Name: 新鲜人脑组织中毛细血管的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习从新鲜人脑组织中分离毛细血管的方法，用于研究血脑屏障功能与信号通路。该技术可获得完整且具有生理活性的人脑毛细血管，为神经科学和药物研发提供重要的体外研究模型。

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我们感谢并致谢肯塔基大学阿尔茨海默病中心脑组织库的 Peter Nelson 博士和 Sonya Anderson，感谢他们提供所有人脑组织样本（美国国立卫生研究院资助编号：P30 AG028383，来自国家老龄化研究所）。我们感谢肯塔基大学信息技术服务部学术技术与教师参与中心的 Matt Hazzard 和 Tom Dolan 在图形处理方面的协助。本项目得到了国家神经疾病与卒中研究所资助编号 1R01NS079507（授予 B.B.）以及国家老龄化研究所资助编号 1R01AG039621（授予 A.M.S.H.）的支持。本内容仅由作者负责，不代表国家神经疾病与卒中研究所或国家老龄化研究所的官方观点。作者声明不存在竞争性财务利益。

以下信息基于美国肯塔基州列克星敦市肯塔基大学当前的安全和监管标准。出于安全考虑，在处理人体组织前，请参阅所在机构的生物安全计划以及最新的法规和建议。
警告：人体组织可能含有经血液传播的病原体，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及其他病原体。操作人体组织存在感染血源性病原体的风险。因此，在处理人体组织时，必须遵守特定的法规和安全规范，以保护实验室工作人员。在美国，操作人体组织需在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并依照美国国立卫生研究院（NIH）第四部分IV-B-7条款、1970年职业安全与健康法案（OSHA Act of 1970）第5(a)(1)条款以及使用者所在机构的生物安全计划，采取相应的安全防护措施并接受培训。通常情况下，在开展涉及人体样本（组织、体液等）的研究之前，必须获得机构生物安全委员会（Institutional Biosafety Committee）和/或机构审查委员会（Institutional Review Board）的批准。所有操作人体样本的人员均须接受培训，培训内容包括基础实验室安全培训， 例如，化学卫生与实验室安全，以及有关生物安全、危险废物和人类血液传播病原体的专项培训。所有操作人类来源材料的人员均强烈建议在接触人类材料前接种乙型肝炎疫苗。操作人类来源材料时，工作人员必须佩戴特定的个人防护装备。 例如佩戴袖套、实验服和面罩，并始终戴手套。所有操作均在二级生物安全柜中进行。所有接触人体材料的设备以及来自人体材料的任何废弃物均需妥善处理，以防止人员污染和/或感染。每次操作涉及人体材料后，所有设备和表面均须用10%次氯酸钠溶液和75%乙醇清洁。若发生人体材料溢出，必须立即清理。玻璃器皿每次使用后须高压灭菌。废弃物（包括未固定的组织）应收集于贴有生物危害标识的废弃物袋中，并进行高压灭菌。锐器应置于标有生物危害标识、防刺穿且防泄漏的容器中。所有来自人体材料的废弃物均须按照机构的生物安全规定进行处置。
注意：本实验室通过桑德斯-布朗老化研究中心（机构审查委员会编号：B15-2602-M）获取已故个体的新鲜额叶皮层样本。纳入标准为：参与肯塔基大学阿尔茨海默病中心（UK-ADC）纵向尸检队列研究，且死亡后间隔时间（Post-Mortem Interval, PMI）≤4小时64。尸检遵循标准操作流程，所有程序均符合美国国立卫生研究院（NIH）生物样本最佳实践指南65。较短的死亡后间隔时间（小于4小时）对于确保分离后毛细血管的活性至关重要。新鲜和冷冻组织均可使用。若需冷冻，应将 freshly 获取的人脑组织在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。新鲜或解冻后的组织应保存于分离缓冲液（见下文）中，并尽快处理。我们发现，10 g 新鲜人脑组织可获得约 100 mg 脑毛细血管（湿重）。
1. 设置
<ol>
	<li>缓冲液配制 
	注意：所需缓冲液的体积取决于组织量。以下方案中的所有缓冲液体积均基于10 g人脑皮层组织。
	<ol>
		<li>L 分离缓冲液：使用1.5 L杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；2.7 mM KCl，1.47 mM KH2PO4，136.9 mM NaCl，8.1 mM Na2HPO4，0.9 mM CaCl2，0.49 mM MgCl2），并加入5 mM D-葡萄糖（1.35 g）和1 mM丙酮酸钠（0.165 g）。加入葡萄糖和丙酮酸钠后，用氢氧化钠调节pH至7.4。使用前将缓冲液冷却并储存于4 °C。</li>
		<li>牛血清白蛋白（BSA）：将10 g BSA粉末加入1 L分离缓冲液中，使BSA终浓度为1%。缓慢搅拌以避免产生气泡，调节pH至7.4，并于4 °C储存过夜。使用前轻轻搅拌；避免产生气泡，以防白蛋白变性。</li>
		<li>密度梯度介质：称取18 g密度梯度介质放入玻璃瓶中，加入磁力搅拌子。加入60 mL分离缓冲液，剧烈震荡5分钟，直至所有粉末悬浮。于4 °C储存过夜，使密度梯度介质充分溶解。使用前搅拌10分钟。</li>
		<li>所有缓冲液均储存于4 °C；整个分离过程中，所有工具和缓冲液均需置于冰上。使用前对所有缓冲液进行搅拌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验装置设置
	<ol>
		<li>将Potter-Elvehjem组织研磨器的研杵安装到电子顶置式搅拌器上。将Potter-Elvehjem组织研磨器和Dounce匀浆器（含研杵）置于冰上，并放置在通风橱内。准备一张300 µm滤网（5 x 5 cm2），将其折叠成锥形，用胶带固定并插入50 mL Falcon管中（图1A）。</li>
		<li>在50 mL Falcon管上安装连接环和细胞滤筛（孔径：30 µm）。准备好生物危害废物袋。将所有所需设备放入生物安全柜中（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脑组织样本制备
注意：图1A 展示了下文所述整个分离流程的工作流程图。人脑组织可来源于大脑皮层的任何区域，可使用新鲜或冷冻的组织。冷冻脑组织可在室温下解冻（无需缓冲液；约30分钟解冻10 g）。为获得可比的结果，每次实验所用脑组织应取自相同的脑区。本方案已针对未冷冻的新鲜人脑皮层组织（死后时间 &#60;4 小时）进行了优化。
<ol>
	<li>人脑组织的准备：记录脑组织的重量。以下方案中的所有数值均适用于10 g新鲜人脑组织。将脑组织置于100 mm的培养皿中。用镊子小心去除所有脑膜。使用解剖刀切除白质。</li>
	<li>人脑组织的剪碎：用解剖刀小心地将脑组织切碎，剪切成约2–3 mm大小的组织块，持续约5分钟。将剪碎的组织转移至Potter-Elvehjem组织研磨器中，并加入30 mL分离缓冲液。 
	注意：由于脑组织在剪碎过程中会变成糊状，因此剪碎后的组织碎片较难观察。</li>
</ol>
3. 匀浆化
<ol>
	<li>使用 Potter-Elvehjem 组织研磨器（间隙：150–230 µm）：以每分钟 50 转的速度，对每个样品进行 100 次研磨。每研磨 25 次记录一次时间，并记录完成 100 次研磨所需的总时间。参见 表 1 中建议的匀浆方案；匀浆 10 克人额叶皮层组织的总时间约为 22 分钟。切勿在空气中搅拌，以防止产生气泡。</li>
	<li>杜恩斯匀浆器（间隙：80–130 µm）：将匀浆液转移至冰上的杜恩斯匀浆器中。用 20 次研磨处理悬浮液（每次约 6 秒，总时间约 2 分钟）。避免产生气泡。</li>
</ol>
4. 离心
<ol>
	<li>将脑匀浆液等量分装至四个50 mL离心管中，并记录匀浆液的总体积。将密度梯度缓冲液分装入离心管中（每管12.5 mL，共50 mL）。用10 mL分离缓冲液冲洗研杵和匀浆器，并将冲洗液分装至四个离心管中（每管约2.5 mL）。</li>
	<li>拧紧离心管盖。剧烈振荡离心管，使匀浆液、密度梯度介质和缓冲液充分混合。在4 °C条件下，以5,800 × g离心15分钟（固定角转子）；选择中等减速速度，以确保沉淀物附着在管壁上。弃去上清液，并将每管的沉淀物重悬于2 mL 1% BSA溶液中。</li>
</ol>
5. 过滤
注意：为了将毛细血管与红细胞及其他细胞碎片分离，需要进行多次过滤步骤。
<ol>
	<li>300 µm 滤网：重新悬浮沉淀后，将悬液通过 300 µm 滤网过滤。毛细血管可穿过滤网，而较大的血管和较大的脑组织碎片则留在滤网上。用最多 50 mL 的 1% BSA 小心冲洗滤网。弃去滤网。 
	注意：此过滤步骤可清除毛细血管悬液中任何较大的血管或脑组织碎片块。</li>
	<li>30 µm 细胞滤器 
	注意：此过滤步骤将毛细血管与红细胞及其他脑组织碎片分离。
	<ol>
		<li>将步骤 6.1 得到的毛细血管滤液分装至五个 30 µm 细胞滤器中（每个细胞滤器约加 10 mL 毛细血管滤液）。毛细血管被该滤器截留，而红细胞、其他单个细胞及小的脑组织碎片则穿过滤器进入滤液中被收集。</li>
		<li>每个滤器用 25 mL 的 1% BSA 冲洗。随后，将所有滤液合并后倒入第六个滤器中以提高回收率。每个滤器再用 50 mL 的 1% BSA 冲洗；保留含有毛细血管的细胞滤器，弃去滤液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 毛细管采集
<ol>
	<li>将滤膜倒置，每个滤膜用50 mL含1% BSA的溶液冲洗，收集至50 mL离心管中。使用5 mL移液器的吸头轻轻施加压力，并在滤膜表面移动，以冲洗下脑毛细血管。</li>
	<li>确保彻底冲洗所有脑毛细血管，尤其是滤膜边缘部分。避免产生气泡，因为气泡会增加过滤难度，并提高毛细血管丢失的风险。</li>
</ol>
7. 清洗
<ol>
	<li>收集毛细血管后，在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心所有样品 3 分钟（摆桶转子）。弃去上清液，并将沉淀重悬于约 3 mL 分离缓冲液中。将同一份样品的所有重悬沉淀合并至一个 15 mL 锥形管中，并用分离缓冲液充满。再次在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 3 分钟，并重复洗涤两次。</li>
	<li>使用显微镜（100 倍放大）和相机记录毛细血管纯度（图 1B）。 
	注意：每 10 g 人脑组织获得的脑毛细血管产量通常约为 100 mg。分离得到的脑毛细血管可用于后续实验，可进一步处理（例如，制备裂解液、膜组分分离），或进行速冻后置于冻存管中于 -80 °C 保存至少 6–12 个月（避免反复冻融）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了从新鲜组织中分离完整且具有活性的人脑毛细血管的方法。在本节中，我们将详细讨论以下内容：1）方案的修改，2）常见错误的排查，3）该技术的局限性，4）相对于现有及其他血脑屏障模型，该模型的意义，以及5）分离的人脑毛细血管的潜在应用。
本文所述方案已针对 10 g 新鲜人脑额叶皮质组织进行了优化。然而，该方案可相对简便地进行如下修改：1）适用于多于或少于 10 g 的组织，2）适用于冷冻脑组织，或 3）适用于额叶皮质以外其他脑区的组织。首先，当使用多于或少于 10 g 的脑组织时，缓冲液体积可根据实际组织量按比例相应增加或减少。例如，若仅有 5 g 脑组织可用，则缓冲液体积应减半。其次，本文描述的毛细血管分离方法使用新鲜脑组织，但若无法获得新鲜组织，也可使用冷冻组织38。第三，本研究采用来自额叶皮质的新鲜脑组织，但若其他皮质脑区有足够组织，也可从中分离毛细血管。此外，亦可从非皮质脑区（e.g., 白质）分离毛细血管，但这些区域的细胞组成和毛细血管密度不同66<su...

血脑屏障是血液与大脑之间的一个高度受控的界面，决定着进入和离开大脑的物质。从解剖学角度看，血脑屏障由内皮细胞构成，形成复杂的连续毛细血管网络。从生理学角度看，该毛细血管网络在向大脑输送氧气和营养物质的同时，清除二氧化碳和代谢废物。重要的是，已有证据表明，血脑屏障的改变与多种病理状态相关，包括阿尔茨海默病、癫痫和脑卒中1,2,3,4,5,6,7脑内皮细胞还通过阻止药物进入大脑而成为治疗的屏障， 例如多形性胶质母细胞瘤肿瘤切除术后化疗8,9,10. 在这方面，分离的人类脑毛细血管代表了一种独特的 离体 紧密模拟血脑屏障特性的模型 体内 这使得研究人员能够在健康和疾病状态下研究屏障功能及其障碍。本文提供了一种从人脑组织中分离脑毛细血管的实验方案，可稳定获得高质量和高得率的脑毛细血管，用于血脑屏障的研究。
1969年，Siakotos 等.11 首次报道了利用密度梯度离心法和玻璃珠柱分离法从牛和人脑组织中分离脑毛细血管。随后，Goldstein 等12 通过增加多步过滤步骤，改进了该方法，减少了研究从大鼠分离的脑毛细血管所需的组织量，同时维持了葡萄糖转运的代谢活性。此后，研究人员多次优化了毛细血管分离流程，每次迭代均进一步完善了该方法及脑毛细血管模型13,14,15例如，Pardridge 等.16 采用酶消化法而非机械匀浆法分离牛脑毛细血管，随后将毛细血管悬液通过210 µm孔径的筛网和玻璃珠柱。这些改进提高了分离脑毛细血管的台盼蓝排斥染色效果，从而增强了内皮细胞的活力。20世纪90年代初，Dallaire 等.17 分离出无神经元污染且保持γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTase）和碱性磷酸酶代谢活性的牛和大鼠毛细血管。2000年，Miller 等.18采用分离的大鼠和猪脑毛细血管，结合共聚焦显微镜技术，观察到转运底物在毛细血管腔内的积累。随后，本实验室持续优化脑毛细血管分离方法，并建立了用于测定P-糖蛋白（P-gp）转运活性的检测体系。19,20,21乳腺癌耐药蛋白（BCRP）22,23和多药耐药蛋白2（Mrp2）24 转运活性。2004年，我们发表了两篇研究报告，采用分离的大鼠脑毛细血管研究了多种信号通路。在Hartz 等.21，我们发现内皮素-1肽可通过作用于内皮素受体B（ETB）受体、一氧化氮合酶（NOS）和蛋白激酶C（PKC）。在Bauer 等19，我们证实了核受体孕烷X受体（PXR）的表达，并揭示了PXR对脑毛细血管中P-糖蛋白（P-gp）表达及转运功能的调控作用。在人源化PXR转基因小鼠的实验中，我们进一步拓展了该研究方向，并证实 体内 通过激活hPXR上调P-gp从而增强屏障紧密性252010年，Hartz 等.26 采用该方法在过表达人源淀粉样前体蛋白（hAPP）的转基因小鼠中恢复了P-糖蛋白（P-gp）的蛋白表达及转运活性。此外，在hAPP小鼠中恢复P-gp功能显著降低了淀粉样蛋白β（Aβ）水平40和 Aβ42脑内水平
除了研究信号通路外，分离的脑毛细血管还可用于测定毛细血管通透性的变化，我们称之为毛细血管渗漏。特别是，德克萨斯红渗漏实验可用于评估荧光染料德克萨斯红随时间从毛细血管腔内的渗出情况，这些数据随后用于分析渗漏速率。与对照组毛细血管相比，渗漏速率的增加表明血脑屏障物理完整性的改变2。这一点具有重要价值，因为许多疾病状态均与屏障破坏相关，e.g., 癫痫、多发性硬化症、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤27,28,29,30。其他研究团队也利用分离的毛细血管来解析调控蛋白质表达及其转运活性的信号通路31,32,33,34,35,36,37。最后，我们持续优化了人脑毛细血管分离的方法，并且最近发现，与无癫痫发作的对照个体相比，癫痫患者血脑屏障处P-gp的表达水平升高38。综上所述，这些进展表明，分离的脑毛细血管可作为研究屏障功能的多功能模型。
各种 体内，离体，以及 体外 血脑屏障模型已被用于基础研究和工业界的药物筛选，主要目的是测试药物向大脑的递送效果39,40,41,42,43,44。此外，除了分离的 离体 脑毛细血管，现有的血脑屏障模型包括 计算机模拟 模型， 体外 分离脑毛细血管内皮细胞或来自不同物种的永生化细胞系的细胞培养 体外 人多能干细胞（hPSC）培养，分化为脑毛细血管内皮细胞，以及芯片上的微流控模型。
in silico 模型在药物开发中最为常用，可用于根据预测的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性筛选候选药物。定量构效关系（QSPR）模型和定量构效活性关系（QSAR）模型是高通量筛选文库中常用的方法，用于预测候选药物进入大脑的能力45,46。这些模型有助于筛选具有屏障穿透特性的分子。
Betz 等47 建立培养的脑毛细血管内皮细胞的单层模型作为 体外 血脑屏障模型系统 体外 使用新鲜组织或永生化内皮细胞系（如人脑微血管内皮细胞，hCMECs）的细胞培养模型可作为研究药物脑渗透性或作用机制的另一种高通量筛选工具。然而，脑毛细血管内皮细胞培养模型缺乏毛细血管腔内血流产生的生理剪切应力，整体生物学复杂性有限，并且会改变关键屏障成分的表达与定位，这些成分包括紧密连接蛋白、表面受体、转运蛋白、酶和离子通道。48,49,50相反，源自人多能干细胞（hPSCs）的内皮单层细胞与hCMEC/D3细胞系相比具有较低的蔗糖通透性，并且表达部分血脑屏障转运蛋白、黏附分子和紧密连接蛋白的极化分布。51,52然而，这些细胞在培养过程中也容易发生特性的改变，因此必须对该系统模拟目标特性的情况进行验证。 体内 屏障特性52.
血脑屏障研究的新趋势包括利用三维组织培养系统构建人工毛细血管、采用器官芯片技术制备微流控装置，或运用中空纤维技术53,54,55然而，人工毛细血管的直径（100–200 µm）明显大于脑部毛细血管（3–7 µm），因此剪切力 体外 不完全类似于 体内 情况。这在 &#34;血脑屏障芯片&#34; 微流控装置，其中人工膜形成 &#34;血液&#34; 和 &#34;脑&#34; 腔室和液体通过这些装置泵送，产生微流控剪切力。类似地，内皮细胞与星形胶质细胞及血管平滑肌细胞以不同组合进行共培养，也已结合中空纤维技术用于重建存在的流变学参数 体内 条件56,57,58然而，目前尚不清楚该模型在多大程度上能够反映血脑屏障的其他特性，例如物质转运、代谢、信号传导等。这些人工毛细血管和芯片模型适用于药物的高通量筛选，但用于构建这些模型的细胞在培养过程中也可能发生改变。
冷冻固定的脑切片或原代脑毛细血管内皮细胞培养是可用于研究人类微血管系统5,59,60,61的其他模型。例如，通过对固定脑组织进行免疫组织化学染色，可确定蛋白质在健康组织与病变组织中的定位及表达情况。
除了组织切片和 体外 上述模型中，新分离的脑毛细血管可用于研究血脑屏障功能。该分离毛细血管模型的局限性包括难以获取新鲜的人脑组织、缺乏星形胶质细胞和神经元，以及分离过程相对耗时。该模型的一个优势在于其在结构和功能上高度接近 体内 因此可用于表征屏障功能及其功能障碍。重要的是，还可利用多种检测方法和分子技术，借助该模型解析相关信号传导机制3,19,62,63.
本实验室可通过桑德斯-布朗老化研究中心（伦理审查委员会编号：B15-2602-M）获得新鲜和冷冻的人脑组织64。在此背景下，尸体解剖遵循标准操作流程，脑组织在死亡后&#60;4 小时内获取，所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）生物样本最佳实践指南65。鉴于能够独特地获取人脑组织，我们建立并优化了一种从人脑组织中分离脑毛细血管的实验方案，可获得高产量的完整且具有活性的人脑毛细血管。常见的两个研究终点是测定蛋白质表达水平和活性。在这一方面，我们及其他研究者已建立多种可用于分离后脑毛细血管的检测方法，以研究蛋白质的表达水平和活性。这些检测方法包括蛋白质印迹（Western blotting）、Simple Western 检测、酶联免疫吸附测定（ELISA）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、定量聚合酶链反应（qPCR）、酶谱分析（zymography）、转运活性检测以及毛细血管渗漏检测。这些检测手段使研究人员能够研究人类病理状态下血脑屏障功能的变化，确定调控蛋白质表达与活性的相关通路，并识别可用于治疗血脑屏障相关疾病的药理学靶点。
综上所述，新分离的脑毛细血管可作为血脑屏障的一个稳定且可重复的模型。特别是，该模型可与多种不同的检测方法结合，用于测定多种终点指标，以研究屏障功能。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;个人防护装备（PPE）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus 乳胶手套，Microflex 中号</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>32916-636</td><td>个人防护装备</td></tr><tr><td>一次性防护实验服</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>470146-214</td><td>个人防护装备；由于人源材料的特性，建议使用一次性实验服</td></tr><tr><td>一次性面罩</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>19460102</td><td>个人防护装备；由于人源材料的特性，建议使用一次性面罩</td></tr><tr><td>安全材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies 高温高压灭菌袋 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; × 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>14-206-32</td><td>覆盖工作区域</td></tr><tr><td>VWR 锐器容器系统</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>75800-272</td><td>用于使用过的手术刀</td></tr><tr><td>8.2% 漂白剂 Clorox 消毒剂 64 盎司</td><td>美国肯塔基州列克星敦英国供应中心</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH计</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph，伊利诺伊州埃尔克格罗夫村，美国</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 体视显微镜</td><td>徕卡显微系统公司，美国伊利诺伊州巴芬格罗夫</td><td></td><td>用于去除脑膜</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 匀浆器</td><td>Kinematica AG，瑞士卢塞恩</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument，美国纽约州博伊米亚</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>标准微型搅拌子</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks 液氮杜瓦瓶</td><td>Thermo Scientific，曼斯菲尔德，德克萨斯州，美国</td><td>11-670-4C</td><td>用于冷冻组织？</td></tr><tr><td>Voyager Pro 分析天平</td><td>OHAUS，帕西帕尼，新泽西州，美国</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Axiovert 显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, 美国</td><td></td><td>用于检测分离的毛细血管</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;工具与玻璃器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II 移液器 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>21377823T1</td><td>将毛细管从滤膜上冲洗下来</td></tr><tr><td>Finnpipette II 移液器 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>21377821T1</td><td>用 BSA 重悬沉淀</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra，美国新罕布什尔州哈德逊</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管，每架 25 个，每箱 500 个</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO 手术刀片</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>S95938C</td><td>研磨脑组织</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>52858-000</td><td>覆盖烧杯和容量瓶</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Finntip 移液器吸头 5 mL</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>21-377-304</td><td>冲洗毛细管以去除滤膜上的残留物</td></tr><tr><td>60 mL 带鲁尔锁的注射器</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>BD309653</td><td>与连接环一起使用，用于过滤毛细管</td></tr><tr><td>手术刀柄 #4</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市</td><td>10060-13</td><td>用于切碎</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>11251-10</td><td>用于去除脑膜</td></tr><tr><td>波特-埃尔维耶姆组织研磨器</td><td>Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒</td><td>3431E25</td><td>50 mL 体积，清除率：150–230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>邓氏匀浆器</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>62400-642</td><td>15 mL 体积，通透范围：80–130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh 编织滤网（300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories，美国加利福尼亚州兰乔多明格斯</td><td>146424</td><td>用于过滤毛细管悬浮液，以去除可能残留的脑膜组织</td></tr><tr><td>pluriStrainers（孔径：30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect生命科学公司，德国莱比锡</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>连接环</td><td>pluriSelect生命科学公司，德国莱比锡</td><td>41-50000-03</td><td>可重复使用多次</td></tr><tr><td>1 L 容量瓶</td><td></td><td></td><td>用于分离缓冲液的配制</td></tr><tr><td>1 L 烧杯</td><td></td><td></td><td>用于制备1% BSA</td></tr><tr><td>搅拌子</td><td></td><td></td><td>用于制备1% BSA和Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>肖特瓶（60 mL）</td><td></td><td></td><td>用于制备Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td>保持所有物品低温</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td>用于脑组织的切碎</td></tr><tr><td>组织培养细胞刮刀</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>89260-222</td><td>离心后去除上清液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V，A-9647</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A9647-500g</td><td>用含钙的DPBS配制&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;& Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 前一天准备。制备过程中避免产生气泡。4℃保存。使用前缓慢搅拌10分钟。</td></tr><tr><td>含钙的DPBS&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;& Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - 分离缓冲液的一部分</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>F4375</td><td>精确测量在此步骤中非常重要。将样品称量至含有搅拌子的瓶子中。加入DPBS后剧烈振荡。4℃冰箱过夜，次日早晨溶液将变得澄清。使用前轻轻搅拌10–15分钟。使用前始终置于冰上保存。</td></tr><tr><td>葡萄糖（D-(+)葡萄糖）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>G7528</td><td>葡萄糖（D-(+)葡萄糖）浓度：5 mM</td></tr><tr><td>氢氧化钠标准溶液</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>71474</td><td>调节DPBS的pH值</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P2256</td><td>浓度：1 mM</td></tr></tbody></table>

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

在生理和病理生理条件下理解血脑屏障功能，对于开发新的治疗策略至关重要，这些策略有望增强药物向脑部的递送、改善脑保护并治疗脑部疾病。然而，研究人类血脑屏障功能具有挑战性，因此迫切需要合适的模型。在这方面，从人脑组织中分离出的脑微血管是一种独特的工具，可尽可能接近人类体内（in vivo）的真实情况来研究屏障功能。本文中，我们描述了一种优化的方案，能够以高得率、稳定的质量和纯度从人脑组织中分离微血管。该方法利用机械匀浆、密度梯度离心和过滤技术，从新鲜的人脑组织中分离微血管。分离后的人脑微血管可用于多种应用，包括通透性检测、活细胞成像以及基于免疫的检测，以研究蛋白质表达与功能、酶活性或细胞内信号传导。分离的人脑微血管是一种独特的模型，可用于阐明人类血脑屏障功能的调控机制。该模型有助于揭示中枢神经系统（CNS）疾病的发病机制，从而推动针对CNS疾病治疗策略的发展。

从人脑组织中分离得到的悬液富含人脑毛细血管（图1B），其中含有少量较大的血管、红细胞、其他单个细胞以及部分细胞碎片。部分毛细血管呈分支状，某些毛细血管腔内可见被截留的红细胞。典型的毛细血管直径为3–7 µm，长度约为100–200 µm，管腔开放；大多数毛细血管末端呈塌陷状态。通过共聚焦显微镜观察，分离的人脑毛细血管显示出完整、管状的结构和形态。图2A展示了一条具有附着周细胞且管腔内含红细胞的人脑毛细血管的代表性透射光图像。关于直径、大小和形态的所有观察结果均与既往关于分离脑毛细血管结构的报道一致12,17,18。图2B中的人脑毛细血管使用C219作为一抗（1 µg/mL）对P-糖蛋白（P-gp，绿色）进行免疫...

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。

理解生理和病理生理条件下血脑屏障的功能对于开发新的治疗方法至关重要……

该方法有助于回答血脑屏障研究领域中的关键问题，例如血脑屏障功能障碍、屏障渗漏以及人类血脑屏障特异性的信号通路。该技术的主要优势在于，能够研究从新鲜人脑组织中分离得到的完整且具有生理活性的人脑毛细血管。开始此操作时，记录人脑组织的重量，应约为10克。在显微镜下，用镊子小心去除所有脑膜，并用手术刀切除白质。然后仔细切碎脑组织，用手术刀切碎约五分钟。将脑组织转移至组织研磨器中，并加入 30 毫升分离缓冲液。随后，以 50 rpm 的速度对每个样品进行 100 次研磨均质。避免在空气中搅拌，以防止产生气泡。每研磨 25 次记录一次时间，并记录完成 100 次研磨所需的总时间。随后，将匀浆转移至预冷的Dounce匀浆器中，置于冰上。匀浆约20次，避免产生气泡。然后将脑匀浆均等地分装到四个50毫升离心管中。并记录匀浆液的总体积。确保加入正确体积的Ficoll。Ficoll体积过少或过多均会导致密度不准确，从而无法有效分离毛细血管与细胞碎片，进而减少毛细血管得率并限制最终产量。用 10 毫升裂解缓冲液冲洗研杵和匀浆器，并将液体分装至四个离心管中。接着，将 50 毫升密度梯度缓冲液分装至离心管中。用盖子紧密封闭离心管。随后，剧烈振荡试管，使匀浆液、密度梯度介质和缓冲液充分混匀。在4°C条件下，以5,800 ×g离心15分钟。然后弃去上清液，并将每份沉淀物重悬于2毫升含1% BSA的溶液中。重悬沉淀后，将悬液通过300微米孔径的滤网过滤。毛细血管可穿过滤网，而较大的血管和较大的脑组织碎片则留在滤网上。用最多50毫升的1% BSA小心冲洗滤网。然后弃去滤网。为了将毛细血管与红细胞及其他脑组织碎片分离，将毛细血管滤液分装至五个孔径为30 µm的细胞滤筛上。毛细血管会被该滤筛截留，而红细胞、其他单个细胞以及较小的脑组织碎片则会通过滤筛，收集于滤液中。随后用 25 毫升 1% BSA 溶液洗涤每个滤膜。将所有滤液收集并过第六个滤膜，以提高回收率。再用 50 毫升 1% BSA 溶液洗涤每个滤膜。保留含有毛细血管的细胞筛滤膜，并弃去滤液。然后将滤膜倒置，用50毫升1% BSA溶液冲洗毛细血管，收集至50毫升离心管中。用移液枪头轻轻施加压力，并在滤膜表面移动，以冲洗下脑毛细血管。务必彻底冲洗滤膜边缘，清除所有脑部毛细血管。避免产生气泡，因为气泡会使过滤过程更加困难，并增加毛细血管丢失的风险。收集毛细血管后，在4°C条件下，将所有样品以1,500 ×g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于约三毫升的分离缓冲液中。然后将同一份样品的所有重悬沉淀合并至一个15毫升的锥形管中，并用分离缓冲液充满。在4°C条件下，以1,500 × g离心3分钟，再洗涤两次。使用显微镜（100倍放大）和相机记录毛细血管的纯度。分离得到的脑毛细血管现在可用于实验，或进行后续处理，也可迅速冷冻后置于-80摄氏度的冻存管中保存，至少可稳定保存6至12个月。该图显示了一张代表性的人脑毛细血管透射光图像，其中可见附着的周细胞以及管腔内的红细胞。采用C219作为一抗对分离的人脑毛细血管进行PGP免疫染色，并用DAPI对细胞核进行复染。在进行该操作时，需注意避免在移液和过滤步骤中丢失毛细血管，以确保获得足够的毛细血管产量。完成该操作后，分离的人脑毛细血管可用于多种研究，包括药理学和生理学研究，以及基因组学、蛋白质组学和细胞组学研究。该技术为血脑屏障领域的研究人员提供了研究人脑毛细血管屏障功能的方法，使其能够尽可能接近人体内的真实生理状况。请注意，操作人脑组织存在感染血液传播病原体的风险。应采取安全防护措施，例如穿戴实验服、面罩和手套，并在生物安全二级（BSL-2）条件下处理组织样本。

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关键词：周细胞，原代培养，脑毛细血管，内皮细胞污染，牛脑，细胞分离

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从猪脑中纯化毛细血管

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脑实质小动脉的分离与套管插管

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从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

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