Name: 尼罗红与油红 O 染色法测定秀丽线虫的脂质丰度及脂质分布评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习使用尼罗红与油红O染色法对秀丽线虫Caenorhabditis elegans进行脂质定量与分布分析。该方法简便经济，适用于研究脂质代谢调控机制及疾病相关脂质稳态变化。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目：R01GM109028（S.P.C.）支持。

1. 脂质的尼罗红（NR）染色
<ol>
	<li>5 mg/mL NR 储存液的制备
	<ol>
		<li>在 500 mL 瓶中，将 100 mg NR 粉末加入 200 mL 100% 丙酮中。</li>
		<li>用铝箔包裹瓶体，避免接触任何光线。</li>
		<li>使用前，在避光条件下搅拌溶液 2 小时。</li>
		<li>长期使用时，将 NR 储存液保存在密封严密、避光的瓶中。根据研究需要调整 NR 储存液的配制量。为获得一致的染色和成像结果，所有 NR 染色实验应使用同一批次的储存液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NR 工作液的制备
	<ol>
		<li>每 1 mL 40% 异丙醇（v/v），加入 6 µL NR 储存液。</li>
		<li>每个样品准备 600 µL NR 工作液。 
		注意：染色前现配 NR 工作液。根据所需 NR 储存液的体积，选用 15 mL 或 50 mL 带刻度的锥形管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫 NR 脂质染色前处理
	<ol>
		<li>在接种了对数晚期 OP50 大肠杆菌（E. coli）的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至早期 L4 阶段。</li>
		<li>用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液 + 0.01% Triton X-100（PBST）溶液将线虫从培养板上冲洗下来，并将线虫悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，重复此步骤直至悬液中无 E. coli 残留。</li>
		<li>向线虫沉淀中加入 100 µL 40% 异丙醇，在室温下孵育 3 分钟。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，注意不要扰动线虫沉淀。 
		注意：若使用较大培养板或每板染色更多线虫，应增加 PBST 用量以充分冲洗线虫。线虫固定前，PBST 清洗时间不应超过 15 分钟。若上清液中细菌未完全清除，需增加清洗次数。在 40% 异丙醇中的孵育步骤应使用旋转混合仪（nutator）或摇床进行。始终监控离心管，确保样品充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NR 脂质染色
	<ol>
		<li>在避光条件下，向每个样品中加入 600 µL NR 工作液，轻轻颠倒离心管三次，使线虫在 NR 溶液中充分混匀。</li>
		<li>在室温避光条件下旋转孵育 2 小时。</li>
		<li>孵育结束后，以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>加入 600 µL PBST，在避光条件下孵育 30 分钟，以去除多余的 NR 染料。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，仅保留约 50 µL 上清液。 
		注意：NR 孵育步骤无需振荡。此过程中线虫沉淀是正常现象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜成像载玻片的制备
	<ol>
		<li>将线虫沉淀用剩余上清液重悬。</li>
		<li>取 5 µL 线虫悬液滴加于显微镜载玻片上，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>成像前用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>每次仅制备少量载玻片，以确保各样品间 NR 成像条件一致。NR 染色样品的图像质量在 6 小时后逐渐下降，脂滴结构变得难以分辨，背景荧光增强，干扰 NR 信号的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NR 染色线虫的成像
	<ol>
		<li>以 5× 放大倍数成像，使每个视野中包含多个个体。</li>
		<li>切换至 10× 放大倍数，以便更准确地对单个线虫进行定量分析。</li>
		<li>使用 FITC/GFP 通道对 NR 染色线虫进行成像，并尝试不同曝光时间，以确定最佳定量条件。</li>
		<li>将文件保存为 TIF 格式，避免因压缩导致数据丢失。 
		注意：典型曝光时间范围为 100–1000 ms。确定最佳曝光时间后，所有样品均应使用相同参数，以保持成像一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NR 染色图像的定量分析
	<ol>
		<li>将显微图像上传至 ImageJ 软件。若图像文件未被识别，可在 Plugins 下拉菜单中使用 Bio-Formats 功能。</li>
		<li>在 Image 下拉菜单中，通过 Stacks 功能下的 Images-to-Stack 选项，将多张显微图像合并为图像栈。</li>
		<li>在同一菜单中，调整图像栈的亮度/对比度，并点击 Apply 以将更改应用至所有图像。</li>
		<li>使用多边形选择工具（Polygon selection tool）勾勒每个成像线虫的轮廓，并通过 Analysis 下拉菜单中的 Measure 功能，量化 NR 发出的荧光强度。</li>
		<li>对每张图像，测量五个背景区域，计算平均背景荧光强度。</li>
		<li>使用公式 N = G - (A × B) 从每个线虫的总荧光强度中扣除背景信号，其中 N 代表净荧光强度，G 代表总荧光强度，A 代表线虫总面积，B 代表平均背景荧光强度。</li>
		<li>为根据线虫大小对荧光强度进行归一化处理，将每个线虫的净荧光强度除以其总面积。结果以每像素的任意单位（a.u.）荧光强度表示。 
		注意：避免将图像导出为 JPEG 格式。尽管该格式可减小文件体积，但会损害数据完整性。确保所有图像经过相同的处理和分析流程。务必添加比例尺，以便在不同放大倍数下准确评估尺寸。为在 ImageJ 中更清晰地显示荧光强度差异，可将图像类型从 RGB 转换为 8 位，并在图像查找表（LUT）菜单中选择 Fire 选项。此操作将生成热图图像，其中颜色亮度越高表示荧光强度越强。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂质的油红O染色（ORO）
<ol>
	<li>ORO 储存液的制备
	<ol>
		<li>在 250 mL 的瓶子中，将 500 mg ORO 粉末加入 100 mL 100% 异丙醇中，并充分混匀。</li>
		<li>配制完成后，将溶液密封保存，避免光照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO 工作液的制备
	<ol>
		<li>将 ORO 储存液按 3:2 的比例用水稀释，得到 60% 的异丙醇溶液。</li>
		<li>使用前，用 0.2 µm 醋酸纤维素无菌注射滤器过滤 ORO 工作液。 
		注意：为获得最佳溶液质量，建议在使用前一天配制 ORO 工作液，并过夜混匀。若需当天配制，则稀释后在摇床中混匀至少 2 小时。摇动前，用石蜡膜包裹锥形管，防止 ORO 溶液泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 ORO 脂质染色的线虫制备
	<ol>
		<li>在接种了对数后期 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至所需发育阶段。</li>
		<li>向培养皿中加入 1 mL PBST 溶液，轻轻旋转使所有线虫脱离培养基表面。倾斜培养皿，再用 1 mL PBST 冲洗一次。将线虫悬液转移至 1.5 mL 微离心管中。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，小心去除上清液，保留沉淀。用 1 mL PBST 重复洗涤三次，每次均去除上清液，最后仅保留 100 µL 上清液。</li>
		<li>向线虫沉淀中加入 600 µL 40% 异丙醇，在室温下摇动 3 分钟。</li>
		<li>以 560 × g 离心 30 秒，去除上清液，仅保留 100 µL，注意不要破坏线虫沉淀。 
		注意：若进行高通量染色，可使用更大体积的 PBST 将线虫从培养皿中洗下。在固定样品前，不要提前超过 15 分钟用 PBST 洗涤线虫。若上清液中仍有细菌残留，应增加洗涤次数。在 40% 异丙醇中的孵育步骤应使用旋转混合仪或摇床进行。始终监控离心管，确保样品充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ORO 进行脂质染色
	<ol>
		<li>向每个样品中加入 600 µL ORO 工作液，轻轻颠倒离心管三次，使线虫在 ORO 溶液中充分混匀。</li>
		<li>在室温下以 30 rpm 转速旋转孵育 2 小时。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，去除上清液，仅保留 100 µL。</li>
		<li>用 600 µL PBST 重悬样品，在 30 rpm 转速下旋转 30 分钟，以去除多余的 ORO 染料。</li>
		<li>以 560 × g 离心 1 分钟，去除上清液，仅保留 50 µL。</li>
		<li>为更清晰地区分动物生殖系和肠细胞的位置，可在每 1 mL ORO 工作液中加入 1 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。在载玻片封片成像前加入 DAPI，并继续 ORO 染色 2 小时。肠细胞核体积较大，而生殖腺可通过发育中的生殖细胞加以识别。 
		注意：ORO 染色后，线虫可能粘附在微离心管壁上，难以形成明显的沉淀。若发生此情况，可再次离心，或让线虫在重力作用下静置沉降至少 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于线虫成像的载玻片制备
	<ol>
		<li>将线虫在剩余上清液中重悬，并充分混匀。</li>
		<li>取 5 µL 线虫悬液滴加在显微镜载玻片上，小心盖上盖玻片，确保无气泡产生。</li>
		<li>用指甲油密封盖玻片边缘，然后进行成像。 
		注意：固定和染色后，线虫可能变得非常僵硬，难以用常规移液器操作。为避免此问题，可通过剪切移液器吸头末端制备宽口移液器。</li>
		<li>若染色后不立即成像，可将载玻片置于 4 °C 的微离心管架中保存，最长可保存 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO 染色线虫的成像
	<ol>
		<li>使用支持彩色成像的相机对 ORO 染色线虫进行成像。</li>
		<li>使用 5X 放大倍数，在一个视野中成像多个线虫。</li>
		<li>切换至 10X 放大倍数，以便更详细地观察单个线虫。</li>
		<li>将图像导出为 TIF 格式，以避免因压缩导致的数据丢失。 
		注意：若使用 ORO + DAPI 染色，应将彩色相机切换为可检测荧光信号的相机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO 染色线虫的图像分析
	<ol>
		<li>将显微图像上传至 ImageJ 软件。若图像文件未被识别，可在 Plugins 下拉菜单中使用 Bio-Formats 功能。</li>
		<li>在 Image 下拉菜单中，选择 Stacks 功能下的 Images-to-Stack，当需要比较多张显微图像时，可创建图像堆栈。</li>
		<li>在相同下拉菜单中调整亮度/对比度，以增强脂滴的可见性。</li>
		<li>根据动物全身或特定组织中的脂质积累情况对图像进行分类。</li>
		<li>为更准确评估脂质定位并识别 ImageJ 中的非特异性图像伪影，可在 Image 下拉菜单中选择 Color 功能，点击 Stack to RGB，以分别显示各 RGB 通道的信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Conn%27s+biological+stains%3A+a+handbook+of+dyes%2C+stains+and+fluorochromes+for+use+in+biology+and+medicine%22">Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine</a>. , BIOS Scientific Publishers. (2002).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li>
<li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li>
<li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li>
<li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lipidome%3A+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li>
<li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

肥胖症和代谢性疾病发病率的上升使得C. elegans成为研究调控细胞和组织中脂肪积累机制的合适模型。最近的研究表明，脂质水平的变化与多种细胞过程相关，包括胰岛素信号传导8、激素受体的激活2以及生殖输出5。与无标记显微镜和色谱法相比，尼罗红（Nile red）和油红O（oil red O）是相对廉价的染料，可用于在蠕虫中稳定且可重复地染色中性脂质10,12,13。前者可用于定量总脂质水平，后者则有助于评估脂质在表皮、肠道和生殖系等组织中的分布情况。当联合使用时，NR和ORO使研究人员能够确定基因型和环境变化如何影响脂质积累，以及这些变化在蠕虫体内的具体发生位置。
然而，这些染料无法像CARS显微镜那样以非侵入性方式直接评估脂质积累<sup...

脂质对生命至关重要。它们是细胞膜的组成成分，可作为第二信使和信号转导分子，并在能量储存中发挥关键作用。当脂质代谢失调时，会导致肥胖和2型糖尿病等疾病，这些是当前重要的公共卫生问题9。Caenorhabditis elegans（C. elegans）是研究脂质代谢的优良模式生物，因其具有相对较短的生命周期、透明的身体、已知的细胞谱系以及完全测序的基因组。C. elegans 主要为雌雄同体，使研究人员能够在短时间内培育大量同基因型个体，从而开展高通量的正向遗传筛选，以研究多种代谢相关基因和通路4。该方法已揭示，在人类、小鼠、大鼠和果蝇中，有273个 C. elegans 脂质代谢基因具有高度保守性。此外，C. elegans 中超过300个脂质基因具有与非代谢综合征相关疾病相关的人类直系同源基因11。传统上，对 C. elegans 中脂质储存的研究主要依赖染料标记检测法，该方法可提供关于脂质积累的可靠信息。然而，关于脂质在组织中的定位及其丰度差异的描述则较少见。但近期研究表明，脂质分布的重要性可能与脂质积累相当6。
近年来，研究开始整合高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜等方法，分别通过直接分析脂质提取物、特定脂质组分和脂质沉积物来弥补基于染色方法的不足10,11。此外，CARS显微镜研究表明，尼罗红仅在作为固定染料使用时才能可靠地指示脂肪积累，而作为活体染料使用时会导致对自发荧光细胞器的非靶向性染色10。然而，这些色谱和显微镜技术所需的专业技术知识和高昂成本，使其在许多研究问题中难以推广应用。本文介绍一种简便且可靠的方法，利用尼罗红和油红O对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的中性脂质沉积进行固定和染色，以区分整体生物体及特定组织中的脂质丰度。
尼罗红（Nile red），即9-二乙氨基-5H-苯并[α]吩噁嗪-5-酮，是一种苯并吩噁嗪类染料，易溶于多种有机溶剂，但在水中几乎不溶。它是一种优良的脂溶性染料，常用于染色中性脂质，如甘油三酯或胆固醇酯，因其具有强着色性、在脂质中溶解性良好、与周围组织相互作用微弱，且在溶剂中的溶解度低于在脂质中的溶解度。其激发波长和发射波长最大值分别为450-500 nm和520 nm1。在观察经尼罗红染色的C. elegans绿色荧光时，可根据动物的基因型或实验处理条件，在肠道及其他组织中观察到呈簇状或均匀分布的离散脂滴7。
油红O是一种溶酶体染料，为脂溶性染料，用于染色甘油三酯和脂蛋白。由于其化学结构中含有两个连接在三个芳香环上的偶氮基团，因此被称为偶氮染料。该染料难以电离，因而对脂质具有高度溶解性。其染色呈红色，最大光吸收波长为518 nm3。C. elegans经油红O染色后，脂滴呈红色，在动物透明的身体背景下清晰可见，便于对不同组织间的脂质分布进行定性评估6。

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>ERC5s 相机</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>彩色成像功能</td></tr><tr><td>MRm 相机</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>荧光成像功能</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>脂质染色剂</td></tr><tr><td>Oil red O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>脂质染色剂</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA 染色剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>固定液</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 无菌注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>醋酸纤维素滤膜</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>离心机</td></tr><tr><td>Shaker Rotisserie</td><td>Lab Quake</td><td>400110Q</td><td>摇床</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>旋转混合器</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>细菌培养</td></tr></tbody></table>

脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红o染色

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans 是研究脂质代谢和能量稳态的优秀模式生物。其许多脂质相关基因在人类中具有保守性，并与代谢综合征或其他疾病相关。对该生物体内脂质积累的检测可通过固定性染料或无标记方法进行。固定性染料如尼罗红和油红O是经济可靠的方法，可分别用于定量测定脂质水平和定性观察脂质在组织中的分布情况。此外，这些染料适用于对多种脂质代谢基因和通路进行高通量筛选。它们的疏水特性有助于脂质溶解，减少与周围组织的相互作用，并防止染料解离至溶剂中。尽管这些方法在检测总体脂质含量方面效果显著，但无法提供关于脂质沉积物化学组成及多样性的详细信息。针对此类需求，尽管成本较高，无标记方法如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和相干反斯托克斯拉曼散射显微镜（CARS显微镜）则更为适用。

SKN-1 是一种 bZip 类细胞保护性转录因子，与哺乳动物的 NRF2 具有同源性，并已被证明可介导脂肪酸氧化。根据饮食中葡萄糖浓度的不同，携带组成型激活 skn-1 等位基因的线虫在经尼罗红染色后表现出不同的脂质水平7。图 1A-C 展示了在导致脂质水平升高的条件下，skn-1 激活型动物的表型。使用 FITC/GFP 通道捕获的尼罗红荧光在肠道区域明显，而在头部、尾部及肠腔中较弱。随着脂质水平升高，尼罗红染色的颗粒变得难以分辨，可能需要缩短曝光时间。尽管该方法使用荧光强度作为脂质积累的定量替代指标，但其无法有效区分非脂质储存结构的非特异性染色，且易受肠道自发荧光的信号干扰。因此，必须并行使用其他标记或非标记方法，以明确量化动物体内的中性脂质10。
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

对固定后的Caenorhabditis elegans进行尼罗红染色是一种定量检测中性脂质沉积的方法，而油红O染色则有助于定性评估脂质在不同组织中的分布情况。

脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

秀丽隐杆线虫是研究脂质代谢和能量稳态的优良模式生物。其许多脂质相关基因在进化上是保守的……

这些染色方法的总体目标是定量细胞内脂质含量，并评估不同组织间的脂质分布。该方法有助于回答脂质代谢领域的关键科学问题，例如脂质如何在遗传和生化层面受到调控，以及哪些疾病状态会影响脂质稳态的调节。该技术的主要优势在于操作相对简单且成本较低。进行尼罗红脂质染色时，将线虫接种于涂有对数晚期OP50大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上，在20摄氏度下培养至早期L4阶段。用1毫升PBST溶液清洗线虫，并将线虫悬液转移至1.5毫升微量离心管中。以560 × g离心1分钟。然后去除上清液，并重复使用PBST洗涤，直至悬浮液中的大肠杆菌被完全清除。接下来，向线虫沉淀中加入100微升40%异丙醇（或进行ORO染色时使用60%异丙醇），室温孵育3分钟。在染色前加入异丙醇对于线虫的适当通透化至关重要。将线虫在560 × g 条件下离心1分钟，并在不扰动线虫沉淀的情况下移除上清液。在离心过程中应尽量减少光照暴露。现在，在避光条件下，向每个样品中加入600 µL预先配制好的NR工作液。将试管倒置三次，充分混匀线虫与溶液。随后将样品在室温下避光孵育两小时。孵育结束后，离心线虫并弃去上清液。然后加入 600 µL PBST，将样品在避光条件下孵育 30 分钟，以去除多余的中性红染料。再次按前述方法离心样品后，弃去上清液，仅保留约 50 µL，将虫体沉淀在剩余溶液中重新悬浮。为制备成像用载玻片，用移液器吸取 5 µL 虫体悬浮液滴加到显微镜载玻片上，小心地加盖盖玻片，避免产生气泡。使用 FITC GFP 通道对经 NR 染色的线虫进行成像，并尝试不同的曝光时间，在五倍放大倍数下对每视野中的多个个体进行成像。随后切换至十倍放大倍数，以更精确地对单个线虫进行定量分析。为实现图像定量，将显微图像上传至 ImageJ。在图像下拉菜单中，调节图像序列的亮度和对比度，然后点击“应用”以将更改应用到所有图像。使用多边形选择工具勾勒出每条成像的线虫，然后在分析下拉菜单中使用“测量”功能来定量NR发出的荧光强度。对每幅图像，测量五个背景区域，并计算平均背景荧光强度。向每个样品中加入600 µL油红O（Oil Red O）或ORO工作液，倒置离心管三次，充分混匀线虫与ORO。将样品在30 RPM和室温下旋转2小时。以560 ×g离心1分钟，吸除上清液，仅保留100微升。然后加入600微升PBST重悬样品，并在30 RPM下旋转30分钟，以去除多余的ORO染色。为了更清晰地区分动物生殖系在肠细胞中的位置，可在每毫升ORO工作液中加入一微升DAPI对细胞核进行染色。随后，为制备成像用载玻片，重新悬浮线虫及剩余的上清液，并充分混匀溶液。取五微升线虫悬浮液置于显微镜载玻片上，小心加盖盖玻片，确保不产生气泡。为了成像经 ORO 染色的线虫，使用具备彩色成像能力的相机在五倍放大倍数下对一个视野中的多条线虫进行成像。随后

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

尼罗红与油红 O 染色法测定秀丽线虫的脂质丰度及脂质分布评价

本视频介绍了一种使用尼罗红染料对完整且已固定的线虫进行脂质染色的实验方案。  为特异性观察脂滴核心中的中性脂质，应对染色后的 C. elegans...

尼罗红染色 秀丽隐杆线虫一种在固定动物中可视化脂滴的方法

本视频演示了一种通过尼罗红染料染色来检测和定量藻类细胞中中性脂质的实验方案。...

尼罗红染色：一种用于检测和定量藻类细胞内中性脂质的技术

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

本文描述了一种利用尼罗红染色法测定藻类细胞中性脂质含量的简单方案。该技术省时高效，可作为传统基于重量法的脂质定量方法的替代方案，并专为生物工艺性能监测这一特定应用而设计。...

一种利用荧光法快速简便测定藻类细胞中中性脂质的方案

本文介绍了利用脂滴特异性荧光染料BODIPY...

Oenocytes 的解剖与脂滴染色 果蝇 幼虫

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans...

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫

基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

影响眼部视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。目前已开发出多种疾病模型及一种名为LipidUNet的软件应用，用于研究疾病的发病机制以及潜在的治疗干预手段。...

LipidUNet——基于机器学习的iPSC来源视网膜色素上皮细胞中脂质沉积物表征与定量分析方法

脂噬是一种选择性自噬形式，涉及脂滴的降解。该过程的功能障碍与癌症发生相关，但其精确机制尚未完全阐明。本方案描述了定量成像方法，以更深入地理解自噬、脂质代谢与癌症进展之间的相互作用。...

通过脂噬作用探究脂滴分解代谢的调控机制

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。...

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

学习使用尼罗红与油红O染色法对秀丽线虫Caenorhabditis elegans进行脂质定量与分布分析。该方法简便经济，适用于研究脂质代谢调控机制及疾病相关脂质稳态变化。

脂质丰度的定量与脂质分布的评估秀丽隐杆线虫通过尼罗红和油红O染色

探索更多视频

脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

探索更多视频

脂质丰度的定量与脂质分布的评估秀丽隐杆线虫通过尼罗红和油红O染色