准备115 µL的243 nM豆蔻凝集素溶液。即，15.2 µg/mL) 罗多青素（rhodocetin）溶液，溶于含 1% BSA 的 TBS 缓冲液（pH 7.4，2 mM MgCl₂）中2 在试管 #1 中。</li>
	<li>在 TBS（pH 7.4，2 mM MgCl₂）中加入 65 µL 的 1% BSA 溶液2 在10支标记为#2至#11的试管中。</li>
	<li>从1号试管中移取50 µL 罗丹明稀释液至2号试管中，通过反复吹打混匀两种溶液（总体积：115 µL；稀释倍数：1:2.3），然后从此混合液中移取50 µL至3号试管中 等等。</li>
	<li>继续此系列稀释至第11号试管。 
	注意：步骤 6.1 - 6.4 中给出的体积适用于一条滴定曲线。将这些体积乘以重复实验的次数。本实验中进行八条滴定曲线（两种 α2A 结构域形式的四重复），需准备以下体积：在 1 号试管中加入 920 µL 高浓度的 rhodocetin 溶液；520 µL 含 1% BSA 的 TBS 缓冲液（pH 7.4，2 mM MgCl₂）2 向第2至第11号每支试管中加入相应液体；每次转移体积为400 µL，从一支试管转移到下一支试管。</li>
</ol>
7. 配体（Rhodocetin）在不同浓度下与固定化受体（整合素 α2A 结构域）的结合
<ol>
	<li>使用真空管线从微量滴定板孔中移除封闭液。</li>
	<li>立即加入 50 µL 溶于含 1% BSA 的 TBS（pH 7.4/MgCl）中的 rhodocetin 溶液2 将1号试管的溶液加入第1列的各孔中，2号试管的溶液加入第2列的各孔中，等等。 加入50 µL含1% BSA的TBS（pH 7.4，2 mM MgCl₂）2 （封闭和稀释缓冲液）作为无配体对照加入第12列孔中（参见微量滴定板布局， 图1).</li>
	<li>用铝箔重新封住孔板或盖上盖子。</li>
	<li>在室温（约 20 - 22 °C）下孵育孔板 1.5 小时。</li>
</ol>
8. 用 HBS 缓冲液（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）洗涤平板孔两次
<ol>
	<li>为去除未结合的配体分子，移除结合溶液，并向每孔中加入 50 µL HBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）。随后，移除洗涤液。</li>
	<li>注意避免孔板变干。因此，切勿将微孔板扣在擦镜纸上以去除残留液体。应使用多道移液器或单道移液器快速加液。</li>
	<li>重复此洗涤步骤一次。</li>
</ol>
9. 使用含 2.5% 戊二醛的 HBS 缓冲液（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）固定受体结合的配体
<ol>
	<li>通过将1份25%戊二醛溶液与9份含2 mM MgCl2、pH 7.4的HBS溶液混合，配制新鲜的2.5%戊二醛溶液。</li>
	<li>向微孔板的每个孔中加入50 µL含2 mM MgCl2、pH 7.4的2.5%戊二醛HBS溶液。在室温下孵育微孔板10分钟。</li>
</ol>
10. 用 50 µL/孔的 TBS 缓冲液（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）洗涤板孔三次
<ol>
	<li>为去除并灭活过量的戊二醛，移除固定液后，向每孔加入 50 µL TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2），随后移除洗涤液。 
	注意：将含戊二醛的固定液从微量滴定板倒入培养皿中，并加入等体积的 TBS（pH 7.4）以灭活，待灭活完成后弃去固定液。</li>
	<li>注意避免孔板干燥。因此，切勿将微量滴定板倒置在纸巾上以吸除残留液体。应使用多通道移液器或分步移液器快速加液。</li>
	<li>重复此洗涤步骤两次。</li>
</ol>
11. 通过ELISA定量受体结合的配体
<ol>
	<li>在 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）中含 1% BSA 的溶液中，每孔加入 50 µL 一抗溶液。一抗溶液为针对 rhodocetin 制备的兔抗血清，用含 1% BSA 的 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）按 1:2,000 比例稀释19。</li>
	<li>室温孵育 75 - 90 分钟。用 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）每孔 50 µL 洗涤微孔板所有孔三次。在三次洗涤过程中，无需将微孔板轻敲至吸水纸上。</li>
	<li>在 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）中含 1% BSA 的溶液中，每孔加入 50 µL 二抗溶液。将碱性磷酸酶标记的抗兔 IgG 山羊抗体（即二抗）用含 1% BSA 的 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）按 1:2,000 比例稀释后使用。室温孵育 75 - 90 分钟。</li>
	<li>通过将一片含 5 mg 四水合对硝基苯磷酸二钠盐（磷酸酶底物）的片剂溶解于 5 mL AP 缓冲液（0.1 M 甘氨酸溶液，pH 10.4，含 1 mM MgCl2 和 0.2 mM 乙酸锌(II)）中，制备 AP 检测试剂。</li>
	<li>在进行下一步操作前，立即用 TBS（pH 7.4，含 2 mM MgCl2）每孔 50 µL 洗涤微孔板所有孔三次。最后一次洗涤后，将微孔板轻敲至吸水纸上，以彻底去除残留液体。</li>
	<li>向微孔板各孔中每孔加入 50 µL AP 检测试剂。为尽可能同步启动酶促反应，应迅速向所有孔中加入检测试剂，建议使用多通道移液器。</li>
	<li>室温孵育，直至配体浓度最高的孔中溶液变为黄色。 
	注意：孵育时间可能因信号强度不同而介于 5 分钟至 1 小时之间。</li>
	<li>通过每孔加入 50 µL 1.5 M NaOH 溶液终止磷酸酶底物的转化反应。静置数分钟，确保两种溶液充分混合且无条纹。为保证所有孔的孵育时间一致，应使用多通道移液器，并按照步骤 11.8 中加入 AP 检测试剂的相同顺序加入 1.5 M NaOH。</li>
	<li>使用 ELISA 读板仪测定各孔在 405 nm 处的光密度（OD）。</li>
</ol>
12. 滴定信号的评估
<ol>
	<li>使用 Excel 打开原始数据表，即 OD405nm 值。由于滴定曲线的信号值以行读取，需将其转置为一列，并在另一列中标注所添加配体的浓度。</li>
	<li>打开 GraphPad Prism 5（版本 5.0），在主菜单中新建一个项目文件。在 New data &amp;#38; graph 下选择 XY 格式，并为 Y 轴选择 Enter and plot a single point for each value 选项。</li>
	<li>从 Excel 文件中复制两列数据——所添加配体的浓度和信号值（OD405nm 值），并分别粘贴到 GraphPad Prism 的数据表中作为 X 和 Y 值。</li>
	<li>打开 GraphPad Prism 5 的 Analysis 子程序，在 XY-analysis 下选择 Non-linear regression 选项。选择 user-defined equation，然后点击 New button 创建新方程。</li>
	<li>在新打开的模板表格中输入滴定曲线方程：Y = (Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X))/(2*R)+Smin + B*X，其中 Y 表示信号值 S，X 表示所添加配体的浓度 L，R 表示固定化受体的浓度，K 表示解离常数，B 表示背景斜率。设定适当的约束条件，例如 K &#62;0 和 R &#62;0。 
	注意：该方程与 方程 9 的形式不同，但实质相同。</li>
	<li>使用新创建的自定义方程对数据表中的数值进行分析。打开软件界面左侧 Result 部分显示的计算所得近似参数表，查看 K、Rt、Smax、Smin 和 B 的数值。 
	注意：仅当滴定曲线包含至少 5 个数据点时，软件才能通过非线性回归的迭代拟合确定这 5 个参数。</li>
	<li>对每组滴定曲线的参数 K、Rt、Smax、Smin 和 B 进行统计学评估，并将这些参数与该组的特定特征（如配体或受体的突变或化学修饰）相关联。</li>
</ol>

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<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).</li>
<li>Pesquero, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+kinetic+parameter+estimation+of+the+affinity+interaction+of+jArtinM+and+rArtinM+with+peroxidase+glycoprotein+by+the+electrogravimetric+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).</li>
<li>Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+acquisition+and+analysis+of+microscale+thermophoresis+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data.</a> Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

滴定ELISA是一种多功能的检测系统，用于测定受体-配体相互作用的解离情况。由于滴定ELISA无需有效分离游离与结合的配体，也无需对其浓度进行定量分析，因此相比绘制结合曲线的方法，已有大量研究和文献采用了滴定ELISA。此外，滴定ELISA操作简便，且对受体和配体的用量要求相对较低。为了准确分析解离常数，必须使用高纯度的受体和配体样品。受体样品中若存在污染蛋白，会与受体竞争微孔板塑料表面的吸附位点。这些杂质虽不结合配体，但会减少可结合配体的受体数量，从而降低滴定ELISA的信号强度。如果受体样品的纯度无法进一步提高，可将针对该受体的抗体固定在微孔板上，通过封闭孔板后，从含有杂质的样品中捕获受体。然而，必须注意避免捕获抗体因抗体间的种属交叉反应而干扰后续使用一抗和二抗对结合配体的检测，或阻碍配体与受体的结合。
为了获得全面的数据集，建议以相互对应的方式进行滴定 ELISA 实验，即在一个实验中用作可溶性配体的分子，在另一个实验中作为受体固定在微孔板上，并用前一个实验中的受体（此时作为可溶性配体）进行滴定。这种方法通常效果良好，除非固定过程使其中一方的结合活性失活，或缺乏可用的检测工具...

解离常数 K 是描述受体（R）与其配体（L）之间亲和力的关键参数。根据质量作用定律，K 定义为受体-配体复合物 RL 解离为受体 R 和配体 L 的平衡状态：
<img alt="化学热力学中表示平衡常数 K 的公式示意图。" src="/files/ftp_upload/57334/57334eq1.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="公式 1">            公式 1
其中下标 f 表示受体和配体的游离/未结合状态。受体-配体复合物 RL 的浓度与受体结合的配体浓度 Lb 相同。由于受体的总浓度 Rt 等于游离受体 Rf 与配体结合受体 Rb = Lb 之和，解离常数也可表示为：
<img alt="静态平衡中弹簧常数 K 的公式；(Rt-Lb)·Lf/Lb 公式。" src="/files/ftp_upload/57334/57334eq2.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="公式 2">        公式 2
因此，饱和产率 Y 定义为结合配体 Lb 占受体总浓度 Rt 的分数，
<img alt="使用 Y=Lb/Rt 计算应变，力学物理方程，教学公式。" src="/files/ftp_upload/57334/57334eq3.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="方程 3">        方程 3
取决于游离配体 Lf 的浓度：
<img alt="Y方程，Lf除以K加Lf，表示用于研究计算的数学公式。" src="/files/ftp_upload/57334/57334eq4.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="方程 4">        方程 4
这种双曲线关系描述了受体-配体相互作用的结合曲线，其图像显示了结合配体Lb的浓度随游离配体Lf浓度变化的关系。从结合曲线中可推导出解离常数K，即在达到半最大饱和结合量时对应的游离配体浓度。此外，已有多种将结合曲线线性化的算法被建立，例如Klotz提出的双倒数作图法1,2，或Scatchard及Hanes转换法（由Bisswanger综述3）。然而，所有这些算法都存在一个共同问题：在结合曲线中，饱和结合量的最大值是当游离配体浓度很高时渐近趋近的，该值必须通过图形预评估进行估计，因此容易引入误差。
此外，确定结合曲线需要在结合平衡期间对游离配体和结合配体进行定量。为此，必须将游离配体与受体结合的配体分离并分别定量。因此，配体与受体必须在性质上有所区别，例如非蛋白质配体与蛋白质受体的组合。如果两个结合分子均为蛋白质，则它们必须在大小、电荷或其他分子特征上可区分。然而，在小规模结合实验中对配体浓度进行定量是一项困难的任务。通常需要对配体进行放射性标记，以检测低浓度的结合配体，尤其是在受体用量较大且难以获得或成本过高时。此外，受体结合的配体在分离过程中及之后可能发生不可忽略的解离。因此，需要采用复杂的方法，如平衡凝胶过滤4、毛细管电泳5和脉冲蛋白酶解6，以定量受体结合的配体并将其与游离配体分离。
与这些结合实验不同，滴定实验不需要对结合态和游离态配体进行定量分离。在此方法中，保持受体浓度恒定，逐步加入不同浓度的配体。配体与受体结合后，其结合态具有可与游离态配体区分并可被检测的生物物理特性，该特性可通过以下方式测量： 例如，光度法、荧光法或抗体检测。因此，信号S与饱和产率Y成正比，因而也与受体结合配体（Lb)，随所添加配体（L）的总浓度变化而被检测t）。信号S和添加配体的总浓度均可直接且更简便地定量，相较于结合态与游离态配体浓度的测定更为容易。特别是通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测受体结合的配体，可将样品体积减少至100 µL以下，并可在多孔微孔板中同时平行测定多个配体浓度。在滴定ELISA中，受体以相同浓度物理吸附于微孔板上，并用可溶性配体进行滴定。受体主要通过疏水吸附作用固定在塑料表面。固定化受体的表面浓度与受体包被浓度呈非线性关系，可能符合Langmuir吸附等温线。7除了吸附的受体分子总数外，其活性状态是滴定测定中的另一个重要参数。只有那些保持了配体结合活性的固定化受体才与滴定测定相关，并最终贡献于活性受体总数 Rt 滴定测定法中的该参数无法直接确定。
塑料表面未被固定受体覆盖的位点容易吸附其他蛋白质，例如配体。配体通过物理吸附结合到这些塑料表面位点时，会产生与受体结合配体相似的信号，但属于非特异性结合。为降低这种非特异性信号，需使用牛血清白蛋白（BSA）封闭尚未包被蛋白质的微孔板塑料表面位点。然而，在某些受体-配体滴定实验中，仍可能观察到非特异性背景信号，此时建议采用其他封闭剂，如0.2%明胶溶液或0.04%吐温20（Tween 20）溶液。
配体与受体结合后，通过两次洗涤步骤去除未结合的游离配体。结合态的配体仍与固定在微孔板塑料表面的受体保持结合，并可选择性地通过化学固定加以强化。为了后续使用戊二醛对结合配体与固定化受体进行共价交联，需将缓冲液TRIS替换为HEPES，此替换不影响配体结合。与TRIS不同，HEPES不会使戊二醛失活。戊二醛的共价交联可将结合的配体与其受体共价固定，防止其在后续的洗涤和孵育步骤中解离。因此，受体-配体相互作用被化学“冻结”，从而确保滴定曲线不受后续洗涤和孵育步骤的影响。然而，戊二醛固定可能会以某种方式化学修饰配体和受体，导致其相互作用减弱或完全消失。此外，配体内部表位的修饰可能改变检测抗体的结合亲和力，尤其是在使用单克隆抗体定量结合配体时。尽管在此滴定ELISA中未出现戊二醛固定的上述不良影响，但在进行滴定实验前，必须针对每一种受体-配体相互作用测试该检测方法对戊二醛的敏感性。固定完成后，通过含TRIS缓冲液的三次洗涤步骤去除多余的戊二醛。TRIS可灭活残留的醛基，避免其在后续步骤中非特异性地与检测抗体发生反应。
结合配体的量通过酶联抗体进行定量，从而产生光度ELISA信号S。该信号被绘制为每孔中加入的总配体浓度Lt的函数。尽管滴定曲线更容易获得，但它并不像结合曲线那样呈双曲线函数。此外，如何从滴定曲线计算解离常数K仍不明确。虽然Stockell8和Heyn与Weischet9已分别报道了用于线性化光谱测定滴定曲线的算法，但由于这些方法在估计高配体浓度下饱和状态所趋近的最大信号值时存在不确定性，因而存在不足。
本文描述了一种滴定ELISA方法和非线性回归算法，用于从滴定曲线中推导受体与配体相互作用的解离常数K。该方案以整合素α2β1的胶原结合A结构域与一种蛇毒来源抑制剂之间的相互作用为例进行说明。整合素是一类细胞黏附分子，介导细胞与周围细胞外基质或基底膜的锚定10,11。此外，整合素通过募集额外的信号分子并在细胞-基质相互作用时形成新的细胞器——黏着复合体（adhesomes），在细胞与细胞外基质之间传递重要信号12,13,14。胶原是α2β1整合素的配体，是人体中最丰富的蛋白质，也是结缔组织中关键的支架成分15。α2β1整合素与胶原的相互作用由整合素α2亚基的A结构域介导。整合素α2A结构域含有一个二价阳离子，该离子对胶原结合至关重要，并可稳定其结构。野生型以及α2A结构域的突变体（例如将表面暴露的Y216残基替换为甘氨酸的突变体）均可在原核表达系统中重组表达，并通过其寡组氨酸标签（oligo-His-tag）使用NiNTA superflow柱进行纯化，随后在含2 mM MgCl2的TRIS缓冲盐水（TBS；50 mM TRIS/HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）中透析16。蛋白浓度通过双辛可宁酸法（BCA）测定，纯度通过常规SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝R250（Coomassie-Brilliant Blue R250）染色进行检测。
α2β1整合素与胶原蛋白之间的相互作用可被马来亚腹蛇（Malayan pit viper）蛇毒组分rhodocetin的结合所阻断Calloselasma rhodostoma)16,17在该滴定ELISA中用作可溶性配体的锯鳞蛇毒蛋白rhodocetin，按照先前所述方法从粗毒中纯化获得16溶于HEPES缓冲盐水（HBS；10 mM HEPES/NaOH，pH 7.4，150 mM NaCl）中，于-20 °C冷冻保存。其浓度通过BCA法测定，纯度经SDS-PAGE验证。作为拮抗剂，rhodocetin不仅可阻断胶原与整合素α2β1 A结构域的结合，还能稳定整合素的非活性构象，从而阻止胶原向细胞或血小板传递任何信号。18测定豆蔻素与其受体靶标的解离常数在生物医学上具有重要意义，有助于揭示其分子作用机制及药物开发潜力 例如，作为一种抗血栓剂。为此，本文描述了一种滴定ELISA方法及其评估，该方法适用于几乎所有具有1:1相互作用化学计量的受体-配体相互作用。

<table><tbody><tr><td>TRIS</td><td>neoFrox</td><td>1125KG001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Applichem</td><td>1,316,591,214</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>172571</td><td></td></tr><tr><td>整合素 a2A，野生型与突变型，重组蛋白</td><td></td><td>由作者实验室分离</td><td></td></tr><tr><td>NiNTA superflow 柱&amp;nbsp;</td><td>Qiagen，德国</td><td>30821</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R250</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸法（BCA）蛋白浓度测定试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第 V 组分</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛溶液</td><td>Merck</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔免疫球蛋白抗体，碱性磷酸酶标记</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9919</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Applichem</td><td>A1377</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锌（Zn(II)）</td><td>Applichem</td><td>A4324</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Applichem</td><td>A1551</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶底物片剂（5 mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0942</td><td></td></tr><tr><td>Costar 半面积微孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>Corning 3690</td><td></td></tr><tr><td>微量反应管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（微孔板 ELISA 读板仪）</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr></tbody></table>

利用滴定elisa法测定受体-配体相互作用解离常数的方法

关键词：elisa，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

解离常数描述了结合平衡中两个结合伙伴之间的相互作用，是衡量它们亲和力的指标。它是比较不同配体的关键参数， 例如，竞争性抑制剂、蛋白质亚型及突变体与其结合伴侣的结合强度。通过绘制结合浓度曲线来确定解离常数 与 游离配体的结合曲线。相比之下，滴定曲线更容易记录，该曲线以与结合配体浓度成正比的信号对所加入配体的总浓度作图。该信号可通过光谱学方法和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。本文以一项滴定ELISA方案为例，用于检测蛇毒来源的rhodocetin与其固定化的α2β1整合素靶结构域之间的结合。滴定ELISA具有高度通用性且被广泛应用。只要两种相互作用的蛋白质均为纯品且浓度已知，即可将其分别作为固定化受体和可溶性配体使用。迄今为止的难点在于如何从滴定曲线中确定解离常数。本研究引入了描述滴定曲线的数学函数，该算法无需依赖易产生误差的饱和信号图解估算，可直接通过非线性回归对原始数据（在不同配体浓度下的信号强度）进行数学分析。因此，可同时记录多条滴定曲线，并将其转化为一组特征参数，包括解离常数和具有结合活性的受体浓度，并可进行统计学评估。结合该算法后，滴定ELISA具备了直接提供解离常数的优势，未来可更高效地被应用。

ELISA 反应完成后，碱性磷酸酶底物转化为黄色的对硝基酚盐（para-nitrophenolate），其颜色深浅表明：随着第 1 至第 11 列中加入的 rhodocetin 浓度降低，结合的 rhodocetin 配体量也随之减少（图 1）。第 12 列未添加 rhodocetin 的孔中溶液无色，显示背景信号较低。
在 405 nm 处进行光度定量可获得数据，这些数据可直接输入分析软件，通过非线性回归和公式 9对每条滴定曲线的原始数据进行拟合，并计算信号 S（即 OD405nm）作为加入的 rhodocetin 配体总浓度 Lt 的函数（图 2）。每种受体形式（野生型和突变型）的四条滴定曲线高度可重复，几乎完全重叠。与组内变异较小形成对比...

本文描述了一种进行滴定ELISA的详细实验方案。此外，还提出了一种新颖的算法，用于评估滴定ELISA结果，并获得可溶性配体与微孔板固定化受体结合的解离常数。

利用滴定ELISA法测定受体-配体相互作用解离常数的方法

关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

解离常数描述了结合平衡中两个结合伙伴之间的相互作用，是衡量它们亲和力的指标。它是一个关键的……

本滴定 ELISA 方法的总体目标是利用一种新型算法，以可重复且高效的方式确定两个结合配体之间的亲和常数。该方法不仅有助于解答蛋白质-配体相互作用和受体研究领域中的关键问题，也可应用于药物研究和药理学等生命科学应用领域。该技术的主要优势在于，可通过在 ELISA 板上用配体滴定受体，并结合一种新型评估算法，简便地测定受体-配体相互作用的亲和常数。开始实验时，将整合素α2 A结构域的储备液用TBS氯化镁缓冲液稀释至终浓度为每毫升5微克。本实验将同时使用野生型和突变型整合素α2 A结构域。取半区微量滴定板的一整行，每孔加入50微升整合素α2 A结构域包被液。每次滴定至少重复两次。本示例中，每行滴定设置四个重复。用封口膜密封酶标板，并于4°C过夜孵育。次日，移除包被液，并向每孔中加入 15 微升 TBS 氯化镁缓冲液。移除洗涤液，再向孔中加入新的洗涤液。洗涤步骤将去除未通过物理吸附固定在塑料表面的可溶性受体分子。下一步是向每个孔中加入50微升含1% BSA的TBS氯化镁缓冲液，以阻断非特异性结合位点。重新密封酶标板，并在室温下孵育1小时。在微孔板孔内用BSA封闭的同时，对配体Rhodocetin进行系列稀释。本实验中，起始浓度为 243 微摩尔的釉质腐蚀罗得青素，稀释倍数为 2.3。针对本实验中的八条滴定曲线，需在 1% BSA 的 TBS 氯化镁溶液中，于 1 号试管中配制 920 微升最高浓度的罗得青素溶液。将 1% BSA 的 TBS 氯化镁溶液各 520 微升分别加入编号为 2 至 11 的其余十个试管中。将400微升罗丹明结合蛋白（Rhodocetin）溶液从1号试管转移至2号试管。通过反复吹打混匀两种溶液，然后从此混合液中取出400微升转移至3号试管。继续进行系列稀释，直至11号试管。为了确保本实验步骤的成功，必须迅速向每个孔中加入溶液，以防止孔壁干燥。在完成一小时的孵育后，移除微孔板各孔中的封闭液。立即向第一列各孔中加入50微升第一支试管中的Rhodocetin溶液，向第二列各孔中加入第二支试管中的溶液，并依次加至第十一列。向第12列的孔中加入50 µL含1% BSA的TBS氯化镁溶液作为无配体对照。重新密封酶标板，并在室温下孵育1.5小时。为去除未结合的配体分子，移除结合溶液，并向每孔中加入50 µL HBS氯化镁缓冲液。然后移除 HBS 缓冲液并加入新的 HBS 缓冲液。为了化学固定受体及其结合的配体，向微孔板的每个孔中加入 50 微升含 2.5% 戊二醛的 HBS 氯化镁缓冲液。将微孔板在室温下孵育 10 分钟。通过移除固定液，并向每孔加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液，以去除并灭活过量的戊二醛。移除洗涤缓冲液，向每孔加入新的洗涤缓冲液。开始本检测时，从微孔板的所有孔中移除洗涤缓冲液，并向每孔加入 50 µL 一抗溶液，该溶液用含 1% BSA 的 TBS 氯化镁缓冲液按 1:2000 比例稀释。重新密封酶标板，并在室温下孵育。吸去所有孔中的初级抗体溶液，每孔加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液。用 TBS 氯化镁缓冲液洗涤 3 次。随后，向每个孔中加入 50 µL 二抗溶液，该溶液用含 1% BSA 的 TBS 氯化镁缓冲液按 1:2000 比例稀释。重新密封酶标板，并在室温下静置孵育。移除各孔中的二抗溶液，然后向每个孔中加入 50 µL TBS 氯化镁缓冲液。洗涤三次。第三次洗涤后，将微孔板轻拍在纱布上，以去除所有残留液体。使用多通道移液器，立即向微孔板的每个孔中加入50 µL碱性磷酸酶检测试剂，尽可能同时启动酶促反应。将酶标板在室温下孵育，直至最高配体浓度孔中的溶液变为黄色。根据信号强度，孵育时间可能在5分钟至1小时之间变化。使用多通道移液器按照碱性磷酸酶检测试剂的添加顺序，向每个孔中加入50 µL 1.5 M的氢氧化钠溶液，以终止磷酸酶底物的显色反应。静置平板数分钟，以确保两种溶液充分混合且无划痕。使用酶标仪测定各孔在405纳米处的光密度。通过打开原始数据表格开始数据分析。从 Excel 文件中复制各列，打开 Graph Pad Prism Five，在主菜单中新建项目文件，在“新建数据与图表”下选择 XY 格式。选择“为 Y 轴每个值输入并绘制单个数据点”的选项，并将数据分别作为 X 和 Y 值粘贴到 Graph Pad Prism 的数据表中。将 405 纳米处的光密度值转置为列格式。在数据表中，第一列代表作为 X 值加入的配体浓度，右侧各列包含八条滴定曲线的信号值作为 Y 值。由于将绘制半对数图，因此删除最后一行，即配体未添加（浓度为零）对照组的信号值。Graph Pad Prism 将绘制出图形部分所示的曲线图。对于 X 轴，选择半对数刻度。X 轴显示在 405 纳米处测得的以 OD 值表示的信号值。通过双击任意符号，可将其选中并以简单的形状和颜色标记。野生型的滴定值用不同深浅的红色圆圈标出，而突变型的滴定信号则用蓝色方块标记。打开分析子程序，在“X Y 分析”中选择“非线性回归”选项，并点击“新建”按钮以创建新方程。将滴定曲线方程输入新打开的模板表格中，并定义适当的约束条件。通过选择新创建的用户自定义方程来分析数据表中的数值。打开包含计算所得近似值的表格，该表格显示在软件屏幕左侧的结果部分下方。在此代表性的滴定 ELISA 微孔板中，碱性磷酸酶底物转化后呈现的黄色表明，结合的配体量随着添加的 Rhodocetin 浓度降低而减少。未添加Rhodocetin的孔中缺乏颜色，表明背景信号较低。一种新型算法对405纳米波长下的光度定量原始数据进行处理，以计算信号随添加的Rhodocetin总浓度的变化关系。每种受体形式、类型及突变体的四条滴定曲线高度可重复，几乎完全重叠。相比之下，两组滴定曲线明显分离。突变型α2A结构域的滴定曲线向更高的Rhodocetin浓度方向偏移，表明Rhodocetin与突变受体的结合亲和力较低。将八条滴定曲线的解离常数进行作图，并按α2A结构域的野生型和突变型分组。Rhodocetin 与野生型 alpha 2 A 结构域结合的亲和常数为 5.80 ± 0.15 纳摩尔，而 Rhodocetin 与突变受体结合的亲和力显著降低，为 9.68 ± 0.18 纳摩尔。该技术一旦优化用于常规操作，可在六至七小时内完成。在进行此操作时，需注意戊二醛可能影响配体与受体的结合，并可能破坏配体的抗原表位，从而影响抗体的检测。这必须事先进行测试。如果具备表面等离子共振设备，可采用SPR方法作为替代方案，但SPR是通过评估动力学数据来确定亲和常数。本滴定ELISA方法结合新型评估算法具有广泛适用性，例如可用于比较不同配体的亲和力，分析构效关系，并揭示蛋白质-配体相互作用的分子机制。观看本视频后，您应能充分理解如何进行滴定 ELISA 以及如何实施这种新颖的评估算法，从而能够轻松、常规地确定任意蛋白质-配体相互作用的亲和常数，甚至可同时处理多个配体。请务必注意，使用戊二醛可能存在危险，因此在执行本方案的固定步骤时，必须始终采取安全措施，例如佩戴手套和护目镜。

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