Name: Optogenetic 在行为小鼠海马θ振荡中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 探索光遗传学技术调控行为小鼠海马θ振荡的方法，用于研究空间导航与神经同步机制。本技术结合电生理记录实现神经元活动的实时精确控制，为理解海马功能及相关疾病提供重要实验手段。

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我们感谢Maria Gorbati在数据分析方面的专业帮助，以及Jennifer Kupferman对稿件的评论。本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG；Exc 257 NeuroCure，TK和AP；优先计划1665，1799/1-1(2)，海森堡计划，1799/2-1，AP）、德国-以色列科学基金会（German-Israeli Foundation for Scientific Research and Development，GIF；I-1326-421.13/2015，TK）以及人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program，HFSP；RGY0076/2012，TK）的支持。

使用10至25周龄的PV-Cre基因敲入雄性小鼠59。小鼠饲养于标准动物设施条件下，维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环。所有实验操作均遵循国家和国际指南，并经当地卫生主管部门批准&#160;（北莱茵-威斯特法伦州自然保护、环境与消费者保护局）。
1. 病毒注射
<ol>
	<li>在整个实验过程中，遵循生物安全指南60穿戴实验服、外科口罩、发网和两副手套。</li>
	<li>用无菌手术刀或剪刀将管路切割至约1米长度，插入泵的注射器固定块中并固定。
	<ol>
		<li>使用注射器将硅油完全填充至导管中。</li>
		<li>检查管路中是否出现气泡。若观察到气泡，请再次用油重新填充管路。</li>
		<li>将柱塞固定到推块上。</li>
		<li>缓慢推动推进器，使其朝向注射器固定块移动，直至柱塞尖端接触管路。</li>
		<li>将推杆尖端插入管路中，并通过选择以低速自动向前移动推进块 &#34;灌注&#34; 在命令窗口中设置较低的输注速率（例如，500 nL/min）直至到达注射器固定块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备注射针头（34G）。
	<ol>
		<li>使用连接切割盘的精密钻机/研磨机进行清晰切割，移除针座。如有必要，使用针头清除新切割表面的金属残留物。</li>
		<li>将毛细管（3-4 cm 长）穿入针头中。</li>
		<li>用强力胶将针头粘接到管子上。</li>
		<li>将注射针连接到与微量注射泵相连的管路末端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将针头固定到立体定位仪支架上。</li>
	<li>抽出空气，直至针头上方透明管中出现气泡。</li>
	<li>使用氧气中1.5-3%异氟烷对小鼠进行麻醉。等待约2-3分钟，通过脚趾夹捏反应确认小鼠是否完全麻醉。手术过程中持续监测动物呼吸，并根据需要调整异氟烷浓度。</li>
	<li>使用无创耳杆将小鼠固定于立体定位仪中。</li>
	<li>用脂质凝胶保护小鼠的眼睛。</li>
	<li>使用0.01–1 mL注射器和26G注射套管，在头部皮肤皮下注射0.1 mL利多卡因。</li>
	<li>用乙醇溶液剃除小鼠头部毛发并进行消毒。&#160;然后用2%氯己定与乙醇交替处理三次&#160; 消毒手术部位。</li>
	<li>使用精细锋利的剪刀，从耳后正中向前至眼睛水平处做一正中切口，暴露前囟和人字缝。</li>
	<li>用注射器将约50 µL的NaCl溶液滴加到颅骨上以清洁颅骨，然后用纸巾和气流吹干。</li>
	<li>通过调节鼻夹的背腹向高度，使小鼠头部的前囟和后囟处于相同的背腹向水平（± 0.3 mm）。</li>
	<li>在视前区上方钻孔（以前囟为参照，AP 0.98，L 0.5 mm）。</li>
	<li>此时，解冻一份病毒样品（应包含至少 2 µL） AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40在室温（RT）下孵育约 5 分钟。</li>
	<li>在室温下以约 4,000 x g 离心 1 分钟。</li>
	<li>将2 µL病毒液滴加到一片Parafilm上；使用先前已保护的一面。</li>
	<li>将注射针尖浸入液体中，在观察液面的同时以约 500 nL/min 的速度缓慢回吸。为防止吸入空气，应在病毒液完全吸尽前停止回吸。根据溶液黏度调整回吸速度；对于黏度较高的病毒液，可适当加快回吸速度以利于吸取。</li>
	<li>用纸巾清洁针头。</li>
	<li>检查病毒是否位于管内，且病毒与油之间由气泡隔开。在管壁上标记病毒液面位置，以便控制注射过程中病毒是否成功注入。</li>
	<li>将针头置于颅骨开孔上方，缓慢插入脑内，到达第一注射位点（AP 0.98，L 0.5，V -5.2，侧向5.5°）。</li>
	<li>以100–150 nL/min的速度注射450 nL病毒。等待10分钟。将针头缓慢上移0.1 mm，再等待5分钟。
	<ol>
		<li>将针头移至第二个注射位点（AP 0.98，L 0.5，V -4.6），以100–150 nL/min的速度注入另外450 nL。</li>
		<li>再次等待10分钟，然后将针头向上移动0.1 mm。再等待5分钟，之后取出针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用黑色编织丝线以方结缝合切口。使用红色灯照射动物以加速恢复。术后每日腹腔注射抗生素（0.3 mL Erycinum（生理盐水1:4稀释））和卡洛芬，持续2-3天。</li>
	<li>在指示病毒液面的标记上方剪断移液管。该移液管可用于后续注射。每次注射前均需准备新的注射针头。 
	注意：该手术耗时约1至1.5小时。动物通常在术后5分钟内苏醒。病毒注射后需等待至少6周以确保轴突充分表达，但不得超过5个月进行立体定位植入手术，因为表达水平在注射后约6个月开始下降。</li>
</ol>
2. 视觉纤维的制备（图1A）
<ol>
	<li>使用多模光纤（105 µm 纤芯，石英包层，0.22 数值孔径）。在光纤仍连接于光纤盘时，使用微剥钳剥离 125 µm 的包层。</li>
	<li>使用金刚石刀将光纤切割至约 2–3 cm 的长度。</li>
	<li>将光纤插入氧化锆陶瓷插针（内径：126 µm）。光纤应从插针的凸面端突出约 0.5–1 mm。</li>
	<li>使用针头在插针两端各滴加一滴环氧胶水，但不要将胶水涂在插针侧面。也可使用氰基丙烯酸酯胶水（速干胶）替代。</li>
	<li>让胶水干燥至少 30 分钟。</li>
	<li>使用金刚石研磨膜（3 µm 粒径）抛光插针的凸面端。</li>
	<li>使用光功率计测试光传输的保真度。
	<ol>
		<li>将光功率计的波长设置为与所用激光器相同的波长。</li>
		<li>将跳线光纤的端面朝向传感器中心放置。开启激光器，读取光功率计的光输出值，并记录该数值。</li>
		<li>通过对接套筒将光学纤维与跳线光纤连接，并将光纤端面朝向传感器中心。开启激光器，读取光功率计的光输出值，并记录该数值。</li>
		<li>计算传输率：将第二个数值除以第一个数值。若传输率低于 0.5，则弃用该光纤；否则可用于植入。</li>
		<li>在植入前对每根光纤测试其传输率。</li>
		<li>在后续实验中，根据光纤的传输率调整激光器的光强输出：将跳线光纤端面的光输出设定为 5–15 除以传输率，以确保光纤端面的最终光输出为 5–15 mW。 
		注：有关光纤制备的更多细节，请参见参考文献 61。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. LFP记录用钨丝电极阵列的制备（图1B）
<ol>
	<li>将若干根（例如6根）100 µm的石英管导管平行粘贴在一段胶带的粘性面上。每根导线阵列组件裁取约4-6 mm长的一段。</li>
	<li>使用镊子将涂有聚乙烯醇缩甲醛绝缘层的45 µm钨丝穿入导管中。</li>
	<li>使用手术刀刮除六根漆包细铜引线（长约5 mm）和一根接地线（长约2-3 cm）两端的绝缘层，然后将它们焊接到纳米连接器的引脚上。</li>
	<li>分别用一滴银导电漆将每根引线与一根钨丝连接。静置干燥至少30分钟。</li>
	<li>在导线上涂抹最少必要量的牙科水泥进行覆盖。注意不要将水泥涂在将要插入脑组织的钨丝部分或纳米连接器的上部。让水泥至少干燥30分钟。</li>
	<li>使用钝口不锈钢剪刀对钨丝进行斜切（5-20°角），以便可靠地将电极植入锥体细胞层腹侧邻近区域的上方或下方，因为在该区域腹侧邻近区的θ波振幅过低，无法准确评估同步化保真度。</li>
	<li>使用手术刀刮除接地线末端约2 mm的绝缘层，然后用助焊剂处理并预先上锡。</li>
	<li>使用数字万用表检查电极之间的潜在串扰。具体操作为：将连接器引脚与设置为电阻测量模式的万用表相连，逐一检测各通道之间的组合；若万用表读数低于5 MΩ，则表明存在显著串扰。</li>
	<li>使用阻抗仪在生理盐水中检测每根导线电极的阻抗。典型阻抗值应低于100 kΩ。</li>
	<li>为便于植入，将一根光纤粘附在导线阵列上，使光纤末端与最短的钨丝处于同一水平位置，且光纤尖端靠近但不接触钨丝。应尽可能减小光纤的倾斜角度，以防止植入过程中对组织造成损伤。 
	注：有关钨丝电极阵列的制备，另请参见参考文献62。</li>
</ol>
4. 立体定位移植
<ol>
	<li>按照步骤 1.6–1.13 所述进行准备工作。</li>
	<li>去除颅骨顶部的结缔组织，并将颈部肌肉充分下压约 2 mm，以防止记录过程中出现肌肉伪迹。</li>
	<li>使用棉签和生理盐水清洁颅骨，并钻出 4 个孔（前部 2 个，小脑上方 2 个，直径 0.8 mm），用于植入不锈钢骨螺钉（00-96×1/16），作为接地和固定植入物之用（图 1D）。将接地螺钉置于小脑上方，并连接一根铜线（长约 2–3 cm）。</li>
	<li>用牙科水泥完全覆盖接地螺钉，以防止电生理记录期间产生肌肉伪迹。用牙科水泥构建一个连接所有螺钉的环形结构（图 1E）。</li>
	<li>在植入侧（海马区，以前囟为参考点，AP -1.94，L 1.4，V 1.4）进行颅骨开窗。在脑组织表面滴加约 5 µL 无菌 NaCl 溶液。</li>
	<li>使用立体定位仪缓慢将电极阵列置入颅骨开窗处。若需进行单细胞记录，则用硅胶探针替代电极丝阵列63；为避免光电信号伪迹，应将光纤单独植入海马区，且光纤尖端不应正对探针（图 1C - I）。若需研究双侧半球间节律同步的协调性，则在对侧海马 CA1 区额外植入一根光纤。</li>
	<li>使用注射器在植入部位上方滴加约 5 µL 预热至 70 °C 的温热液态石蜡/石蜡油，以保护脑组织。</li>
	<li>在电极阵列周围涂布牙科水泥，并覆盖整个颅骨表面。</li>
	<li>使用针头等工具，在预焊的接地/参考导线以及连接至接地螺钉的预焊导线上各加一滴助焊剂，然后使用焊锡机将两根导线熔接。</li>
	<li>用牙科水泥完全覆盖整个接地导线。</li>
	<li>术后立即腹腔注射 0.3 mL Erycinum（用无菌 NaCl 按 1:4 稀释）和卡洛芬（carprofen，5 mg/mL），并在术后至少连续两天继续给药。小鼠通常在术后 15 分钟内苏醒。使用红光灯加热动物以加快恢复。</li>
	<li>术后第一周内每日监测小鼠体重，直至体重稳定。体重下降不应超过术前记录体重的 10%。为加速体重恢复稳定，术后最初几天应为小鼠提供湿粮和炼乳。</li>
	<li>为记录节律刺激期间海马区的细胞活动，将硅胶探针植入海马区（以前囟为参考点，AP -1.94，L 1.4，V 1，后续可进一步下调），方法见参考文献 62（图 1C - I）。将光纤植入海马区（AP -3，L 1.4，V 1.6，头尾向倾斜 39°）。若需刺激胞体，可在隔核（MS）额外植入一根光纤（AP +0.98，L 1，V 3.9，侧向倾斜 15°）。</li>
</ol>
5. 光遗传学刺激与电生理数据采集
<ol>
	<li>使小鼠适应记录装置例如，每次15分钟，每天1-2次，持续3天）。在开始首次实验前观察动物的行为。如果小鼠在实验箱内活动、探索环境、嗅探、进行直立行为， 等等。开始第一次实验。</li>
	<li>将小鼠放入一个熟悉的实验箱中，确保同一房间内没有其他动物。</li>
	<li>使用胶带将LED固定在头件上，以追踪动物的位置。在开始实验前，确保动物在记录箱内探索期间，摄像头能够持续捕捉到LED光源。在黑暗环境中进行记录，以便追踪LED光点。将摄像头置于记录箱上方。</li>
	<li>检查光纤跳线的光输出。根据植入光纤的透射率，估算连接后光纤尖端的光输出。确保光纤尖端的光输出在5-15 mW之间，以实现可靠的节律同步。</li>
	<li>将头级前置放大器连接到慢性植入式连接器。在光遗传学刺激实验中，将光纤连接线连接到慢性植入的海马光纤。在对照光刺激实验中，将光纤连接至与头戴装置相连的假性陶瓷套管。</li>
	<li>将小鼠放入记录室中。</li>
	<li>打开控制刺激发生器的软件以生成刺激程序。</li>
	<li>选择控制473 nm DPSS激光器的通道。在第一行输入3,000 mV（第1列），时间30 ms（第2列），数值0 mV（第3列），时间112 ms（第4列），行重复840次，组重复1次，以生成持续2分钟、频率为7 Hz、脉冲时长为30 ms的刺激方案。若需调整刺激频率或持续时间，可相应修改第4列的时间值及行重复次数。在第二行选择0 mW（第1列），时间500 h（第2列），行重复1次，组重复1次，以确保刺激程序结束后激光器被关闭。</li>
	<li>点击 &#34;文件 &#62; 保存为&#34; 并以所需的文件名保存文件。</li>
	<li>确保刺激器用于触发激光的TTL输出已连接至Digital Lynx模拟输入板，以同步采集电生理和光遗传学数据。</li>
	<li>或者，为了参数化地调控theta振荡频率的变异性，可施加一系列光脉冲刺激，其脉冲间隔按高斯分布设定。针对不同实验方案，调整脉冲间隔的离散程度。 例如，从步骤 3.2 到 15.1 毫秒2. 应用这些方案以生成具有不同theta频率变异性（的theta节律片段）图6).</li>
	<li>打开记录系统的软件。点击 &#34;ACQ&#34; 获取并 &#34;REC&#34; 记录。在开始光刺激前等待，以记录基线行为（例如2 分钟以获取基线速度，或 30 分钟以提取基线位置场。</li>
	<li>打开用于控制刺激发生器的软件。点击 &#34;文件 &#62; 开放&#34; 并选择所需的协议文件。单击 &#34;下载并开始&#34; 以启动光刺激。 
	注意：实验可借助遥控装置进行观察并启动刺激，从而排除实验人员在场对动物行为的干扰。根据研究目的，可在动物特定行为期间启动或终止刺激。</li>
</ol>
6. 海马输出的光遗传学同步与投射特异性抑制的联合方法
<ol>
	<li>按照第1节所述，在PV-Cre小鼠的MS GABA能细胞中表达ChR2。</li>
	<li>此外，在双侧背侧海马半球内共注射2.4 µL CamKIIα依赖性盐视紫红质（eNpHR3.0，AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH）（坐标：AP -1.7；L ± 1.05；V -2.05 和 -1.4 mm；AP -1.7；L ± 1.7；V -2.05 和 -1.55 mm；AP -2.3；L ± 1.5；V -2.2 和 -1.3 mm；AP -2.3；L ± 2.2；V -1.65 和 -2.45 mm）。</li>
	<li>给予6周的表达时间。</li>
	<li>按照第4节所述，在海马CA1区植入带有光纤的钨丝电极阵列。同时，在外侧隔核（LS）双侧植入光纤（坐标：AP 0.1，L 0.25，V -2.25 mm；以及AP 0.5，L -0.3，V -2.7 mm）。</li>
	<li>按照步骤5.4–5.5所述进行光遗传学theta节律同步实验。
	<ol>
		<li>为同时抑制海马向外侧隔核的输出，设计刺激生成方案：例如，在触发输出至473 nm DPSS激光器的脉冲之前，先触发连接593 nm DPSS激光器的输出通道，持续15秒，随后输出连续脉冲，总持续时间为45秒。</li>
		<li>通过多模光纤耦合器和光纤跳线，将LS中的两根光纤连接至593 nm DPSS激光器。</li>
		<li>开始记录，并下载和启动协议以控制刺激生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据处理
<ol>
	<li>使用神经生理学数据（ND）管理器将电生理信号和定位数据分别转换为 .dat 和 .pos 格式64.</li>
	<li>使用 ND Manager 将宽频信号进行低通滤波并降采样至 1,250 Hz，以获取局部场电位（LFP）66.</li>
	<li>在每次记录中，使用 Neuroscope 选择 theta 振荡振幅最大的通道19.</li>
	<li>使用阈值检测算法（采用 MATLAB 函数 findpeaks.m 或类似方法）检测激光脉冲和刺激时段的时间戳11.</li>
	<li>要将 .dat 文件导入多通道数据分析软件，请单击 &#34;文件 &#62; 导入&#34;，选择 &#34;二进制文件&#34; 作为数据类型，并选择 .dat 文件。在配置对话框中，输入正确的通道数和 1,250 Hz 的采样率，然后单击 &#34;好的&#34;，并保存为 .smr 文件。通过选择绘制功率谱 &#34;分析 &#62; 新结果视图 &#62; 功率谱&#34;在设置中，选择theta振幅最高的通道和16,384 FFT尺寸，然后单击 &#34;新&#34;，定义为 &#34;开始时间&#34; 刺激时段的起始点以及 &#34;结束时间&#34; 刺激时段结束，然后单击 &#34;过程&#34;.</li>
	<li>使用多锥法（NW = 3，窗宽 8,192）对 10 秒时间段进行计算，将光遗传学刺激频率范围（刺激频率 ± 0.5 Hz）内累积的功率谱密度（PSD）与 theta 频段（5–12 Hz）内累积的 PSD 的比值作为节律跟随保真度例如，工具包 &#60;http://chronux.org/&#62;).</li>
	<li>排除主导功率谱密度（PSD）峰值 ≤ 5 Hz 的记录时段（即非θ节律时段，使用 MATLAB 函数 find.m）不参与分析。</li>
	<li>根据计算出的神经 entrainment 保真度，使用 MATLAB 函数 sortrows.m 和 pcolor.m 绘制所有记录时段的 LFP 功率谱栅格图。通过点击加载功率谱和 entrainment 保真度 &#34;文件 &#62; 打开&#34;，存储变量 In。类型 Power = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end))。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们介绍了一种广泛适用的方法，用于在行为动物中诱导并引发海马θ振荡。该方法可为研究θ节律在信息处理和行为中的功能提供帮助。该方法的关键要素包括：（1）选择合适的视蛋白，并将ChR2靶向定位至海马中的MS细胞轴突；（2）植入式光纤-电极阵列组件具备稳定的光学与电学特性，以确保在行为小鼠中持续进行光刺激和局部场电位（LFP）记录；（3）在θ频率下施加适量的光照；（4） 事后检验 量化节律同步的保真度，以及(5) 光电伪迹的控制。
第一个要点的主要注意事项是进行安全的病毒注射，同时避免损伤位于内侧的静脉丛。该步骤若手术操作不当，可能降低注射成功率，并可能延迟结果的获取。应考虑视蛋白的动力学特性，例如ChR2（激活时间：2 ms，失活时间：9 ms65）。第二个要点要求在植入前控制光传输的保真度以及记录电极的阻抗，通常还需及时制备额外的植入装置以提高实验成功率。
第三个考虑因素在旨在进行大规模环路操控的光遗传学实验中较为常见，涉及光源和光学连接，通过直径为100 ...

哺乳动物的神经元活动由网络振荡协调，这些振荡有助于脑区内部及脑区之间的信息传递1,2,3,4。脑节律包括从极慢（&#60; 0.8 Hz）到超快（&#62; 200 Hz）频率范围内的各种振荡。大量证据表明，网络振荡参与多种脑功能，包括认知功能5,6,7,8,9,10、先天行为11,12，以及帕金森病和癫痫等神经精神疾病13,14,15。因此，选择性且时间上精确操控网络振荡的实验方法，对于建立符合生理机制的同步化模型以及确立其与行为之间的因果关系至关重要。
网络同步由多种生物基质和过程介导，从离子通道的分子特性及其动力学，到兴奋性的神经调制以及网络连接性。节律发生器的生物设计16 已被揭示出许多脑节律的不同方面，其中（例如、频率、振幅）通常由不同类型细胞及其网络的动力学所决定。例如，以主细胞胞体为靶点的抑制性中间神经元在不同频率波段和脑区中均起着至关重要的作用17,18，包括theta19,20，γ20,21，以及涟波（140-200 Hz）22 振荡。反过来，锥体细胞通过强大的前馈信号传递，使中间神经元的放电重置，从而确保远距离细胞间的相位同步。振荡的一个关键参数——同步化神经元群体的规模——与所测得的局部场电位（LFP）振荡的幅度密切相关，并且至少对于快速振荡而言，该参数依赖于对中间神经元的兴奋性驱动。2相比之下，较慢的振荡（如δ波和θ节律）则由皮层-丘脑间长距离的返回环路产生23,24 海马-内侧隔核投射25,26,27分别地。此类电路中的振荡是由信号传播延迟、可兴奋响应及其参与细胞的频率偏好之间的相互作用引起的。28,29,30,31,32. 内侧隔核GABA能表达小清蛋白（PV）阳性细胞向海马中间神经元的抑制性投射25,33海马旁区和内嗅皮层26 对于内侧颞叶中θ振荡的产生至关重要。因此，利用光遗传学技术可实时精确地操控神经网络振荡和神经元同步的生理机制。
细胞类型特异性的光遗传学操控已被应用于体外in vitro34,35,36,37,38 和体内in vivo30,39,40,41,42,43,44,45 海马和皮层振荡的研究，包括对伽马振荡5,12,36,46,47,48,49,50,51,52、涟波振荡40,53,54 以及睡眠纺锤波55,56 的功能研究。近期，我们在PV-Cre小鼠的内侧隔核（MS）——海马θ节律生成的关键脑区——表达了Cre依赖性的ChR2病毒。利用该实验体系，通过光遗传学刺激MS向海马的抑制性投射，可调控海马θ振荡的特征（频率和时间稳定性）11。此外，在清醒静止状态下，以θ频率光遗传学刺激隔-海马抑制性投射可诱发θ节律。这种光遗传学驱动的θ节律在局部场电位（LFP）和神经元活动水平上均表现出与小鼠自发θ振荡相似的特性。
本方案的关键特征包括：（1）利用在生理上对自发θ振荡至关重要的抑制性通路，同时避免对海马兴奋性产生非特异性影响；（2）轴突 即，针对特定投射的刺激，以最小化对非海马 MS 传出通路的直接干扰；（3）局部 theta 节律性光刺激，确保对 theta 节律性隔-海马动态的直接干扰最小，并实现 theta 振荡的全局双侧同步；（4）对 theta 振荡频率和规律性的参数化控制；以及（5）利用局部场电位（LFP）以高时间分辨率量化同步的保真度，从而在行为动物中实现定量的因果关系分析。由于该实验设计本质上依赖于隔-海马去抑制在 theta 节律生成中已知的重要作用25,30，它能够在活动小鼠中对θ振荡的多个参数实现稳健控制。这些研究操纵了隔-海马环路中其他较少被研究的通路和细胞类型38,39,47,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58 揭示theta节律的更多机制。

<table><tbody><tr><td>PV-Cre 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;手术&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments，Tujunga，美国加利福尼亚州</td><td>Model 963</td><td>超精密小型动物立体定位仪</td></tr><tr><td>钻头，0.8 mm</td><td>Bijoutil，Allschwil，瑞士</td><td>49080HM</td><td></td></tr><tr><td>0.01–1 ml 注射器</td><td>Braun，Melsungen，德国</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 套管</td><td>Braun</td><td>26 G，0.45×25 mm BL/LB</td><td></td></tr><tr><td>精细锋利剪刀</td><td>Fine Science Tools Inc.，Vancouver，加拿大</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11210-10</td><td>Dumont AA - 环氧涂层镊子</td></tr><tr><td>钝头不锈钢剪刀</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14018-14</td><td></td></tr><tr><td>焊接站</td><td>Weller Tools GmbH，Besigheim，德国</td><td>WSD 81</td><td></td></tr><tr><td>红霉素</td><td>Rotexmedica GmbH，Trittau，德国</td><td>PZN: 10823932</td><td>1g 注射用溶液粉末</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;光遗传学&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 泵</td><td>PHD Ultra，Harvard Apparatus，Holliston，美国马萨诸塞州</td><td>model 703008</td><td>带推拉机制的 PHD Ultra 注射泵</td></tr><tr><td>Hamilton 5 &amp;micro;L 注射器，26 规</td><td>PHD Ultra，Harvard Apparatus</td><td>Model 75 RN SYR</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 5 &amp;micro;L 推杆</td><td>PHD Ultra，Harvard Apparatus</td><td>Model 75 RN SYR</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>Fisher Scientific，Pittsburgh，美国</td><td>PE 20</td><td>内径 0.38 mm (.015&quot;)，外径 1.09 mm (.043&quot;)</td></tr><tr><td>Sterican 套管</td><td>Braun，Melsungen，德国</td><td>27 G，25×0.40 mm，钝头</td><td></td></tr><tr><td>精密钻/磨机</td><td>Proxxon，Wecker，卢森堡</td><td>fbs 240/e</td><td></td></tr><tr><td>切割盘</td><td>Proxxon</td><td>NO 28812</td><td></td></tr><tr><td>Cre 依赖性通道视紫红质</td><td>宾夕法尼亚大学载体中心，费城，美国宾夕法尼亚州</td><td>AV-1-18917P</td><td>构建名称：AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato，滴度：1.42×10¹³ vg/ml</td></tr><tr><td>Cam 激酶依赖性盐视紫红质</td><td>宾夕法尼亚大学载体中心</td><td>AV-1-26971P</td><td>构建名称：eNpHR3.0，AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH，滴度：2.08×10¹² vg/ml</td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>ThorLabs，Dachau，德国</td><td>FG105LCA</td><td>0.22 NA，低-OH，&amp;Oslash;105 &amp;micro;m 芯径，400–2400 nm</td></tr><tr><td>陶瓷插针套管</td><td>Precision Fiber Products，Milpitas，美国加利福尼亚州</td><td>CFLC126</td><td>陶瓷 LC 多模套管，内径 126 µm</td></tr><tr><td>抛光纸</td><td>Thorlabs</td><td>LF3D</td><td>6&quot; × 6&quot; 金刚石研磨（抛光）片</td></tr><tr><td>功率计</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>紧凑型功率和能量计主机，数字 4&quot; LCD 显示屏</td></tr><tr><td>多模光纤耦合器</td><td>Thorlabs</td><td>FCMM50-50A-FC</td><td>1×2 多模耦合器，50:50 分光比，50 &amp;micro;m GI 光纤，FC/PC 接口</td></tr><tr><td>光纤跳线</td><td>Thorlabs</td><td>FG105LCA CUSTOM-MUC</td><td>定制，3 米长，带保护套管，套管：FT030，连接器 1：FC/PC，连接器 2：1.25 mm (LC) 陶瓷插针</td></tr><tr><td>套筒</td><td>Precision Fiber Products，Milpitas，美国加利福尼亚州</td><td>ADAL1</td><td>用于 &amp;Oslash;1.25 mm (LC/PC) 插针的陶瓷分体式对接套筒</td></tr><tr><td>473 nm DPSS 激光器</td><td>Laserglow Technologies，Toronto，加拿大安大略省</td><td>R471005FX</td><td>LRS-0473 系列</td></tr><tr><td>593 nm DPSS 激光器</td><td>Laserglow Technologies</td><td>R591005FX</td><td>LRS-0594 系列</td></tr><tr><td>MC_Stimulus II</td><td>Multichannel Systems，Reutlingen，德国</td><td>STG 4004</td><td></td></tr><tr><td>阻抗调节模块</td><td>Neural microTargeting worldwide，Bowdoin，美国</td><td>ICM</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;电生理学&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钨丝</td><td>California Fine Wire Company，Grover Beach，美国加利福尼亚州</td><td>CFW0010954</td><td>40 &amp;micro;m，99.95%</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Optronics</td><td>1068150020</td><td>内径：100.4 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Omnetics 纳米连接器</td><td>Omnetics Connector Corporation，Minneapolis，美国</td><td>A79038-001</td><td></td></tr><tr><td>螺钉</td><td>Bilaney，D&amp;uuml;sseldorf，德国</td><td>00-96x1/16</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>硅胶探针</td><td>NeuroNexus Technologies，Ann Arbor，美国密歇根州</td><td>B32</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器头级</td><td>Neuralynx，Bozeman，美国蒙大拿州</td><td>HS-8</td><td>微型前置放大器头级，单位增益</td></tr><tr><td>导电银漆</td><td>Conrad electronics，德国</td><td>530042</td><td></td></tr><tr><td>液体助焊剂</td><td>Felder GMBH L&amp;ouml;ttechnik，Oberhausen，德国</td><td>L&amp;ouml;t&amp;ouml;l ST</td><td>DIN EN 29454.1，3.2.2.A (F-SW 11)</td></tr><tr><td>LED</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Red-omni-10V</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;软件&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks，Natick，美国马萨诸塞州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC_Stimulus 软件</td><td>Multichannel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>神经生理学数据管理器</td><td></td><td></td><td>NDManager，http://neurosuite.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Klusters</td><td></td><td></td><td>http://neurosuite.sourceforge.net，Hazan 等，2006</td></tr><tr><td>记录系统软件</td><td>Neuralynx</td><td>Cheetah</td><td>https://neuralynx.com/software/cheetah</td></tr><tr><td>多通道数据分析软件</td><td>Cambridge Electronic Design Limited，Cambridge，英国</td><td>Spike2</td><td></td></tr></tbody></table>

行为小鼠中海马θ振荡的光遗传学同步

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

大量关于神经网络振荡与行为之间关系以及跨脑区神经元放电组织的数据，迫切需要开发新工具以选择性地操控脑节律。本文介绍一种将投射特异性光遗传学与细胞外电生理记录相结合的方法，可在自由活动的小鼠中高保真地控制海马θ振荡（5–10 Hz）。该光遗传性同步化具有高度特异性，其机制在于将通道视紫红质-2（ChR2）靶向定位至内侧隔核中的GABA能神经元群体——这类神经元在海马θ振荡的产生中起关键作用，并在海马内局部同步激活一部分抑制性隔核传入纤维。通过同步记录CA1区各层的局部场电位（LFP）和/或神经元放电活动，可验证光遗传节律控制的有效性。利用这一易于实施的实验体系，我们展示了多种光遗传刺激方案在诱导θ振荡以及调控其频率和规律性方面的有效性。最后，将θ节律控制与投射特异性抑制相结合，可用于研究特定传出脑区对海马同步化信息的读取方式。

如第1节所述，将ChR2靶向定位至MS中GABA能细胞的过程如图所示 图 2A. 通过植入CA1区上方的光纤对背侧海马中MS GABA能细胞的轴突进行光遗传学刺激，可在同侧（图2B）以及对侧半球（图2C）。theta振荡可能以不同效率被光遗传学刺激所同步图 3A），其有效性在每个记录时段内通过刺激频率附近的相对θ波局部场电位功率进行计算， 即，同步保真度（图3B。同步保真度高于 0.3， 即，约80%的记录时段中观察到该现象，高于自发性暗光记录中的情况。非θ频率的光刺激效果较差（图3C).
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我们描述了在行为小鼠中利用光遗传学和电生理记录技术选择性操控海马θ振荡（5-10 Hz）的方法。节律性同步的效果通过局部场电位进行监测。结合光遗传学与药理遗传学抑制手段，可研究海马同步活动的传出效应。

大量关于神经网络振荡与行为之间关系以及跨脑区神经元放电组织的数据，亟需开发新的工具……

该方法有助于解答神经生理学领域的关键问题，例如θ振荡在空间导航及相关行为中的因果作用。该技术的主要优势在于能够实时调控行为小鼠海马区θ振荡的频率和规律性。本实验操作将由我实验室前研究生 Franziska Bender 博士进行演示。将完全麻醉的小鼠固定在立体定位仪上。在内侧隔核上方钻一个孔。将注射针尖浸入置于石蜡膜上的一滴病毒液中，同时观察液面，以约每分钟500纳升的速度缓慢吸取病毒液。为防止空气进入注射针头，在病毒尚未完全吸入时即停止抽吸。用纸巾清洁针头。检查病毒与油之间是否由气泡隔开，并在管壁上标记病毒液面的位置。将针头置于颅骨开孔上方，缓慢插入脑内至第一个注射位点。以每分钟100至150纳升的速度注射450纳升病毒。注射完成后，等待10分钟。10分钟后，小心地将针头向上移动0.1毫米，并再等待5分钟。当光纤仍连接在光纤卷轴上时，使用微型剥线钳从多模光纤上剥离125微米的包层。然后，使用金刚石刀将光纤切割至约2至3厘米的长度。将光纤插入内径为126微米的氧化锆陶瓷套管中。光纤应从套管的凸面端突出约0.5至1毫米。使用针头在套管两端各滴加一滴环氧胶，但不要将胶涂在套管的侧面。干燥后，使用粒径为三微米的钻石研磨纤维抛光膜对插芯的凸面进行抛光。制备钨丝阵列时，首先将数个100微米的石英管导向管粘接到一段胶带的粘性面。然后用镊子将涂有聚乙烯醇缩甲醛绝缘层的45微米钨丝穿过导向管。接下来，使用手术刀将六根长约约五毫米的漆包细铜连接线两端的绝缘层剥除。然后，将一根长约约两到三厘米的接地线两端的绝缘层剥除。将每根剥除绝缘层的导线焊接到纳米连接器的引脚上。使用一滴银导电漆将每根键合线连接到一根钨丝上。干燥后，涂上少量水泥以覆盖铜线。避免将水泥涂到纳米连接器的上部。待水泥干燥至少30分钟后，使用钝头不锈钢剪刀以5至20度的角度剪断钨丝。首先，在麻醉动物的清洁颅骨上钻四个直径为0.8 mm的孔，其中两个孔位于冠状缝前方，另外两个孔位于小脑上方。接下来，植入不锈钢骨螺钉以实现接地并固定装置。将连接铜线的接地螺钉置于小脑上方。用牙科水泥完全覆盖接地螺钉，以防止电生理记录过程中出现肌肉伪迹。构建一个连接所有螺钉的牙科水泥环。在植入部位上方进行开颅手术，然后在脑组织表面滴加约一微升无菌生理盐水。使用立体定位仪将导线阵列缓慢降入颅骨开孔中。然后在植入部位上方滴加约五微升温热的液态石蜡，以保护脑组织。将牙科水泥涂抹在电极阵列周围，并用牙科水泥覆盖颅骨。在预先焊有焊料的接地导线或连接至接地螺钉的预焊导线上滴加一滴助焊剂，并使用焊锡机将导线熔接固定。最后，用水泥覆盖整个接地线。检查跳线的光输出。如果植入光纤的传输率为50%，需确保跳线末端的光输出为20毫瓦。将头级前置放大器连接到植入式连接器，并将光纤跳线连接到植入海马的光纤，用于光遗传学刺激。根据所测量参数的要求，记录适当持续时间的基础行为。打开软件以控制刺激发生器。单击文件，打开并选择所需的协议文件。单击下载并开始以启动光刺激。观察光脉冲对θ节律的调控作用。此处显示的是海马区在自发θ振荡期间的局部场电位。注意γ波包络，这是生理性θ节律的一个指标。此处显示的是海马区在光遗传学驱动下以7赫兹频率产生的局部场电位。蓝色条带表示光照应用的时间窗口。注意由箭头所示光脉冲引起的相位重置。海马区局部场电位在10赫兹反映光遗传学驱动的同步化。注意锁相的伽马波包络，以及在刺激过程中，stratham orians层与辐射层（stratum radiatum）之间的相位反转也得以维持。一旦掌握，该技术可在四小时的实验时间内完成，另需六周用于病毒表达。在进行该操作时，必须牢记确保病毒转导效率的重要性。正确连接光纤植入物与光纤跳线，并获取高质量的自发局部场电位θ振荡信号。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

Optogenetic 在行为小鼠海马θ振荡中的作用

来源：Kodani, S.，等．在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控．J. Vis. Exp.

光遗传学操控小鼠睡眠到觉醒转换中的神经环路

本视频展示了一种在遗传工程小鼠模型中通过光敏离子通道调控其GABA能内侧隔核神经元θ振荡的实验方案。通过向海马体传递光脉冲，该方案旨在同步神经元活动并产生θ振荡，并以局部场电位的形式进行记录。...

选择性调控小鼠模型中的θ振荡

本视频展示了在小鼠模型的海马体中进行立体定位植入金属丝电极阵列和光学纤维的操作过程。...

将电极阵列和光纤植入小鼠海马体

本视频展示了在离体海马组织中记录节律性神经元网络活动（也称为θ振荡）的方法。通过将电极插入不同的层次和空间位置，以检测和分析θ振荡，从而揭示海马不同层次中神经元组成的特异性以及神经网络之间的连接性。...

小鼠海马体中θ振荡的体外记录

本视频展示了利用光遗传学方法，通过激活小鼠脑切片中经基因改造的光敏感性中间神经元，调控海马网络动态，增强θ振荡同步性，并研究神经环路行为的技术流程。...

光遗传学调控海马网络动态

振荡是神经网络的基本特性，可受疾病和药物的调节。研究脑片中的振荡有助于在受控条件下对分离的网络进行表征。本文提供了制备急性脑片以诱发CA1区γ振荡的实验方案。...

通过强直刺激诱导海马CA1区γ振荡

海马体中的θ活动与特定的认知和行为阶段相关。本文介绍一种利用时频分析方法检测海马体内高度有序θ振荡的分析技术。即，...

小鼠脑电图中高度有序θ振荡的自动检测

本文介绍了一种从离体全海马组织中记录节律性神经元网络theta和gamma振荡的实验方案。我们详细描述了从海马提取到局部场电位、单细胞单位放电以及全细胞膜片钳记录的实验步骤，同时涵盖了theta节律的光遗传学调控方法。...

调节海马θ节律频段 体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法

本方案描述了使用多叉线性硅探针记录局部场电位的方法。通过电流源密度分析对信号进行转换，可重建小鼠海马中的局部电活动。利用该技术，可在自由活动的小鼠中研究空间受限的脑节律振荡。...

记录行为小鼠海马中空间限制性振荡

本文介绍了在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间，对特定类型神经元进行光遗传学操控的方法，并以我们近期关于终纹床核的研究为例进行说明。...

在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

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行为小鼠中海马θ振荡的光遗传学同步

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