追踪 果蝇 幼虫对嗅觉神经元光遗传学刺激的行为反应

本方法的总体目标是分析果蝇幼虫在同时接受嗅觉神经元光遗传学刺激时的导航行为。该方法能够全面解析嗅觉神经回路的功能，并补充研究嗅觉神经回路功能如何转化为行为反应。该技术的主要优势在于其特异性和时间可控性，即利用光刺激而非传统的气味浓度梯度来激活特定的嗅觉神经元。

实验开始时，构建一个避光的行为观察 arena。使用厚度为三毫米的黑色有机玻璃板，制作一个尺寸为 89 厘米 × 61 厘米 × 66 厘米的箱子。将该箱子放置在行为学实验室内的一张实验台上。

接下来，在黑箱顶部中央安装一个配备红外长通830纳米滤光片和8毫米F1.4 C接口镜头的单色USB 3.0 CCD相机。将两条红外LED灯带放置在桌面上，用于在黑暗环境中照亮幼虫。然后，取一块22厘米×22厘米的方形铝板用于构建LED平台。

在金属板中央，使用金属切割器切出一个足够大的孔，以便容纳CCD相机。用红色LED灯条覆盖金属板。将LED灯条的导线串联焊接，并将灯条导线接入由树莓派2B微处理器控制的光耦继电器中。

接下来，将LED平台安装在CCD相机周围。然后在树莓派处理器上安装并配置基于Ubuntu MATE Raspbian Jessie的Linux操作系统，再将光电耦合继电器连接到LED灯带。连接电源以供电给LED灯带和光电耦合器。

确保行为实验装置中围绕CCD相机的各个位置具有均匀的辐照度。借助光谱仪确认实验装置表面的绝对辐照度，并将其确定为在整个装置表面约为1.3瓦特每平方米。将果蝇饲养在标准果蝇培养基中，饲养条件为25摄氏度、50%至60%相对湿度，以及12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

为了在一对嗅觉受体神经元（ORN）中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 品系的处女雌蝇与 ORX-GAL4 品系的雄蝇杂交。杂交后，让雌雄果蝇交配并产卵 48 小时，随后将成虫转移至新的培养管中。在含有卵的培养管食物表面，加入 400 微升混合液，该混合液包含溶于二甲基亚砜（DMSO）的 400 微摩尔全反式视黄醛（ATR），并用 89 毫摩尔溶于蒸馏水的蔗糖溶液配制。

将ATR加入含有卵的培养瓶后，将培养瓶置于避光条件下继续孵育72小时。孵育结束后，通过高密度15%蔗糖溶液漂浮法从果蝇食物表面分离三龄幼虫。使用P1000微量移液器将漂浮在蔗糖溶液表面的幼虫转移至1,000毫升玻璃烧杯中。

每次用800毫升新鲜蒸馏水更换玻璃烧杯中的液体，共清洗幼虫四次。最后一次清洗后，让幼虫静置10分钟，再进行行为检测。进行行为检测时，行为检测室应保持恒定的温度和湿度。

通过将150毫升融化的1.5%琼脂糖倒入22厘米×22厘米的方形培养皿中来制备幼虫爬行培养基。将琼脂糖在培养皿中静置1至2小时，使其凝固并冷却，然后用于行为实验。琼脂糖凝固后，将不超过20只准备好的三龄幼虫转移至培养皿中央，并用培养皿盖盖好。

将培养皿置于CCD相机下的行为观测 arena 中。打开850纳米红外LED光源，以便在视频中观察幼虫。启动CCD相机以记录幼虫运动。

最后，进行数据处理与分析。当表达 CsChrimson 的 ORN 7a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运行长度显著缩短。相反，当表达 CsChrimson 的 ORN 42a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运行长度显著增加。

我们发现，对于42a嗅觉受体神经元（ORN 42a），不同时间模式的光刺激会引发不同的行为反应。尽管我们已在初级嗅觉受体神经元中展示了该方法的应用，但该技术同样允许多种未来的应用，例如测量投射神经元和局部神经元等下游神经元对幼虫行为的影响。我们预期该技术将为全面解析幼虫嗅觉神经环路功能铺平道路。