A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

该程序的总体目标是在受控环境条件下纵向成像成年线虫的动态过程，以跟踪蠕虫行为反应和蠕虫基因表达的动力学。这种方法可以帮助回答有关动物如何适应环境变化的关键问题，包括核心行为、基因表达、记忆和学习的差异。该技术允许在动态控制的环境中对个体动物进行多重纵向观察，以及以高分辨率同时对适应的多个方面进行采样。

该技术的含义延伸到对动物适应的定量理解，因为获取高精度动力学数据可以促进数学建模以及复杂假设的制定和测试。要为该程序设置设备，首先将出口注射器尖端连接到 50 厘米长的注射器管。要制作转接针，请使用钳子将针轴从 20 号针座上拉出半英寸针，然后使用本生灯去除剩余的塑料残留物。

用钳子握住针头的两端，根据实验装置的几何形状弯曲适配器针，然后将针头的一半插入出口注射器管的另一端。接下来，将一个缓冲液进样口注射器尖端直接连接到三通阀，并将缓冲液进样口注射器连接到一根一米长的注射器管上。将适配器针插入管的开口端的一半，通过注射器尖端将缓冲液交换注射器连接到一根 50 厘米长的注射器管上。

将注射器管连接到三通阀的剩余端口并关闭阀门。使用适配器针，将蠕虫入口注射器连接到一米长的注射器管上，就像刚才演示的那样。然后，用 S 培养基冲洗所有材料两次，并用新鲜的 S 培养基填充冲洗过的注射器和试管，注意去除任何气泡。

现在，将出口注射器管连接到设备出口，并将出口注射器管末端的适配器针插入出口。通过出口注入少量 S 培养基以填充装置，直到 S 培养基从缓冲液和蠕虫入口中流出。将缓冲液入口注射器管连接到设备的缓冲液入口，并用直径为 1 30 英寸的不锈钢定位销塞住蜗杆入口。

将微流体装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上，并将注射泵粘在显微镜附近的振荡器上，以便泵在摇晃时不会晃动。然后，将缓冲液入口注射器加载到注射泵上，并将泵设置为以每分钟 3 微升的流速将 S 介质连续输送到装置中。要将细菌加载到微流体装置中，首先将高密度大肠杆菌 OP50 悬浮液加载到新注射器中。

垂直转动注射器，敲击桶数次，以收集注射器顶部的所有气泡。关闭轨道摇床并关闭缓冲液进样口注射器的三通阀。将缓冲液入口注射器更换为载有细菌的注射器，并推出注射器顶部收集的所有空气，直到少量细菌悬浮液进入缓冲液交换系统，并且装有 OP50 的注射器或阀门中没有气泡残留。

关闭阀门，将载有细菌的注射器连接到注射泵并打开轨道摇床。将振荡速度设置为大约 200 RPM，将流速设置为每分钟 100 微升。一旦 OP50 缓冲液扩散到整个设备中，将流速设置回每分钟 3 微升。

要在装置中加载线虫，首先用 100 微升新鲜 OP50 悬浮液填充 650 μL 低结合微量离心管，然后使用蠕虫镐将 20 至 30 条年龄同步的年轻成虫从线虫生长培养基琼脂平板单独转移到管中。用新鲜的 OP50 悬浮液填充蠕虫入口注射器和注射器管，并将大约 500 微升悬浮液注入微量离心管中。然后，将蠕虫悬浮液吸入蠕虫入口注射器管中，并将蠕虫入口注射器连接到蠕虫入口。

通过蠕虫入口注射器管将所有蠕虫注入微流体装置，并断开蠕虫入口注射器和注射器管。用销钉塞住蜗杆入口，然后从机械泵上松开缓冲液入口注射器。使用缓冲液入口注射器手动将蠕虫移动到通道中，并根据需要使用出口注射器反转蠕虫运动。

装载动物需要一些协调。轻轻推动注射器柱塞以与通道对齐，并稍有力地推动蠕虫完全进入。然后，让蠕虫适应新环境 2 到 3 小时，然后再开始实验。

蠕虫被限制在它们的通道中，但它们并没有被固定。大多数蠕虫会在实验期间留在它们的通道中，但有些蠕虫可能会逃脱或缠绕在微裂缝中。在这里，可以观察到单个代表性蠕虫在设备中 10 小时内的明场图像。

使用在免疫反应基因启动子下表达 GFP 的转基因蠕虫，在铜绿假单胞菌 PA14 感染后，在暴露于病原体的前 5 小时内在蠕虫的中体和尾部观察到 GFP 表达，在接下来的 5 小时内增加到强烈的全身表达。绘制每条蠕虫的总荧光作为感染后时间的函数图说明了免疫反应基因 1 诱导的动力学以及蠕虫间诱导时间和程度的蠕虫间变异性。蠕虫在每个通道中产卵的延时成像可以绘制每条蠕虫产卵的累积数量与感染后时间的函数关系，并捕获动物间的变异性以及病原体诱导的随着感染进展而产卵的下降。

一旦掌握，就可以在一小时内准备和加载微流体装置。一旦加载设备并适应蠕虫，就可以将其他试剂（例如特定的药物或感兴趣的化学线索）输送给蠕虫，以回答有关线虫神经元和遗传系统控制的其他问题。开发后，我们和我们的合作者使用这项技术来剖析线虫的摄食行为以及蠕虫在各种环境中对热休克感染和饥饿的遗传反应。

看完这个视频，你应该对如何使用微流控设备进行纵向论文有了很好的了解。