Name: 优化结构静电纺丝血管移植在大鼠模型中的植入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习优化静电纺丝技术制备聚己内酯血管移植物，并在大鼠腹主动脉模型中评估其长期植入性能与血管再生效果。该方法具有良好的可重复性和高动物存活率。

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本工作受到国家自然科学基金项目（81522023、81530059、91639113、81772000、81371699 和 81401534）的资助。

实验动物的使用已获得南开大学动物实验伦理委员会的批准，并按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行。
1. 静电纺丝PCL移植物的制备
注意：本研究采用静电纺丝技术制备血管移植物。
<ol>
	<li>分别将PCL溶于甲醇与氯仿的混合溶剂（体积比1:5）中，配制25 wt%和10 wt%的PCL溶液，在室温下搅拌12小时。</li>
	<li>将PCL溶液装入10 mL玻璃注射器中。</li>
	<li>在注射器上安装21号针头。</li>
	<li>将不锈钢芯轴（直径2 mm，长度25 cm）固定在收集装置上。</li>
	<li>制备粗纤维移植物时，采用25 wt%的PCL溶液，针尖至收集器的工作距离为17 cm，流速为8 mL/h，电压为11 kV；制备细纤维移植物时，采用10 wt%的PCL溶液，针尖至收集器的工作距离为20 cm，流速为2 mL/h，电压为18 kV。</li>
	<li>将制得的移植物置于真空环境中过夜，以去除残留溶剂。&#160;操作前对所有器械进行灭菌，并在整个过程中保持无菌操作技术。</li>
	<li>植入前，将移植物浸入10 mL 75%乙醇中消毒30分钟，随后置于紫外光下照射过夜。</li>
	<li>纤维与孔径尺寸测量：利用ImageJ软件，基于扫描电子显微镜（SEM）图像计算平均纤维直径。</li>
	<li>支架的力学性能测试：
	<ol>
		<li>使用剃刀将管状支架切割成3 mm长的片段，并用千分尺测量支架厚度。</li>
		<li>将管状支架固定于载荷能力为100 N的拉伸试验机上。</li>
		<li>以夹具间距1 mm，以10 mm/min的速率沿纵向进行拉伸，直至断裂；记录断裂时的抗拉强度和最大断裂伸长率；根据应力-应变曲线初始线性区域（应变不超过5%）计算杨氏模量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠腹主动脉移植模型
注意：手术中使用的所有材料和器械均为无菌。手术过程中，操作者须佩戴纱布口罩和无菌手套，以避免感染。确保室温维持在 27 - 30 °C，以保持动物体温。有关镇痛处理，请遵循当地 IACUC 指南。&#160;
<ol>
	<li>选用体重为 240 - 270 g 的雄性 Sprague Dawley 大鼠作为血管移植物受体。术前确保大鼠已禁食 24 小时。&#160;禁食 24 小时的目的是充分排空肠道内的粪便，从而扩大术者视野。&#160;&#160;</li>
	<li>抓住大鼠背部颈部并使其头部朝下，将注射针插入下腹部腹腔内，通过腹腔注射水合氯醛（330 mg/kg）诱导麻醉。</li>
	<li>确认大鼠肌肉松弛、呼吸平稳，表明麻醉充分。将大鼠仰卧位置于手术显微镜下。</li>
	<li>在眼睛上涂抹凡士林眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。术前通过尾静脉注射肝素化生理盐水溶液（50 UI/mL）给予抗凝处理（100 UI/kg）。</li>
	<li>使用刀片剃除腹前壁的毛发，并用碘溶液和医用酒精溶液清洁皮肤。</li>
	<li>使用手术剪沿腹中线行腹壁切口，确保切口长度约为 4 - 5 cm，随后暴露腹腔。</li>
	<li>用生理盐水浸湿的纱布牵开并包裹肠道。</li>
	<li>仔细解剖腹主动脉。</li>
	<li>使用 9-0 单股尼龙缝线结扎所有细小分支。</li>
	<li>使用两个血管夹夹闭腹主动脉的一段隔离区域（长度不超过 1 cm）。&#160;主动脉夹闭时间可维持 20-30 分钟。</li>
	<li>使用显微剪在两个血管夹之间横断腹主动脉，以形成吻合口。</li>
	<li>用肝素化生理盐水溶液（50 UI/mL）冲洗主动脉两端，以清除残留血液。</li>
	<li>使用显微剪剥离外膜。</li>
	<li>将内径为 2 mm、长度为 1 cm 的移植物，采用 9-0 单股尼龙缝线以“8”字缝合法与大鼠腹主动脉进行端端吻合。</li>
	<li>首先在近端吻合口按 9 点、3 点、12 点和 6 点位置顺序完成四个定点缝合，然后在两定点之间以 4 针连续缝合切缘。近端缝合完成后，以相同方法缝合远端。 
	注意：每一针均需确保宿主动脉侧壁轻微嵌入移植物内。</li>
	<li>先松开远端血管夹，使血液流入移植物，随后松开近端血管夹。</li>
	<li>使用无菌棉球或小块纱布按压缝合口末端以止血，持续按压约 3 分钟，直至实现止血。</li>
	<li>将肠道复位至腹腔内。</li>
	<li>使用含庆大霉素（320 U/mL）的温生理盐水冲洗腹腔。</li>
	<li>分别使用 3-0 尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层，关闭腹壁切口。</li>
	<li>将大鼠放入清洁干燥的笼子中，并在笼下放置加热垫以维持动物体温；等待大鼠从麻醉中恢复。需持续照看动物，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。</li>
	<li>意识恢复后，将大鼠单独饲养于笼中，提供食物和饮水。术后在伤口处涂抹碘液以预防感染&#160;。待其完全恢复后，再将其与其他动物合笼饲养。</li>
	<li>根据机构指南，在预定时间点对大鼠实施安乐死。</li>
</ol>

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<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
<li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-organized+neointima+of+large-pore+poly%28L-lactic+acid%29+vascular+graft+coated+with+poly%28L-lactic-co-epsilon-caprolactone%29+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly%28L-lactic+acid%29+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li>
</ol>

作者没有相互冲突的财务利益。

细胞浸润对于血管移植物的再生和重塑至关重要 体内16细胞浸润有限通常与移植物孔径相对较小有关，这些小孔会阻碍细胞向移植物管壁内迁移。为解决这一难题，我们开发了一种改良方法，用于制备具有大孔结构的静电纺PCL血管移植物。具体而言，纤维厚度可通过工艺参数便捷调控，而孔径大小随纤维厚度增加而增大。结果表明，宿主细胞可轻松浸润进入这种大孔移植物的管壁中 体内 植入后12个月，细胞密度仍保持在较高水平，且无明显细胞退化。
天然动脉主要由三层结构组成，即内皮层、中膜层和外膜层。内皮层作为抗血栓形成的界面，在维持血管长期通畅性方面发挥着至关重要的作用。在本研究中，移植物在植入3个月后观察到完全内皮化。此外，由多层平滑肌细胞构成的中膜层在调节血管功能以及提供动脉适当的机械性能方面具有重要意义。本研究表明，采用粗纤维和大孔结构的静电纺PCL移植物显著促进了功能性中膜层的再生。而且，再生的平滑肌结构与天然中膜层相似。免疫荧光染色显示，多层MYH+细胞分布于弹性蛋白网络中，呈现出平滑肌细胞环向排列的...

由合成聚合物制成的血管移植物在临床上被广泛用于治疗心血管疾病（CVDs）。然而，对于小直径血管移植物（D &#60;6 mm）而言，由于血流速度降低导致通畅率较低，常引发血栓形成、内膜增生及其他并发症，目前尚无成功的产品可用1。
组织工程提供了一种基于支架引导的血管再生与重建来实现长期通畅性和稳态的替代策略。具体而言，作为三维模板的血管移植物可在血管组织再生过程中提供机械支撑和结构引导，并影响细胞功能，包括细胞黏附、迁移、增殖以及细胞外基质的分泌2。迄今为止，已有多种合成聚合物被评估用于血管组织工程。在这些聚合物中，聚(ε-己内酯)（PCL）因具有良好的细胞相容性以及从数月到两年不等的缓慢降解特性而被广泛研究3。在大鼠主动脉模型中4,5,6，通过静电纺丝制备的PCL血管移植物表现出优异的结构完整性和通畅性，并在植入后6个月内持续观察到移植物管壁中细胞浸润和新生血管的增加。然而，在更长时间点（长达18个月）也观察到了不良的组织重塑现象，包括细胞和毛细血管的退化以及钙化。
血管移植物的细胞化是决定组织再生与重塑的关键因素7静电纺丝作为一种多功能技术，已被广泛用于制备具有纳米纤维结构的血管移植物8然而，静电纺丝血管移植物通常具有相对较小的孔隙结构，导致细胞浸润不足，从而限制了后续的组织再生。为解决这一问题，已尝试多种技术以增大孔径和整体孔隙率，包括盐/聚合物沥滤法9,10，收集装置的改造，激光辐射的后续处理11, 等等事实上，电纺支架的结构（包括纤维直径、孔径和孔隙率）与加工条件密切相关。12,13在静电纺丝过程中，可通过改变聚合物溶液浓度、流速、电压等参数便捷地调控纤维直径。 等等.14,15因此，孔径和孔隙率已相应提高。
我们近期报道了一种具有大孔结构的改良型PCL静电纺丝移植物（纤维直径为5 - 7 µm，孔径为30 - 40 µm）。体内实验通过替换大鼠腹主动脉进行植入，术后3个月显示移植物通畅率高，并具有良好的内皮化和平滑肌再生。更重要的是，即使在植入一年后，也未观察到包括钙化和细胞退化在内的任何不良组织重塑现象16。

<table><tbody><tr><td>聚(&amp;epsilon;-己内酯)（PCL）颗粒（M&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;=80,000)</td><td>Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>天津化学试剂公司</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>天津化学试剂公司</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>天津化学试剂公司</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>天津丰川公司</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley大鼠</td><td>军事医学科学院实验动物中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>河北天成药业公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>天津瑞金特化学公司</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠注射液</td><td>天津生物化学制药公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素注射液</td><td>江苏涟水制药有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;alpha;-肌动蛋白α-平滑肌（α-SMA）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗平滑肌肌球蛋白重链初级抗体</td><td>Abcam</td><td>ab683</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗大鼠弹性蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>兔抗血管性血友病因子一抗</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（Alexa Fluor 488）</td><td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488）</td><td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% 正常山羊血清</td><td>中山金桥</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>苏木精和伊红（H&amp;amp;E)</td><td>北京雷根生物科技</td><td>DH0006</td><td></td></tr><tr><td>马松三色染色</td><td>北京雷根生物科技</td><td>DC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-范吉森（VVG）</td><td>北京雷根生物技术有限公司</td><td>DC0059</td><td></td></tr><tr><td>冯科萨染色</td><td>北京雷根生物科技</td><td>DS0003</td><td></td></tr><tr><td>带3-0号丝线的外科缝合针</td><td>上海金环医疗用品有限公司</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>带线9-0丝线手术缝合针</td><td>上海金环医疗用品有限公司</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

在大鼠模型中植入具有优化结构的静电纺丝血管移植物

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

本文介绍了一种制备大孔结构PCL血管移植物的方案，并描述了利用大鼠腹主动脉置换模型进行评估的实验方法。电纺血管移植物通常孔径较小，限制了细胞向移植物内部的迁移，阻碍了新生动脉的再生与重塑。本研究采用改进的加工技术，制备出纤维较粗（5 - 6 µm）且孔径较大（约30 µm）的PCL血管移植物。通过在大鼠腹主动脉模型中植入移植物，评估其长期性能。超声分析显示，即使在植入12个月后，移植物仍保持通畅，未出现动脉瘤或狭窄。大孔结构促进了细胞长入，从而在3个月时即观察到组织再生。更重要的是，在植入12个月后，移植物管壁内未见钙化等不良重塑迹象。因此，经改进的大孔结构电纺PCL血管移植物具有作为长期植入动脉替代物的潜力。

PCL 移植物在术后 3 个月和 12 个月被取出，并采用标准组织学技术进行苏木精和伊红（H&E）染色分析&amp;E)、Masson 三色染色、Verhoeff-van Gieson (VVG) 染色、Von Kossa 染色，以及 α-SMA、MYH、vWF 和弹性蛋白的免疫荧光染色。组织学图像采用正置显微镜拍摄，免疫荧光图像采用荧光显微镜拍摄。
所有数据均以均值 ± 标准差表示。采用双尾配对 Student t 检验进行差异比较。当 p &lt; 0.05 时，认为差异具有统计学意义。
本研究成功制备了结构优化的新型静电纺PCL移植物，即具有更粗纤维和更大孔径的移植物。扫描电镜图像显示，改良型移植物的平均纤维直径几乎是传统移植物的8倍（图1A</st...

在此，我们介绍一种改良的静电纺丝方法，用于制备具有粗纤维和大孔结构的PCL血管移植物，并描述一种评估其性能的实验方案 体内 在腹主动脉置换大鼠模型中的性能表现。

本文介绍了一种制备大孔聚己内酯（PCL）血管移植物的方案，并描述了利用腹主动脉缺损大鼠模型进行评估的实验方法。

本手术干预的总体目标是将静电纺丝血管移植物移植到大鼠腹主动脉中，并评估该移植物的长期性能。该方法由我组孔德领教授及其他同事建立，有助于回答静电纺丝血管移植物研究中的关键问题，例如移植物的结构及其表面特性对血管再生的影响。该技术的主要优势在于具有良好的可重复性以及较高的动物存活率。此外，该动物模型易于管理且成本较低。本工作将由我们的同事Doctor Wang开展。首先，通过将聚己内酯溶解于甲醇与氯仿按1比5比例配制的混合液中，并在室温下搅拌12小时，来制备聚合物溶液。将聚合物溶液装入10毫升玻璃注射器中，并安装一根钝头21号针头。然后，将不锈钢芯轴放置在收集装置上，并确保其正确接地。对于25%的聚己内酯溶液，调节针尖至收集器的工作距离为17厘米。然后，将注射泵的流速设置为每小时8毫升。接着，将电源电压设置为11千伏，并启动转轴以每分钟40转的速度旋转，以便收集电纺纤维并获得合适的纤维分布。在所有参数设置完毕后，开启电源和注射泵，开始收集电纺纤维。4.5 分钟后，关闭注射泵、电源和芯轴电机。将移植物在通风橱中干燥一小时。然后，使用无水乙醇将移植物从芯轴上取下，并置于真空环境中过夜，以去除残留溶剂。使用环氧乙烷对移植物进行灭菌，并在无菌生物安全柜中使其干燥。采用标准技术获取移植物管腔的扫描电镜图像，并将其导入 ImageJ 软件。利用测量工具测量每张图像中的纤维直径和平均孔径，以确保样品间的一致性。为了获得移植物材料的力学性能信息，首先使用剃刀片将管状支架切割成三毫米长的片段。然后，使用卡尺测量支架的厚度。接下来，将支架装入拉伸试验机的夹具中，确保夹具之间的距离为一毫米。沿轴向以每分钟10毫米的速度拉伸支架，直至其断裂。务必记录样品的抗拉强度和断裂伸长率。术前，将体重为240至270克的雄性Sprague Dawley大鼠禁食24小时，然后进行植入手术。按照随附文本方案所述，对大鼠进行麻醉并做好手术准备。通过确认大鼠肌肉松弛且呼吸平稳，以确保麻醉充分。随后，将大鼠仰卧位置于手术显微镜下。使用手术剪进行一道4至5厘米长的腹正中切口，暴露腹腔。小心地将肠管用生理盐水浸湿的纱布牵开并包裹。在手术显微镜下，将腹主动脉从周围邻近组织中仔细剥离。使用9-0单丝尼龙缝线识别并结扎降主动脉的所有细小分支。接着，使用血管夹夹闭一段长约一厘米的主动脉，使之隔离。然后，用显微剪刀在血管夹之间横断腹主动脉。使用肝素化生理盐水冲洗主动脉的两端，以清除残留血液。用显微剪刀剥离被夹住的主动脉的外膜。然后，将一段长度为1厘米的灭菌移植物置于主动脉被切除部分所形成的缺损处。使用9-0单丝尼龙缝线，在近端侧面的9点、3点、12点和6点位置，采用“8”字缝合方式构建四个吻合口。然后，在近端侧每两个缝线之间再构建另外四个吻合口。将移植物垂直放置，在手术显微镜下观察，以显示八个缝线之间间距相等。完成近端缝合后，在远端重复相同操作。待移植物固定后，先松开远端血管夹，使血液流入移植物，随后松开近端血管夹。使用无菌棉球对缝合部位施加压力，以止住任何可见的出血。按压约三分钟，直至止血完成。接着，将肠管还纳至腹腔内，并使用含庆大霉素的温生理盐水冲洗腹腔。随后，用3-0尼龙缝线缝合腹壁的肌肉层和皮肤层。术后仅使用一次碘伏处理切口。大鼠完全恢复后，将其放回与其他大鼠同居的环境中。电纺溶液中聚己内酯的浓度可同时影响移植物的纤维直径及其力学性能。较高浓度的25%溶液相比10%溶液可制备出纤维更厚、孔径更大的血管移植物。体内植入三个月后，组织学染色显示移植物管腔内表面形成了一层新生组织，且移植物内部有大量胶原沉积。该新生组织层由内皮细胞覆盖，其下方可见平滑肌细胞和环向排列的弹性蛋白层。在体内植入12个月后，新生组织表现出良好的整合性，内皮层和平滑肌层保持完整。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一至两小时内完成。在完成该操作后，还可进行其他检测，如彩色多普勒超声，以回答更多问题。在观看本视频后，您应能够充分理解如何制备静电纺血管移植物，并在大鼠腹主动脉置换模型中评估其体内性能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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