增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体

该方案的总体目标是使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合物在各种细胞和生物体中进行有针对性的基因组改变。这种方法可以帮助解决基本的生物学问题，因为它使研究人员能够在模式和非模式生物的未修饰基因组中生成定制设计的插入、缺失和替换。使用核糖核蛋白或 RNP 复合物代替质粒 DNA 的主要优点是效率更高，并且减少了脱靶事件。

这项技术的影响延伸到体外疗法，以对抗癌症、HIV 或遗传疾病等疾病。这是因为基因组编辑可用于纠正有害突变，甚至增强细胞抵抗有害疾病的能力。因此，这种方法可以提供对原代人类细胞、秀丽隐杆线虫和夏威夷 Parhyale 的见解。

它可以应用于在数百个其他系统中进行遗传改变，包括以前难以处理的生物。按照文本方案中的说明，从设计和制备向导 RNA 开始此过程。通过将 1 至 2 倍摩尔量的向导 RNA 与 200 皮摩尔的 Cas9 蛋白混合，以总体积为 10 μL 来组装 RNP 复合物。

非常缓慢地将浓缩的 Cas9 添加到向导 RNA 中约 30 秒，用移液管快速转圈。使最终的 Cas9 浓度达到 20 微摩尔。接下来，向每个比色皿孔中加入 10 μL RNP。

按照文本方案中的说明制备 HSPC 后，用血细胞计数器计数细胞，并为每个比色皿转移 150， 000 至 200， 000 个细胞，以电穿孔到离心管中。以 100 倍重力离心试管 10 分钟以沉淀细胞。用移液管或真空吸出上清液，去除任何气泡。

每个比色皿孔用 20 μL 电穿孔缓冲液轻轻重悬细胞。然后，将 20 微升含有 150， 000 至 200， 000 个 HSPC 的细胞添加到已经含有 10 微升 RNP 的每个比色皿孔中，并通过上下移液充分混合而不产生气泡。最后，将比色皿放入 Nucleofector 中后对其进行电穿孔。

对于 HSPC，请使用脉冲代码 ER-100。如文本方案中所述，首先在琼脂糖垫中制备秀丽隐杆线虫。将琼脂糖注射垫和盖玻片放在解剖镜上。

使用蠕虫镐沿着垫子的一个边缘铺设一小块卤烃油。然后，使用涂有油的蠕虫镐将几条蠕虫从 NG 琼脂平板上提起，进入油道中。将细毛连接到移液管上，例如睫毛或猫须，将蠕虫平行放置，轻轻地将蠕虫推入琼脂糖垫中。

在对显微注射程序感到满意之前，一次只安装一个注射蠕虫。就位并连接到垫子上后，从蠕虫镐的尖端再滴入几滴卤烃油覆盖蠕虫。将带有安装蠕虫的盖玻片放在注射显微镜上。

在低放大倍率下，将蠕虫垂直于已填充有 RNP 溶液的注射针，如文本协议中所述。切换到高放大倍率并将针头重新定位在性腺臂附近，对应于中晚期厚膜中晚期细胞核附近的区域。使用显微作器，将针头移向蠕虫，稍微压低角质层。

然后，用一只手轻敲显微镜载物台的侧面，使针头穿过角质层。按下注射桨或按钮，用注射混合物缓慢填充性腺臂，然后取下针头。用另一个性腺臂重复该步骤。

注射蠕虫后，取下盖玻片和琼脂糖垫，并将其置于解剖显微镜下。使用拉动的毛细管移液器，通过在蠕虫上移液 M9 缓冲液来置换蠕虫中的油。进行这种处理以从琼脂中释放蠕虫。

10 分钟后，当蠕虫在缓冲液中扭动时，使用拉动的毛细管移液管将它们移至含有 OP50 细菌的 NG 琼脂平板上。将板子在 20 摄氏度下放置 2 到 3 小时，直到蠕虫恢复并四处移动。恢复后，用 OP50 将蠕虫单独转移到 NG 琼脂平板上。

然后，将板转移到 25 摄氏度的培养箱中。首先用 0.02% 丁香油和海水麻醉妊娠雌性，在受精后 0 至 4 小时收集单细胞 Parhyale 胚胎。使用火焰拉动的圆形玻璃移液管和一对钝的 3 号镊子，轻轻地将胚胎从她的腹侧育雏袋中刮出。

使用压缩氮气，使用显微注射器和显微作器在解剖显微镜下注射 Parhyale 胚胎。使用微量加载器移液器吸头将 1.5 微升注射混合物加载到拉动的毛细管后部。在注射装置上设置针头后，在解剖镜下用一对镊子折断针尖。

通过注入卤烃油 700 并测量气泡的直径来校准输送的体积。用剃须刀片从固化剂上切出一个槽。用过滤消毒的海水填充一半，然后将 Parhyale 胚胎排成一排进行注射。

使用显微注射装置注射胚胎，在注射过程中用一对镊子稳定每个胚胎。注射后，使用玻璃移液管将胚胎转移到新鲜的 60 毫米培养皿中，该培养皿中装满了一半的过滤消毒海水，然后在各个阶段解剖和固定胚胎。通过将一根长约 0.5 英寸的弯曲钨丝穿入胰岛素针的末端来制作解剖针。

使用 1 毫升注射器作为解剖针的手柄，并在电流下用氢氧化钠磨尖针头。将新鲜制备的 9 份 PEM 缓冲液、一份 10X PBS 和 1 份 32% PFA 溶液的一半填充三孔玻璃培养皿的一个孔中。将 3 到 5 个胚胎放入培养皿中，用锋利的钨针戳每个胚胎一个小孔，用略钝的针稳定，让蛋黄流出，固定剂流入。

使用一对锋利的钨针，轻轻梳理出 Parhyale 胚胎周围的外侧两层膜。用固定剂解剖它们以使胚胎更健壮，但要快速起作用以防止膜固定在胚胎上，这使得膜的去除更加困难。让胚胎固定总共 15 到 20 分钟进行抗体染色，或者让胚胎固定 40 到 50 分钟进行原位杂交。

有时，编辑实验的结果最好通过实验测定来评估。野生型 T 细胞和 CD25 敲除细胞的代表性结果如下所示。流式细胞术显示，未用 Cas9 RNP 编辑的细胞表达 CD25。

然而，CD25 被敲除的细胞不表达该蛋白。对于大规模扰动，编辑结果可能具有明确的视觉表型。例如，野生型 Parhyale hawaiensis 的腹部正常，有游泳和锚腿。

破坏 Abd-B 基因会用跳跃和行走的腿取代腹部游泳和锚腿，而这些腿通常只与胸部有关。除了检查表型外，实验人员还应分析基因型以评估整体编辑效率并检测特定的遗传变化。对于单个克隆，这可以通过简单的 Sanger 测序来实现。

在混合细胞群中，建议使用更高级的测序分析。例如，TIDE 可以映射 RNP 编辑池中单个细胞中出现的所有不同插入缺失。首次尝试此程序时，请尝试使用我们在表 1 中列出的阳性对照之一。

使用久经考验的向导 RNA 可以帮助您在设计自己的实验之前了解使用 RNP 进行编辑的感觉。