尼罗红与油红 O 染色法测定秀丽线虫的脂质丰度及脂质分布评价
2018年3月5日
固定秀丽线虫的尼罗河红色染色是一种定量测量中性脂质矿床的方法, 而油红色 O 染色有助于定性评价组织间脂质的分布。
这些染色方法的总体目标是量化细胞内脂质丰度并评估不同组织之间的脂质分布。这种方法可以帮助回答脂质代谢中的关键问题，例如脂质如何进行遗传和生化调节以及哪些疾病调节脂质稳态。这种技术的主要优点是执行起来相对简单且成本低廉。
为了进行尼罗红脂质染色，将蠕虫铺在线虫生长培养基或接种晚 log OP50 大肠杆菌的 NGM 上，并在 20 摄氏度下生长蠕虫至 L4 早期。用 1 毫米 PBST 溶液洗涤蠕虫，并将蠕虫悬浮液转移到 1.5 毫升微量离心管中。将蠕虫以 560 倍重力离心 1 分钟。
然后去除上清液并重复 PBST 洗涤，直到从悬浮液中清除大肠杆菌。接下来，向蠕虫沉淀中加入 100 微升 40% 异丙醇或 60% 用于 ORO 染色，并在室温下孵育样品 3 分钟。添加异丙醇对于染色前蠕虫的适当透化至关重要。
将蠕虫以 560 倍重力离心 1 分钟，然后去除上清液，不要破坏蠕虫沉淀。在离心步骤中尽量减少光照非常重要。现在，在黑暗中，向每个样品中加入 600 微升先前制备的 NR 工作溶液。
将试管倒置 3 次，将蠕虫和溶液充分混合。然后将样品在室温下避光孵育 2 小时。孵育后，离心蠕虫并去除上清液。
然后加入 600 μL PBST，将样品在黑暗中孵育 30 分钟，以去除多余的 NR 染色剂。像以前一样再次旋转样品后，除去大约 50 μL 的上清液外，除去所有上清液，并将蠕虫沉淀重悬于剩余的溶液中。为了准备用于成像的载玻片，将 5 微升蠕虫悬浮液移液移液到显微镜载玻片上，并小心地盖上盖玻片以避免捕获任何气泡。
使用 FITC GFP 通道对 NR 染色的蠕虫进行成像并尝试不同的曝光时间，以五倍放大倍率对蠕虫进行成像，以在每个视野中捕获几只动物。然后切换到 10 倍放大倍率，以便更好地定量单个蠕虫。要量化图像，请将显微照片上传到 ImageJ。
在图像下拉菜单中，调整图像面板的亮度、对比度，并通过单击应用将更改传播到所有图像。使用多边形选择工具描绘每个成像蠕虫，然后在分析下拉菜单下，使用测量功能来限定 NR 发射的荧光强度。对于每张图像，测量五个背景位置并计算平均背景荧光强度。向每个样品中加入 600 μL 油红 O 或 ORO 工作溶液，并将试管倒置 3 次，以将蠕虫和 ORO 充分混合。
以 30 RPM 和 RT 旋转样品 2 小时。将样品以 560 倍重力离心 1 分钟，并吸出除 100 μL 以外的所有上清液。然后使用 600 μL PBST 重悬样品，并以 30 RPM 的速度旋转试管 30 分钟，以去除多余的 ORO 染色。
为了更好地区分动物生殖系在肠道细胞中的位置，每1毫升ORO工作溶液中加入1微升DAPI对细胞核进行染色。然后准备用于成像的载玻片，重悬蠕虫和剩余的上清液，并将溶液充分混合。将 5 微升蠕虫悬浮液放在显微镜载玻片上，小心地盖上盖玻片，确保没有气泡形成。
要对 ORO 染色的蠕虫进行成像，请使用放大 5 倍的彩色相机在一个视野中对多个蠕虫进行成像。然后切换到 10 倍放大倍率，以便更好地检查单个蠕虫。最后，在将图像上传到 ImageJ 并根据文本协议创建图像组后，根据动物体内或特定组织中的脂质积累对图像进行分类。
SKN-1 与哺乳动物 Nrf2 具有同源性，并已被证明可介导脂肪酸氧化。该图显示了活化的 SKN-1 动物暴露于导致脂质水平升高的条件下。从这些图像中可以看出，使用 FITC GFP 通道捕获的 NR 荧光在肠道沿线很突出，但在头部、尾部和肠腔中较暗。
虽然根据是否存在年龄依赖性体细胞脂肪消耗或 ASDF 很容易对蠕虫进行分类，但可能很难识别中等脂肪减少的动物。与全身呈鲜红色染色且几乎没有半透明区域的非 ASDF 动物相比，ASDF 蠕虫在肠道细胞中表现出明显的脂肪消耗。处于 ASDF 发展过程中的动物经常出现半透明斑点，大部分脂肪流失最终发生在这里。
此外，ASDF 蠕虫在头部和尾部区域可能仍具有鲜红色染色，因为表型不是由完全体细胞脂肪减少定义的，而是由相对于非老年动物的广泛脂肪消耗定义的。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内加上成像时间完成。在尝试此程序时，请务必记住在染色前不超过 30 分钟清洗和透化蠕虫。
按照此程序，可以执行其他方法（如 CARS 显微镜）来比较每种技术识别的脂质种类类型，并确定哪种方法更适合特定类型的问题。观看此视频后，您应该对如何使用 Nile Red 和 Oil Red O 染色定量脂质并评估蠕虫中的脂质分布，然后进行 ImageJ 显微照片分析有很好的了解。
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概述
尼罗红染色法用于定量测量固定秀丽隐杆蚯蚓的中性脂质沉积，而油红O染色法则用于定性评估组织中的脂质分布。这些技术对于理解脂质代谢及其调节至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 脂质代谢
背景
- 细胞内脂质丰度对于细胞功能至关重要。
- 不同组织中的脂质分布各不相同。
- 理解脂质代谢可以帮助了解疾病状态。
- 简单且经济的染色方法对于研究有益。
研究目的
- 量化细胞内脂质丰度。
- 评估组织中的脂质分布。
- 探索脂质的遗传和生化调节。
使用的方法
- 将蠕虫在接种大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）上培养。
- 在20摄氏度下培养蠕虫至早期L4阶段。
- 用PBST溶液清洗蠕虫。
- 以560倍重力离心蠕虫一分钟。
主要结果
- 成功定量测量中性脂质沉积。
- 有效定性评估脂质分布。
- 对脂质代谢调节有新的认识。
- 展示了方法的简单性和经济性。
结论
- 尼罗红和油红O染色是有价值的技术。
- 这些方法增强了对脂质代谢的理解。
- 它们为未来的脂质稳态研究提供了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative and qualitative lipid analysis in Caenorhabditis elegans using Nile Red and Oil Red O staining provides a scalable, cost-effective platform for interrogating lipid metabolism genes and pathways. These methods enable high-throughput screening and functional target validation relevant to metabolic disease research. Their reproducibility and accessibility support early-stage discovery and mechanistic de-risking in metabolic and energy homeostasis pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and biochemical regulators of lipid metabolism.
- Supports functional validation of conserved lipid genes implicated in human disease.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping lipid distribution across tissues.
- Provides a platform for rapid triage of metabolic pathway targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible staining protocols for quantitative lipid measurement.
- Supports high-throughput screening of gene or compound effects on lipid accumulation.
- Enables standardized image-based quantification using open-source tools like ImageJ.
- Prepares robust biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for metabolic syndrome and related disorders.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of lipid-modulating interventions.
- Enables comparative analysis with advanced label-free lipidomics for translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of metabolic targets based on functional lipid phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
These staining and quantification methods integrate at the early discovery and screening stages, bridging genetic target identification with phenotypic validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid regulation and pathway mapping in a genetically tractable system.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or gene perturbation studies.
- Analytics: Enables standardized fluorescence and colorimetric measurements for cross-condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with human metabolic disease pathways through conserved gene analysis.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable workflow for metabolic research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for lipid quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of metabolic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and imaging techniques.
- Needs access to fluorescence and colorimetric microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization.
- Limited in resolving lipid species diversity; complementary label-free methods may be needed for detailed lipidomics.
