Name: 增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学习使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物在多种细胞和生物体中进行靶向基因组编辑的方法。该技术利用电穿孔和显微注射实现高效基因修饰，为遗传疾病治疗提供新途径。

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我们感谢实验室众多前成员以及湾区基因组编辑领域社区为这些方法的开发所做出的贡献。我们感谢 Ross Wilson 对本文手稿的审阅。
Alexander Marson 的研究得到了 Jake Aronov 捐赠以及美国国家多发性硬化症学会资助（CA 1074-A-21）的支持。Alexander Marson 获得了伯勒斯·威康基金（Burroughs Wellcome Fund）授予的医学科学家职业奖，并且是陈·扎克伯格生物中心（Chan Zuckerberg Biohub）研究员。Jacob E. Corn 的研究得到了李嘉诚基金会、遗产医学研究所（Heritage Medical Research Medical Institute）以及加州再生医学研究所的支持。Behnom Farboud 和 Barbara J. Meyer 的研究部分由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）资助项目 R01 GM030702 支持，Barbara J. Meyer 同时也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。Erin Jarvis 和 Nipam H. Patel 的研究部分由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 IOS-1257379 支持，Erin Jarvis 还获得了 NSF 研究生奖学金（GRFP）以及 Philomathia 研究生奖学金的支持。

作者 Alexander Marson 和 Jacob E. Corn 是 Spotlight Therapeutics 的联合创始人。Jacob E. Corn 担任 Mission Therapeutics 的顾问，其实验室已获得阿斯利康（AstraZeneca）和辉瑞（Pfizer）的资助研究支持。Alexander Marson 担任 Juno Therapeutics 和 PACT Therapeutics 的顾问，其实验室已获得 Juno Therapeutics、&#160;Epinomics、&#160;和赛诺菲（Sanofi）的资助研究支持。其实验室还就 Cas9 RNP 技术申请了相关专利。

在目标细胞系或生物体中建立可靠的基因组编辑方案，需要对本节讨论的多个关键参数进行优化和实证测试。强烈建议尝试此处提供的通用方法的若干变体。本方案的主要局限性在于，将这些方法应用于其他细胞或生物体时，结果可能因所研究物种的不同而有所差异；此外，能够实现高效基因敲除的实验设计，未必能促进DNA插入。因此，我们建议从本文所述方法入手，并按照下文所述进行问题排查与优化。
基因编辑试剂质量的故障排除： 
生成或购买高质量的试剂是任何基因编辑实验方案中的关键步骤。Cas9 蛋白可在实验室中纯化，也可从商业途径获得。许多实验方案中会注明核糖核蛋白（RNP）配制中 Cas9 的终浓度，但最佳的基因编辑活性取决于每批 Cas9 蛋白制备物的特异性活性，而该活性因来源不同而有所差异。在成功运行本文所述方案后，建议通过滴定 Cas9 的用量来优化所用 RNP 的量，以确定最佳浓度：即在实现高效特异性靶标 DNA 切割的同时，避免因 Cas9 过量导致不必要的脱靶切割40。
向导RNA的纯度和均一性也可能是基因组编辑成功与否的决定因素22购买的sgRNA或单独的crRNA与tracrRNA组分通常是高质量的试剂，且提供多种化学修饰选项，可用于解决RNA降解问题或为核糖核蛋白复合物（RNP）赋予额外特性91尽管在常规基因组编辑实验中可能无需使用化学修饰的gRNA，但一些研究团队发现，使用此类试剂可显著提高编辑效率。因此，在熟练掌握实验流程后，或当gRNA降解问题较为明显时，尝试化学修饰的gRNA可能是值得的。22,91. 体外 转录后进行凝胶纯化是一种经济的替代方法，对于常规基因组编辑实验可能已足够17,21,49,50此外，有几种常用方法可用于制备均一的gRNA群体 体内包括基于核酶和tRNA的单个向导RNA切除方法，可扩展应用于 体外 RNA制备以获得更纯净的产物92.
向导RNA与供体DNA设计技巧： 
向导RNA的选择是实现高效靶向编辑并最大限度降低脱靶切割风险的关键因素。为辅助向导RNA的筛选，多项研究已采用高通量筛选结合下一代测序技术，以整合高效向导RNA的序列特征47,79,93,94,95,96这些特征已被用于开发预测算法和在线工具，以辅助向导序列的选择44,45,46,47,48此类算法基于使用DNA系统进行向导RNA表达的筛选。向导RNA通过Pol III启动子表达，因此容易受到Pol III转录相关局限性的影响，例如在遇到连续尿嘧啶序列时可能发生提前终止97,98,99然而，使用由RNPs制备的 体外合成的引导RNA可规避上述问题，并简化了引导序列设计的限制条件。这些算法得出的一个共同特征，已在多种生物体的高效基因组编辑研究中得到验证，即引导序列靶向特异性区域的3′端倾向于存在一个嘌呤，尤其是鸟嘌呤。这一引导序列特征在从哺乳动物到其他生物的多种生物体中均表现出显著有效性。 秀丽隐杆线虫果蝇和斑马鱼65,100,101此外，对于 秀丽隐杆线虫在设计向导RNA时，使其靶向区域的3′端包含一个GG二核苷酸，是预测高效向导RNA的有效策略65理想情况下，应平行测试多个向导序列，以确定哪种向导在特定应用中效果最佳。
在尝试将DNA序列导入基因组时，供体或模板DNA的设计也至关重要。单链寡核苷酸供体（ssODNs）比其他常见的修复模板（如线性双链DNA和质粒DNA）更可靠地插入54,55,102。在某些基因位点，使用与非靶向链或被置换DNA链互补、且具有不对称长度同源臂的ssODNs可提高HDR效率27,55。由于修复模板将被插入到切割位点，并包含靶向序列，因此必须采取措施防止Cas9在基因组插入前后切割供体DNA。这可通过在PAM序列或种子区域引入同义突变来实现，在避免Cas9识别的同时保留插入基因的功能21,103。尽管仅单个核苷酸的PAM改变就可能完全消除Cas9结合104，但仍建议至少改变四个核苷酸以确保安全。
意义与未来应用： 
利用 CRISPR-Cas9 进行基因组编辑已成为一种强大的方法，可实现对任何生物体的便捷遗传操作。尽管 Cas9 RNP 编辑在初期需要更多准备工作，但一旦实验室建立了相应的试剂和实验方案，其使用将变得十分简便。与使用质粒 DNA 相比，采用预先组装的 RNP 对细胞进行编辑可实现更高的整体编辑效率，包括通过同源定向修复（HDR）实现的较难完成的基因插入，并且脱靶效应更少24,25,26,27,29。此外，实验人员可避免因在细胞内分别合成 gRNA 与 Cas9 分子而导致的基因表达、RNA 降解、蛋白质折叠以及二者结合效率等问题22,23。RNP 编辑还可规避在临床应用中使用病毒递送方法时可能出现的插入突变和持续表达所带来的安全性问题14。由于这些优势，许多开展临床前概念验证实验的科学家更倾向于采用 RNP 编辑用于人类治疗。目前，基于 RNP 的体内（in vivo）和体外（ex vivo）基因组编辑策略正在开发中，旨在治疗甚至治愈多种疾病，包括杜氏肌营养不良症105和镰状细胞病27等遗传性疾病，以及 HIV29和癌症11。有趣的是，Cas9 RNP 越来越多地被用作农业工程中的递送手段，因为它能够实现植物的“无 DNA”编辑33,34,36。

CRISPR-Cas9 系统使科学家能够对任何基因组的特定区域进行编辑1。这一快速且成本低廉的技术彻底改变了基础研究，并有望对个性化疾病治疗、精准农业等领域的发展产生深远影响2。CRISPR 编辑是一种普及化的工具，在新实验室中应用该系统无需基因组工程方面的特殊专业知识，仅需基本的分子生物学技能即可。如今，研究人员能够利用少数几种替代性的遗传操作手段，研究此前难以处理的生物体3,4。仅在过去五年中，CRISPR 基因组编辑技术已被用于改造超过 200 种不同的脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物物种。
CRISPR 原核生物防御通路被改造后，用于位点特异性基因组编辑的核心元件包括 Cas9 蛋白（通常来源于 S. pyogenes，经过密码子优化并添加了核定位信号 NLS）及其特异性的 RNA 引导序列5,6。尽管本文未予讨论，其他 Cas9 同源蛋白或 CRISPR 核酸酶也可被使用。天然存在的 gRNA 由两个独立转录的组分构成：CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 crRNA（tracrRNA）7。这两种 RNA 可融合为一条单一转录本，称为单引导 RNA（sgRNA）8。大多数基因组编辑研究者选择更简化的 sgRNA9，但双引导系统也经常被使用10,11。实验人员选择一段 20 个核苷酸（nt）的基因组 DNA 序列作为靶点，确保其邻近存在一段短的许可序列——即原间隔序列邻近基序（PAM），该序列是 Cas9 识别所必需的，并据此设计包含互补序列的 gRNA12。
进入细胞后，RNP复合物会定位其基因组靶标，gRNA与互补的DNA链进行碱基配对，随后酶切割双链DNA，产生双链断裂2。细胞通过至少两种途径之一修复该双链断裂（DSB）：易错的非同源末端连接（NHEJ）途径或同源定向修复（HDR）途径，后者可无缝整合含有与断裂两侧同源“臂”的DNA序列。前一种修复途径通常导致插入或缺失（indel）的形成，从而引起基因失活；而后者则允许研究人员插入或改变DNA序列1。
编辑效率和准确性取决于Cas9和gRNA进入细胞的方式。这些组分可以核酸形式或预先组装的核糖核蛋白复合物（RNP复合物）形式递送至培养细胞、胚胎或生物体13,14,15。常见的基于核酸的递送方法包括病毒转导、转染或电穿孔递送mRNA或质粒DNA。随后，Cas9蛋白和向导RNA在细胞内生成并结合形成复合物。
直接递送核糖核蛋白（RNP）需要分别纯化Cas9蛋白和向导RNA。该过程可在实验室内自行完成，或从多家商业供应商处购买Cas9蛋白和sgRNA。获得后，将Cas9与gRNA混合形成具有酶活性的RNP复合物，并通过向受精卵/胚胎直接注射、基于脂质的转染16或电穿孔的方式导入细胞。首次关于RNP编辑的报道是将其注射至C. elegans性腺中17。显微注射仍是将RNP导入胚胎和完整生物体的首选方法，尽管在小鼠18,19和大鼠20胚胎中也已成功实现有效的电穿孔。本文描述了将RNP直接注射至C. elegans性腺和P. hawaiensis胚胎中的实验方案，并推荐使用一种特殊的电穿孔技术——核转染，用于在编辑原代人细胞时递送RNP。该方法采用优化的电穿孔程序和细胞类型特异性的溶液，可使RNP同时进入细胞质和细胞核21。
使用RNP进行基因组编辑具有多项显著优势。由于蛋白质和RNA组分已预先组装，且可在递送前确保其质量，因此RNP编辑避免了与核酸递送相关的诸多问题。具体而言，不存在Cas9编码DNA整合到宿主基因组的风险，mRNA不会暴露而被降解，同时规避了与之相关的其他问题。 体内 gRNA 或蛋白质表达、折叠与结合22,23此外，与基于质粒的表达相比，使用RNP可导致更低的毒性以及显著减少的脱靶效应，这是由于RNP在细胞内的半衰期较短所致。24,25,26,27.
最后，RNP编辑在多种人类细胞系、原代细胞（如成纤维细胞）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导性多能干细胞（iSPCs）、造血干细胞/祖细胞（HSPCs）和T细胞中均表现出较高的编辑效率。16,24,25,26,27,28,29；在包括无脊椎动物在内的 秀丽隐杆线虫, P. hawaiensis和果蝇3,17,30在斑马鱼、小鼠和大鼠等脊椎动物物种中31,32；包括在植物物种中 拟南芥烟草、生菜、水稻、葡萄、苹果、玉米和小麦33,34,35,36；以及在 衣藻，青霉菌，以及 假丝酵母 物种37,38,39使用核糖核蛋白（RNP）时，插入缺失（indel）形成的频率可能高于质粒递送，且更易于实现HDR介导的DNA插入25,27,29.
本文所述方案采用Cas9核糖核蛋白复合物（RNP），是一种高效且易于调整的技术，可直接应用于多种生物系统40,41，尤其适用于难以操作的细胞以及缺乏成熟精确遗传操作体系的生物体。我们首先介绍如何设计、获取并组装Cas9 RNP，然后阐述其在不同模式细胞类型和生物体中的应用。造血干细胞/祖细胞（HSPCs）和T细胞均采用相同的转染方法——核转染，因此在本方案的第2和第3步中一并描述。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因编辑操作在第4和第5步中说明，夏威夷短尾乌贼（P. hawaiensis）的编辑则在第6和第7步中涵盖。最后，由于任何生物体中基因编辑实验的成功与否均可通过基因型测序来评估，因此第8步概述了针对本方案中所有细胞和生物体可能采用的分析方法的子步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td>IDT将提供定制DNA序列，包括表1中的序列</td></tr><tr><td>向导RNA（gRNA）</td><td>Synthego</td><td>-</td><td>Synthego将提供高质量的S. pyogenes Cas9用sgRNA，包括含有表1中靶向序列的定制sgRNA</td></tr><tr><td>纯化的Cas9蛋白（EnGen&amp;nbsp;Cas9 NLS,&amp;nbsp;S. pyogenes）</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>如有可能，自行纯化Cas9或从本地核心设施购买是成本较低的选择</td></tr><tr><td>正常外周血CD34+干细胞/祖细胞</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&amp;nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3原代细胞4D-核转染X试剂盒</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640培养基，含碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺，液体</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&amp;trade;人T细胞分离试剂盒</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，96孔，圆底</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2</td><td>UCSF药房</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500个装 IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>线虫遗传学中心</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>含线虫生长培养基的琼脂培养皿</td><td>-</td><td>-</td><td>参见Stiernagle T（参考文献59）</td></tr><tr><td>带细丝的标准硼硅酸盐玻璃毛细管：&amp;nbsp;4英寸（100 mm），外径/内径1/0.58</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>单通道标准硼硅酸盐玻璃毛细管：6英寸（152 mm），外径/内径2/1.12&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片；24 &amp;times; 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片；22 &amp;times; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE琼脂糖</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>卤碳油700</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90质粒</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm培养皿</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带细丝的毛细管：4英寸（1.0 mm）&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 &amp;times; 15 mm）</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钨丝（直径0.005英寸）</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全氟烷氧基烷烃（PFA）</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>海水盐</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot;巴斯德移液管</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D核转染仪</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&amp;nbsp;体视显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>已停产。当前型号为M80体视显微镜</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert35倒置相差荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>已停产。当前型号为Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>基于激光的微移液管拉制仪（用于秀丽隐杆线虫实验方案）</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>皮升级微注射仪（用于秀丽隐杆线虫实验方案）</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>三轴操纵杆油压微操纵器</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>粗调操纵器</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪（用于夏威夷短尾乌贼实验方案）</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>微注射仪（用于夏威夷短尾乌贼实验方案）</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Microloader移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-琼脂</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas（CRISPR相关蛋白）系统对真核生物基因组进行位点特异性编辑，已迅速成为研究各类生物学问题的科研人员普遍采用的技术。用户通常使用来自Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白，并将其与一种易于重新编程的向导RNA（gRNA）形成复合物。这些组分被导入细胞后，通过与双链DNA（dsDNA）基因组中互补区域的碱基配对，该酶可在特定位点切割双链，产生双链断裂（DSB）。随后的修复过程将导致随机插入或缺失事件（indels），或在断裂位点整合研究人员提供的外源DNA。
使用纯化的单导向RNA与Cas9蛋白预先组装形成核糖核蛋白复合物（RNP），并将其直接递送至细胞，是实现高效基因编辑的有效方法。RNP编辑尤其能够提高基因插入的效率，而这一结果通常较难实现。与质粒递送相比，Cas9 RNP在细胞内的存留时间较短，因而导致更少的脱靶效应。
尽管CRISPR基因编辑技术具有诸多优势，许多普通用户对该技术仍不够熟悉。为了降低入门门槛，我们详细阐述了在多种情境下实施RNP策略的操作流程，重点介绍了其独特优势和广泛的应用场景。我们涵盖了在两种人类原代细胞——T细胞和造血干细胞/祖细胞（HSPCs）中的基因编辑。此外，我们还展示了Cas9 RNP编辑如何实现对完整生物体的便捷遗传操作，包括经典模式生物线虫Caenorhabditis elegans以及近年来新引入的模式甲壳动物Parhyale hawaiensis。

这些实验展示了如何利用预先组装的 Cas9 核糖核蛋白复合物（RNP）对原代细胞和完整生物体的基因组进行操作。研究人员纯化或购买 Cas9 蛋白与单导向 RNA（sgRNA），将这两种组分混合以预先形成复合物，并将该 RNP 导入目标细胞或生物体中。在给予足够时间以完成基因编辑并产生下一代后代（如适用）后，检测表型和/或收集细胞进行基因分型。根据实验设计，可通过功能检测、表达分析、肉眼或显微镜观察，或其他方法观察表型。
例如，经过基因编辑以纠正导致镰状细胞病的β-珠蛋白突变的造血干细胞和祖细胞，可被诱导分化为红细胞，并检测其是否产生正常血红蛋白或镰状血红蛋白27,87 (图1A). 敲除高亲和力IL-2受体基因CD25的T细胞IL2RA可通过表面染色和流式细胞术进行分析88，并通过功能分析检测对IL-2刺激的信号响应（图1B。T细胞还可通过多种具有重要临床意义的方式进行重编程，这些方式需要评估不同的表型，包括HIV感染的有效性89 以及 体内 CAR-T细胞的抗肿瘤功效11.
采用共CRISPR/共转化筛选策略，可同时对 C. elegans 蚓在两个位点进行基因编辑62。利用ssODN修复模板在参考基因 dpy-10 处进行HDR，可产生易于观察的显性 dpy-10 功能获得性突变。杂合的F1 dpy-10(gof) 个体表现为滚动表型（Rol），而纯合的 dpy-10(gof) 个体则表现为矮胖表型（Dpy）。该表型的出现表明Cas9已在这些个体中成功编辑，从而提高了在Rol或Dpy的F1个体中鉴定出第二个位点编辑事件的概率。一次成功的编辑实验中，应有33–50%的注射P0个体产生20个或更多具有Rol或Dpy表型的F1后代90。随后可选择非Rol个体，使 dpy-10 恢复为野生型，并筛选目标基因的纯合编辑子。一般经验法则是，靶向共CRISPR参考基因的crRNA浓度应为目标基因crRNA浓度的一半。若未能获得目标基因的编辑，可调整两种CRISPR RNA的比例，以提高获得目标突变的可能性。例如，相对于参考基因的crRNA，增加目标基因crRNA的用量，可提高在同时具有参考基因位点编辑的虫群中，目标基因发生编辑的个体比例。共转化频率存在差异，但通常为20–60%，常可在F1代获得纯合编辑（图1C）。
P. hawaiensis 孵化幼体经基因编辑敲除Abdominal-B基因（Abd-B）后表现出明显的形态学异常3（图1D）。该基因对腹部正确模式形成至关重要，其功能缺失会导致原本应出现在腹部的游泳足和锚定足被胸节类型的跳跃足和行走足所取代。
在基因型水平上确定基因组编辑结果需要进行测序或采用其他相应方法 体外 检测序列变化的实验方法。在此，我们展示了来自模式细胞类型和生物体的代表性测序数据，重点说明了不同编辑效率定量分析方法。请注意，图中标签为通用化表示，因为此处展示的所有方法均可适用于任何生物系统。
基于测序的分析方法在技术复杂性和结果深度方面各不相同。对于克隆性编辑群体或易于分离的个体生物，可在提取基因组DNA后对编辑个体进行测序。标准的Sanger测序结果将揭示特定个体中Cas9切割位点的序列变化，并可推测可能破坏其功能的移码突变（图2A）。另一种基于Sanger测序的方法是使用在线工具，适用于混合群体而非单个突变体78。该工具可通过在线分析估算总体编辑效率以及主要的序列编辑结果。代表性数据如图2B所示。
此处描述的最全面的测序方法是深度测序（有时称为高通量测序或下一代测序）。该方法可从混合群体中的单个基因组获取DNA序列。此类数据可以通过多种方式展示。在此，我们根据编辑结果对来自编辑细胞的单个测序读段进行了分类（图2C）。大多数细胞通过NHEJ通路被编辑，这通常导致基因功能破坏。在其他细胞中，目标基因则通过HDR被替换为另一种版本27。
<img alt="基因编辑方法表格；HSPCs、T细胞、秀丽线虫、夏威夷嗜皮菌；测序与分析。" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表1"> 
表1：初步基因组编辑实验的阳性对照。本表列出了在本实验方案所述的每种细胞和生物中首次进行基因组编辑实验所需的关键信息。遵循这些参数通常可获得成功的结果，可用于验证实验流程，或作为研究者后续针对自身感兴趣基因进行编辑时的基准对照。F：正向，R：反向，HDR：同源定向修复。<a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="HSPCs HBB, T细胞 CD25, C. elegans yfg, P. hawaiensis Abd-B 表型评估示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：Cas9 RNP编辑人原代细胞及模式生物后的代表性表型结果。（A） 此图为高效液相色谱（HPLC）图谱，显示基因组编辑成功后，分化为晚期成红细胞的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）产生的功能性血红蛋白多于镰状血红蛋白。突变红细胞产生镰状血红蛋白（HbS），而成功编辑的细胞则可产生健康血红蛋白（HbA 和 HbA2）以及胎儿血红蛋白（HbF）。吸光度以任意单位（au）表示。该图首次发表于 DeWitt 等人27，经美国科学促进会许可转载。（B） 左侧图示显示，在每种实验条件下，经表面染色的T细胞在使用RNP敲除CD25基因后不再表达CD25的流式细胞术数据。CD25丰度显示在x轴，细胞大小显示在y轴。右侧图示显示在IL-2诱导后，各条件下的磷酸化Stat5（pStat5）定量结果。当IL-2受体缺失（CD25基因敲除）时，信号通路显著减弱。pStat5丰度显示在x轴，三组不同浓度IL-2刺激下的数据在垂直方向上进行比较。（C） 该图示展示了一项针对Caenorhabditis elegans的共CRISPR/共转化筛选实验，以dpy-10作为共转化标记。两条向导RNA在同一P0代显微注射动物中分别靶向dpy-10和目标基因（yfg）。在dpy-10位点发生HDR（同源定向修复）后，产生Rol或Dpy表型。筛选出Rol或Dpy表型的F1代个体，可显著提高在第二个靶位点检测到基因编辑事件的概率。（D） 该图示显示野生型Parhyale hawaiensis幼体具有正常腹部结构，带有游泳肢和锚定肢。而Abd-B基因敲除的幼体（F0个体）腹部向胸节转化，导致游泳肢和锚定肢消失，并被与正常胸节相关的跳跃肢和行走肢所取代。<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑分析；包括Sanger测序、TIDE、深度测序；CRISPR Cas9编辑结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：编辑结果分析方法的典型结果。（A）本图展示了来自单个F1 P. hawaiensis个体的Sanger测序结果示例，包括野生型序列以及三种通过移码突变破坏基因功能的不同插入缺失（indel）。（B）这些TIDE结果展示了在一批测序的T细胞中，Cas9靶位点处发生的插入和缺失事件的范围。横轴表示特定插入或缺失的核苷酸长度。（C）这些深度测序结果表明，在未进行核转染或未使用gRNA的情况下无基因组编辑发生，而在HSPCs中使用完整的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）可实现成功的基因编辑，结果按DNA修复类型分组。<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

位点特异性的真核生物基因组编辑利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas（CRISPR相关）系统可实现……

本实验方案的总体目标是利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物，在多种细胞和生物体中实现靶向基因组编辑。该方法使研究人员能够在模式生物和非模式生物的未经修饰基因组中，定制化地引入插入、缺失和替换，从而有助于解答基本的生物学问题。与使用质粒DNA相比，采用核糖核蛋白（RNP）复合物的主要优势在于编辑效率更高，且脱靶效应更少。该技术的应用前景可拓展至用于对抗癌症、艾滋病病毒（HIV）或遗传性疾病等疾病的离体治疗。这是因为基因组编辑可用于纠正有害的基因突变，甚至增强细胞抵抗有害疾病的能力。因此，该方法可为研究人类原代细胞、秀丽隐杆线虫（C.elegans）以及夏威夷短额虫（Parhyale hawaiensis）提供重要见解。该方法可应用于数百种其他系统中的基因改造，包括此前难以处理的生物体。按照文本方案中所述，首先设计并制备向导RNA。将向导RNA以一到两倍摩尔量与200皮摩尔Cas9蛋白在总体积为10微升的溶液中混合，组装成RNP复合物。非常缓慢地将浓缩的 Cas9 加入向导 RNA 中，持续约 30 秒，同时用移液器快速画圈混匀，使最终的 Cas9 浓度达到 20 微摩尔（µM）。接下来，向每个电穿孔杯孔中加入 10 微升（µL）RNP 复合物。按照文本方案制备造血干细胞和祖细胞（HSPCs）后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将每管150,000至200,000个细胞转移至电穿孔用比色皿，随后转入离心管中。以100 × g离心10分钟，使细胞沉淀。使用移液器或真空装置吸除上清液，注意去除任何气泡。每比色皿孔中加入 20 微升电穿孔缓冲液，轻柔重悬细胞。然后，向已含有 10 微升 RNP 的每个比色皿孔中加入 20 微升细胞，细胞数量为 150,000 至 200,000 个 HSPC，并通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。最后，将比色皿放入核转染仪中进行电穿孔。对于HSPCs，使用脉冲程序ER-100。按照文字方案中的描述，开始制备琼脂糖载片上的秀丽隐杆线虫。将琼脂糖注射载片和盖玻片置于解剖显微镜下。使用线虫挑取工具沿垫片的一边涂抹少量卤代烃油。然后，用涂有油的线虫挑取工具将多条线虫从NG琼脂平板上挑起，并放入油迹中。使用连接在移液管上的细毛（如睫毛或猫须），将线虫并排排列，并轻轻推动线虫使其接触琼脂糖垫。在尚未熟练掌握显微注射操作之前，每次仅固定并注射一条线虫。将线虫放置到位并附着于载片垫上后，用挑虫针尖端滴加数滴卤代烷油覆盖线虫。将载有固定线虫的盖玻片置于显微注射镜下。 在低倍镜下，将线虫垂直于注射针摆放，针内已按文本方案说明装入RNP溶液。切换至高倍镜，重新调整针的位置，使其紧邻性腺臂，对应于中期至晚期粗线期细胞核附近的区域。使用显微操作器，将注射针推向线虫，轻微下压角质层。然后，用一只手轻敲显微镜载物台侧面，使针头刺穿角质层。按下注射踏板或按钮，缓慢将注射混合物注入另一侧的性腺臂，然后取出针头。对另一侧的性腺臂重复此步骤。注射完成后，移去盖玻片和琼脂糖垫，将样本置于解剖显微镜下。使用拉制的毛细移液管，通过在样本上滴加M9缓冲液，将覆盖在蠕虫上的油置换掉。进行此处理以使蠕虫从琼脂中释放出来。10 分钟后，当线虫在缓冲液中剧烈翻滚时，使用拉制的毛细移液管将其转移到含有 OP50 细菌的 NG 琼脂平板上。将平板置于 20 摄氏度环境中 2 至 3 小时，直至线虫恢复活动并开始爬行。恢复后，将线虫逐个转移至含有 OP50 细菌的 NG 琼脂平板上。然后，将培养皿转移至25摄氏度的培养箱中。通过使用0.02%丁香油和海水对怀卵雌性个体进行麻醉，收集受精后0至4小时的单细胞Parhyale胚胎。使用火焰拉制并磨圆的玻璃移液管以及钝头3号镊子，轻轻将胚胎从其腹侧育卵囊中刮出。使用压缩氮气，在解剖显微镜下利用显微注射仪和显微操作器对 Parhyale 胚胎进行注射。用移液器吸头将 1.5 µL 注射混合液吸入拉制好的毛细管后端。将注射针安装到注射装置上后，在解剖显微镜下用镊子折断针尖。通过将液体注入700号卤代烃油并测量气泡直径，校准递送体积。使用剃刀片从固化剂中切出一条槽，加入过滤除菌的海水至半满，将Parhyale胚胎排列于槽中以进行显微注射。使用显微注射装置注射胚胎，在注射过程中用一对镊子固定每个胚胎。注射后，用玻璃转移移液管将胚胎转移至盛有半量滤膜除菌海水的新鲜60毫米培养皿中，随后在不同发育阶段对胚胎进行解剖和固定。通过将一段长约0.5英寸的弯曲钨丝插入胰岛素针头末端，制备解剖针。使用一个1毫升的注射器作为解剖针的手柄，并在电流作用下于氢氧化钠溶液中将针尖 sharpen。取一个三孔玻璃培养皿，将其中一孔加满新鲜配制的固定液，该固定液由9份PEM缓冲液、1份10X PBS和1份32% PFA组成，液面加至孔的一半。将3至5个胚胎放入培养皿中，用锋利的钨针在每个胚胎上刺出一个小孔，同时用稍钝的针固定胚胎以保持稳定，使卵黄流出，固定液进入胚胎内部。使用一对锋利的钨针，轻轻剥离包裹在 Parhyale 胚胎外侧的两层膜。在固定液中进行解剖，以使胚胎更加坚固，但操作需迅速，防止膜与胚胎固定在一起，否则会增加去膜难度。抗体染色时，胚胎固定总时间为 15 至 20 分钟；原位杂交时，固定时间为 40 至 50 分钟。有时，通过实验检测来评估基因编辑实验的结果最为合适。此处展示了野生型T细胞和CD25基因敲除细胞的代表性结果。流式细胞术结果显示，未使用Cas9核糖核蛋白（RNP）进行编辑的细胞表达CD25。然而，CD25基因被敲除的细胞不表达该蛋白。对于大规模扰动，编辑结果可能具有明显的视觉表型。例如，野生型夏威夷短额虫具有正常的腹部，并具备用于游泳和固定的附肢。破坏 Abd-B 基因会将腹部的游泳足和锚定足转变为跳跃足和行走足，而后者通常仅与胸部相关。除了观察表型外，实验人员还应分析基因型，以评估整体编辑效率并检测特定的遗传改变。对于单个克隆，可通过简单的桑格测序实现。在细胞混合群体中，建议采用更高级的测序分析方法。例如，TIDE 可以绘制出 RNP 编辑群体中各个细胞内发生的所有不同插入缺失（indel）图谱。初次尝试该实验流程时，建议使用我们在表一中列出的阳性对照之一。使用经过验证的引导 RNA 可以帮助您在设计自己的实验之前，熟悉 RNP 编辑的操作。

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科研

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遗传学

增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体

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利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

子囊菌门丝状真菌 Huntiella omanensis 中的 CRISPR-Cas9 介导基因组编辑

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使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

学习使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物在多种细胞和生物体中进行靶向基因组编辑的方法。该技术利用电穿孔和显微注射实现高效基因修饰，为遗传疾病治疗提供新途径。

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