Name: 秀丽线虫纵向成像的微流控平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 了解利用定制微流控装置对秀丽线虫进行纵向活体成像的方法。该技术可在受控环境条件下同时追踪线虫行为反应与基因表达动力学，为定量研究动物适应机制提供高分辨率数据支持。

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本研究得到了美国国家科学基金会资助项目 PHY-1205494 和 MCB-1413134（EL）以及韩国国家研究基金会资助项目 2017R1D1A1B03035671（KSL）的支持。

以下方案使用 WormSpa5，这是一种先前已描述的用于线虫长期成像的微流控装置。WormSpa 的制备（起始步骤为获取作者提供的 CAD 文件）较为直接，但需要一定的专业知识。在大多数情况下，可由核心设施或提供此类服务的商业公司完成装置的制备。在制备装置时，务必明确要求特征结构的高度为 50 µm。
1. 实验设置
<ol>
	<li>将微流控装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上。</li>
	<li>将轨道摇床放置在显微镜附近，但需确保摇床产生的振动不会直接影响显微镜。例如，可将摇床置于固定在墙上的搁板上，使其不与光学实验台接触。</li>
	<li>将注射泵放置在轨道摇床上。用胶带将泵固定在摇床上，以防止摇动时发生晃动。</li>
</ol>
2. 微流控环境的制备
注意：实验过程中，四个注射器通过注射器管路连接至微流控装置，如图1所示。本步骤描述了这些注射器的准备过程。除非另有说明，注射器管路应尽可能短，但不得拉紧。
<ol>
	<li>准备一个出口注射器和一根注射器管。该注射器（图1中的S1）之后将通过注射器管连接至装置的出口，用于临时储存从装置中流出的液体。
	<ol>
		<li>通过移除20 G × 1/2英寸注射器头的塑料部分，仅保留针头（金属部分），制作一个适配针。操作时用镊子夹住塑料和金属部分并将其拉开。针头上残留的塑料可用本生灯烧除。</li>
		<li>用镊子夹住针头两端，根据实验装置的几何结构将针头弯曲。在本文描述的设计中，将针头中部弯曲至约110°角最为方便。</li>
		<li>将适配针插入管中约一半长度。另一半稍后将插入装置中。注射器管应与20 G注射器头兼容且不漏液（例如，内径为0.86 mm、外径为1.32 mm的管）。推荐的管长约为50 cm。</li>
		<li>通过一个20 G × 1/2英寸注射器头，将一个10 mL鲁尔锁式注射器连接到注射器管的另一端（开口端）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备缓冲液入口注射器和注射器管。其中一个注射器（图1中的S2）用作进入装置的液体储液器，并用于控制注入流速。另一个注射器（图1中的S3）用于缓冲液更换，具体见步骤3.2。
	<ol>
		<li>将一个10 mL鲁尔锁式注射器（S2）直接连接至三通阀，并通过注射器管将另一个注射器（S3）连接至同一阀门（图1）：通过注射器头将S3连接至管，再通过另一个注射器头将管连接至阀门。 
		注：这些材料的连接顺序无关紧要。</li>
		<li>将一根注射器管连接至三通阀的剩余端口。按照步骤2.1.2的方法制备另一个适配针，并将针头的一半插入注射器管的另一端（开口端）。</li>
		<li>调节阀门，使步骤2.2.2中的注射器管与S2连通，同时关闭S3（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备蠕虫入口注射器和注射器管。该注射器（图1中的S4）用于将蠕虫加载到装置中。
	<ol>
		<li>将一根长注射器管连接至一个10 mL鲁尔锁式注射器（S4）。根据用于加载的液体体积确定该管的长度；例如，100 cm长的管可容纳超过2 mL液体（另见步骤4.2）。</li>
		<li>按照步骤2.1.2的方法制备另一个适配针，并将针头的一半插入注射器管的另一端（开口端）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用S-培养基12将所有注射器和管路冲洗两次。用S-培养基充满注射器和管路，并注意去除所有气泡。</li>
	<li>将出口注射器管连接至装置的出口。
	<ol>
		<li>将注射器管末端的适配针插入出口端口。</li>
		<li>通过出口注入少量S-培养基以充满装置，直至缓冲液入口和蠕虫入口均有少量S-培养基流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将缓冲液入口注射器管连接至装置的缓冲液入口端口，同时用一根针（直径为1/32英寸的不锈钢圆柱销）堵住蠕虫入口。</li>
	<li>向装置中注入恒定流速的缓冲液。将缓冲液入口注射器S2装载到注射泵13上，并设置泵，使S2中的培养基以3 µL/min的流速持续注入装置中。</li>
</ol>
3. 将细菌载入微流控装置
<ol>
	<li>制备悬浮于S培养基中的Escherichia coli OP5012。
	<ol>
		<li>按照标准操作流程，取50 mL LB培养基加入250 mL锥形瓶中，并接种单个菌落，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>将过夜培养物在4000 rpm条件下离心10分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于30 mL S培养基中。</li>
		<li>使用5 µm针头滤器过滤该菌液悬浮液。通过测量其在600 nm处的光密度（OD600）来确定细菌浓度，并将浓度调整至OD600为3。此高浓度可确保线虫获得充足营养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用OP50菌液替换装置中的缓冲液。
	<ol>
		<li>准备一支洁净的注射器（S5），装入OP50菌液。将注射器垂直持握，并轻轻敲击数次，使所有气泡聚集至顶部。</li>
		<li>将缓冲液入口注射器上的三通阀转向，关闭其与装置的连接，然后将S2和S3两支注射器连接起来。将S2从注射泵上取下。</li>
		<li>断开S2与三通阀的连接，将S5连接至该阀。通过三通阀将S5顶部聚集的所有空气推入S3中，直至少量OP50缓冲液进入S3。操作过程中需确保S5及三通阀内无残留气泡。</li>
		<li>将三通阀转回原始位置，关闭S3与S5之间的通路，同时使S5与装置连通。将S5安装至注射泵上。开启固定注射泵的轨道摇床，设置摇动速度约为200 rpm。</li>
		<li>设定流速为100 µL/min。新缓冲液到达装置内线虫所需的时间取决于缓冲液入口注射器管路的长度（使用上述管路时约为5分钟）。若需更快完成缓冲液更换，可采用更高的流速。</li>
		<li>当OP50缓冲液已完全充满装置后，将流速调回至3 µL/min。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将线虫载入微流控装置
<ol>
	<li>准备一个小型低吸附微量离心管（650 µL），加入100 µL OP50菌液。使用线虫挑取工具，从NGM（线虫培养基）琼脂平板上逐一挑取约20–30条年龄同步化的年轻成虫（在25 °C条件下L1幼虫期停滞46小时后发育而成）转移至该离心管中。年龄同步化操作可依照标准实验方案进行。12.</li>
	<li>填充蠕虫进样注射器和注射器管（S4） 图1) 与 OP50 悬液混合。将约 500 µL 液体注入含有线虫的微量离心管中。用蠕虫进样注射器管吸取含有线虫的悬液。确保注射器管足够长（&#62;1 米），且吸取的线虫保留在注射器管内，不会完全进入注射器 S4。</li>
	<li>将S4连接至蠕虫入口。将蠕虫入口注射器管中的所有蠕虫注入微流控装置。断开S4与注射器管的连接。用插针封闭蠕虫入口。</li>
	<li>将缓冲液入口注射器 S2 从机械泵上断开 图1）并手动控制 S1 和 S2，将所有线虫推入不同的通道。按压 S2 可使线虫进入通道，而按压 S1 则使其反向移动。一旦通道被加载，每个通道内的线虫将阻塞其他线虫进入。</li>
	<li>让线虫在新环境中适应2 - 3小时。</li>
</ol>
5. 设置成像方案
<ol>
	<li>找到所有牢固位于装置内的线虫，并在控制显微镜的图像采集软件中为每条线虫设置成像位置。请注意，在某些情况下（例如，需要更高放大倍数或使用CCD传感器较小的相机时），每个通道需要设置多个成像位置。 
	注意：虽然此步骤可手动完成，但某些图像采集软件可加载一个文本文件，其中列出应采集图像的位置。由于WormSpa中的这些位置排列规则，用户可编写一个小脚本（例如，使用Python或商业软件）来自动生成此类列表。该脚本的具体格式取决于采集软件所要求的文件格式（参见补充材料1中的示例）。</li>
	<li>设置所需的时间序列成像频率。例如，对感染后免疫基因响应的成像通常以每10分钟一帧的频率进行。确保在每个时间点均采集所有必要的通道图像（例如，明场和GFP荧光）。</li>
</ol>
6. 宿主对假单胞菌感染的反应
注意：此步骤专用于研究宿主-病原体相互作用。或者，也可制备含有其他感兴趣环境信号的缓冲液（生物和非生物胁迫因子、药物、信号分子） 等等。).
<ol>
	<li>制备悬浮于SK培养基中的Pseudomonas aeruginosa PA1414。
	<ol>
		<li>在250 mL锥形瓶中加入50 mL LB培养基和单个菌落，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>另取一个250 mL锥形瓶，加入50 mL LB培养基及适量上述培养物，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>将过夜培养物在4000 rpm下离心10分钟，将沉淀重悬于10 mL SK培养基中。测定细菌浓度，并调节至OD600 = 4。</li>
		<li>将菌悬液转移至洁净的锥形瓶中，于37 °C振荡培养24小时，再于25 °C继续振荡培养24小时。此步骤模拟标准杀伤实验中的平板培养步骤14。</li>
		<li>用5 µm针头滤器过滤菌悬液，以防止细菌聚集体堵塞装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤3.2的相同操作，将装置中的OP50菌悬液替换为PA14菌悬液。持续成像10小时。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微流控工具在研究线虫方面具有多种优势。与标准的NGM琼脂平板相比，在PDMS装置中成像可提供更高的成像质量。可对同一条线虫进行多次成像，而传统方法则需将线虫从平板上挑取并置于显微镜载玻片上进行成像。此外，可保持或按需调节线虫所处的微环境，从而精确绘制环境组成与动物反应之间的关系。
本文展示了如何利用定制的微流控装置（WormSpa）对多个个体线虫在机会性病原菌P. aeruginosa PA14感染下的宿主反应进行成像，从而实现宿主对细菌感染反应的纵向测量。在整个实验过程中，无需干扰样本即可在多个时间点获取明场和荧光图像。特别是，每10分钟检测一次产卵动力学和irg-1基因的表达情况，相较于传统方法，时间分辨率显著提高14,15。
在此装置中，可通过在任意时间点重新访问每条线虫的保存位置，对多条线虫进行纵向测量。这一点在图2</str...

环境条件的变化可能导致遗传程序的激活，伴随特定基因表达的诱导与抑制1,2。这些动力学变化在同一动物的不同组织之间以及不同动物之间可能存在差异。因此，对这类遗传程序的研究需要能够对单个动物进行长期成像，并精确动态控制环境条件的方法。
近年来，微加工流体装置已被用于研究多种小型动物的反应和行为，包括线虫、果蝇、水熊等3,4,5,6,7。其应用包括例如深度表型分析、在化学刺激下对神经元活动进行光遗传学记录，以及对运动行为（如运动和泵动）的追踪8,9,10,11。
基于微流控的方法具有多种特性，可为长期纵向成像研究生物对环境刺激的响应带来优势，包括对局部微环境的精确动态调控、可灵活设计以将个体动物分隔饲养的结构，以及有利于成像的优良特性。然而，长期将动物维持在微流控腔室内且对其健康造成最小不利影响仍是一项挑战，这需要在微流控装置的设计以及实验操作过程中给予特别关注。
本文展示了 WormSpa 的使用方法，这是一种用于对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行长期成像的微流控装置。5 单个线虫被限制在腔室中，持续的低流速液体和细菌悬浮液可确保线虫获得充足营养并保持足够的活动性，从而维持良好的健康状态并减轻应激反应；同时，腔室结构允许线虫产卵。WormSpa 设计与操作简便，即使此前无微流控经验的研究人员也能将其整合到自身的研究计划中。

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>WormSpa 的 CAD 文件可从 Levine 实验室获取。</td></tr><tr><td>复式显微镜</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>配备电动载物台的倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>内径 0.034&amp;rdquo; (0.86 mm)，外径 0.052&amp;rdquo; (1.32 mm)</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 号 × 1/2&amp;rdquo; 钝头不锈钢套管</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm 注射器滤器，带 5 µm Supor 膜</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL 雄性鲁尔锁式注射器</td></tr><tr><td>三通阀</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>大孔径三通止流阀，雄性锁扣，10 个/包，非无菌</td></tr><tr><td>圆柱销</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 不锈钢圆柱销（直径 1/32&quot; × 长度 1/2&quot;）</td></tr><tr><td>低吸附微量离心管</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL 低吸附 snap cap 微量离心管</td></tr></tbody></table>

用于纵向成像的微流控平台 秀丽隐杆线虫

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

近十年来，微流控技术已被应用于研究小型动物，包括线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），并被证明是一种便捷的活体成像平台，可在实时条件下精确控制实验环境。本文中，我们利用此前发表的定制微流控装置 WormSpa，对单个线虫进行活体成像。该装置将多条线虫分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重长期监测。为展示其功能，我们进行了原理验证实验：在装置内使线虫感染致病菌，并持续监测单个个体中免疫应答基因的表达动态及产卵行为。该装置结构简单、操作便捷，适用于此前无微流控实验经验的研究人员。我们建议，该方法将有助于众多希望在明确定义的条件下对生物学过程进行长期观察的研究者。

在25 °C条件下，从L1幼虫滞育期后46小时的年龄同步化年轻成虫线虫12被加载至装置中，具体操作如实验方案所述。每条线虫被单独安置在不同的通道内，从而实现对个体动物对病原体反应的长期纵向测量。当实验成功时，大多数线虫在整个实验过程中会保留在其所在的通道内。在此情况下，只需将目标通道置于成像光路中，即可获取单条线虫的图像，无需主动寻找动物位置。图2A展示了单条代表性线虫在装置中持续10小时的明场图像。尽管线虫被限制在各自的通道内，它们仍可沿通道上下游移动，并能自由转动头部。这一点至关重要，可确保装置本身不会对动物造成应激或伤害。
通过监测线虫对细菌感染的反应 P. aeruginosa，一种被研究得最为透彻的细菌病原体之一 秀丽隐杆线虫它也是一种机会性人类病原体，可导致囊性纤维...

本文中，我们利用一种定制的微流控装置，对单个线虫进行活体成像。在该装置中，多条线虫被分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重化、长期监测。

在过去的十年中，微流控技术已被应用于研究小型动物，包括线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），并已被证明……

本实验的总体目标是在受控环境条件下，对成年线虫进行长期成像，以追踪其行为反应及基因表达动力学。该方法有助于解答关于动物如何适应环境变化的关键科学问题，包括核心行为、基因表达、记忆与学习等方面的差异。该技术能够在动态调控的环境中对单个动物进行多路长期观察，同时以高分辨率同步检测适应过程中的多个方面。该技术的应用有助于对动物适应性进行定量研究，因为获取高精度的动力学数据可以促进数学建模以及复杂假设的提出与验证。在进行实验前，首先将出口端的注射器针头连接至一段50厘米长的注射器导管。制作适配针时，使用镊子将20号、½英寸长的针头从针座上拔出针杆，并用本生灯去除残留的塑料。用镊子夹住针头的两端，根据实验装置的几何形状弯曲适配针，然后将针头插入出口端注射器管的另一端约一半深度。接下来，将一个缓冲液入口注射器的尖端直接连接到三通阀上，并将缓冲液入口注射器连接到一段一米长的注射器管。将适配针插入管子的开口端约一半深度，通过注射器尖端将缓冲液交换注射器连接到一段50厘米长的注射器管。将注射器管连接到三通阀的剩余端口并关闭阀门。使用接头针头，将蠕虫进样注射器连接到一段一米长的注射器管上，操作方法如前所述。然后用S培养基将所有材料冲洗两次，并用新鲜的S培养基充满已冲洗的注射器和管路，注意去除所有气泡。现在，将出口注射器管路连接至设备出口，并将出口注射器管路末端的适配针插入出口端口。通过出口注入少量 S 培养基，使装置内部充满液体，直至缓冲液入口和线虫入口均有 S 培养基流出。将缓冲液入口注射器管路连接至设备的缓冲液入口端口，并使用直径为 1/32 英寸的不锈钢圆销堵住线虫入口。将微流控装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上，并将注射泵用胶带固定在显微镜附近的摇床边缘，以确保摇动时泵不会晃动。然后，将缓冲液入口端的注射器装入注射泵，并设置泵以每分钟3 µL的流速向装置持续输送S培养基。为了将细菌加载到微流控装置中，首先使用一支新的注射器吸取高浓度的E.coli OP50菌悬液。将注射器垂直放置，轻弹针筒数次，使所有气泡聚集到注射器顶部。关闭摇床，并关闭缓冲液入口注射器的三通阀。将缓冲液入口注射器更换为含有细菌的注射器，推动活塞排出顶部聚集的全部空气，直至少量细菌悬液进入缓冲液置换系统，且OP50菌液注射器或阀门中无残留气泡为止。关闭阀门后，将含有细菌的注射器连接至注射泵，并开启轨道摇床。设定摇床转速约为 200 RPM，流速为 100 微升每分钟。当 OP50 缓冲液在装置内完全扩散后，将流速调回至 3 微升每分钟。为了将线虫加载到装置中，首先用100微升新鲜的OP50菌液填充一个650微升的低吸附微型离心管，并使用线虫挑取工具从线虫生长培养基琼脂平板上逐个转移20至30条年龄同步化的年轻成虫至该管中。用新鲜的OP50菌液填充线虫进样注射器及注射器管，然后将约500微升菌液注入微型离心管中。接着，将含有线虫的菌液吸入线虫进样注射器管中，并将线虫进样注射器连接至装置的线虫进样口。将所有线虫通过蠕虫入口注射器管注入微流控装置，然后断开蠕虫入口注射器和注射器管。用插针封闭蠕虫入口，并将缓冲液入口注射器从机械泵上卸下。使用缓冲液入口注射器手动将蠕虫推入通道中，并在需要时使用出口注射器逆转蠕虫的移动方向。装载动物需要一定的协调操作。使用注射器推杆轻轻推动，使线虫与通道对齐，然后稍加力度推动，将线虫完全推入通道内。随后，让线虫在新环境中适应两到三个小时，再开始实验。线虫被限制在通道内，但并未被固定。大多数线虫在整个实验过程中会停留在其通道中，但部分线虫可能会逃逸或卡在微裂隙中。此处可观察到在装置中一只代表性线虫在十小时内的明场图像。利用在免疫反应基因一启动子驱动下表达GFP的转基因线虫，当感染铜绿假单胞菌PA14后，在接触病原体的最初五小时内，可在线虫的中段和尾部观察到GFP表达，并在随后的五小时内逐渐增强为强烈的全身体表达。将每条线虫的总荧光强度随感染后时间的变化绘制成图，可展示免疫反应基因一诱导的动力学过程，以及不同线虫在诱导时间和诱导程度上的个体差异。对每条线虫在各时间点产下的卵进行延时成像，可绘制每条线虫感染后随时间累积产卵数量的变化曲线，从而捕捉个体间的变异情况，以及随着感染进展由病原体引起的产卵行为下降现象。一旦掌握，可在一小时内完成微流控装置的制备和加载。装置加载并使线虫适应后，可向线虫递送其他试剂，例如特定药物或感兴趣的化学信号分子，以进一步探究线虫神经和遗传系统的调控机制。该技术开发后，我们及合作者已将其用于解析线虫在多种环境条件下的摄食行为，以及其遗传系统对热激、感染和饥饿的响应。观看本视频后，您应能充分理解如何使用微流控装置进行纵向实验。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

秀丽线虫纵向成像的微流控平台

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

本文介绍了一种用于观察线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇...

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

本文介绍了一种半自动化的微电液芯片方法，可按需诱导Caenorhabditis...

基于微流控的电趋性用于按需定量分析 秀丽隐杆线虫运动

在不固定动物的情况下，对行为和神经活动进行长时间尺度的成像，是理解行为的前提。琼脂糖微流控腔成像（AMI）可用于对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

用于长期钙成像的琼脂糖微室培养秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C.

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C.

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种在固体培养基上培养单个分离线虫并对其进行终生生理参数监测和荧光定量的实验方案。该培养系统在单虫培养孔周围设置棕榈酸屏障，以防止线虫逃逸，从而允许使用具有厌恶性干预条件，包括致病菌和化学应激物。...

长期培养个体细胞 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行纵向荧光监测和厌恶干预

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C.

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

了解利用定制微流控装置对秀丽线虫进行纵向活体成像的方法。该技术可在受控环境条件下同时追踪线虫行为反应与基因表达动力学，为定量研究动物适应机制提供高分辨率数据支持。

用于纵向成像的微流控平台秀丽隐杆线虫

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