跟踪果蝇幼虫行为对嗅神经元 Optogenetic 刺激的反应
March 21st, 2018
该协议分析了果蝇幼虫对其嗅觉神经元同时 optogenetic 刺激的导航行为。光的 630 nm 波长是用来激活单个嗅神经元表达一个红色转移通道紫红。幼虫运动是同时跟踪, 数字记录, 并分析使用自定义编写的软件。
该方法的总体目标是分析果蝇幼虫响应其嗅觉神经元同时光遗传学刺激的导航行为。这种方法能够全面剖析嗅觉回路功能，并补充关于嗅觉回路功能如何转化为行为反应的研究。该技术的主要优点是其特异性和时间控制，通过使用光而不是传统的气味梯度来激活单个嗅觉神经元。
要开始实验，请构建一个 Light Deprived behavior Arena。构建一个 89 x 61 x 66 厘米的盒子，由黑色有机玻璃亚克力板制成，厚度为 3 毫米。将框放在行为室的桌面上。
接下来，将装有红外长波通 830 纳米滤光片和 8 毫米 F1.4 C 卡口镜头的单色 USB 3.0 CCD 相机安装在黑匣子天花板的中央。在桌面上放置两个红外 LED 灯条，以照亮黑暗舞台中的幼虫。然后，获得一块 22 厘米 x 22 厘米见方的铝板来搭建 LED 平台。
在板的中心，使用金属切割机切一个足够大的孔，以适合 CCD 相机周围。用红色 LED 灯条覆盖金属板。将 LED 灯带线串联焊接，并将灯带线送入由 Raspberry Pi 2B 微处理器控制的光耦合器继电器中。
接下来，将 LED 平台安装在 CCD 相机周围。然后在 Raspberry Pi 处理器上安装和配置基于 Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux 的作系统，然后再将光耦合器继电器连接到 LED 灯条。连接电源为 LED 灯条和光耦合器供电。
确保在行为领域中 CCD 相机周围的各个点都有均匀的辐照度。在光谱仪的帮助下确保竞技场表面的绝对辐照度，并确定整个竞技场表面的绝对辐照度约为每平方米 1.3 瓦。将标准苍蝇食物中的果蝇保持在 25 摄氏度、50% 至 60% 相对湿度下，每 12 小时光照/黑暗循环。
为了在单对 ORN 中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 系的处女雌性与 ORX-GAL4 系的雄性杂交。在让杂交的雄性和雌性苍蝇交配和产卵 48 小时后，将成虫转移到新鲜的小瓶中。在装有鸡蛋的食品小瓶表面，加入 400 微升含有 400 微摩尔全反式视黄醛或 ATR 的混合物，溶于二甲基亚砜或 DMSO 中，溶于溶于蒸馏水中的 89 毫摩尔蔗糖中。
将 ATR 添加到装有鸡蛋的食品小瓶中后，将小瓶在黑暗中再孵育 72 小时。孵育后，使用高密度 15% 蔗糖溶液漂浮，从果蝇食物表面提取第三龄幼虫。使用 P1000 微量移液器，将漂浮在蔗糖溶液表面的幼虫分离到 1， 000 毫升玻璃烧杯中。
每次在玻璃烧杯中交换 800 毫升新鲜蒸馏水，清洗幼虫四次。最后一次洗涤后，让幼虫休息 10 分钟，然后再进行行为测定。对于行为测定，请在行为室内保持一致的温度和湿度。
通过将 150 毫升熔化的 1.5% 琼脂糖倒入 22 厘米 x 22 厘米见方的培养皿中来制备幼虫爬行培养基。让琼脂糖在培养皿中凝固并冷却一到两个小时，然后再将它们用于行为测定。琼脂糖凝固后，将不超过 20 只准备好的第三龄幼虫转移到培养皿的中心，并用盖子盖住培养皿。
将培养皿放在 CCD 摄像机下的行为领域中。打开 850 纳米红外 LED 光源，在视频中可视化幼虫。启动 CCD 相机以记录幼虫的运动。
最后，继续进行数据处理和分析。当表达 CsChrimson 的 ORN 7a 受到光刺激时，与对照动物相比，运行时间显著缩短。相反，当表达 CsChrimson 的 ORN 42a 受到光刺激时，与对照动物相比，运行时间显着增加。
我们发现对于 ORN 42a，光刺激的不同时间模式会引起不同的行为反应。虽然我们已经为一级嗅觉受体神经元证明了这种方法，但我们的方法也允许各种未来的应用，例如测量下游神经元（如投射神经元和局部神经元）对幼虫行为的影响。我们期望这项技术为全面解剖幼虫嗅觉回路功能铺平道路。
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概述
该协议分析了果蝇幼虫在同时进行光遗传学刺激其嗅觉神经元时的导航行为。它采用630纳米波长的光来激活表达红移通道视紫红质的特定嗅觉神经元，从而能够详细研究嗅觉回路功能和行为反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 行为神经科学
- 光遗传学
- 果蝇遗传学
背景
- 该方法允许探索嗅觉回路功能如何与行为反应相关。
- 它通过使用光而不是传统的气味梯度来提供激活的时间控制。
- 该方法便于检查果蝇嗅觉系统中特定的神经元。
研究目的
- 精确剖析嗅觉回路的功能。
- 观察幼虫对针对性神经元刺激的行为反应。
- 提供关于单个嗅觉神经元如何影响导航选择的见解。
使用的方法
- 该研究利用了一个定制设计的行为竞技场来分析幼虫运动。
- 在嗅觉受体神经元（ORNs）中表达CsChrimson的果蝇幼虫被用光进行刺激。
- 行为测定包括制备琼脂爬行培养基和录制幼虫运动的视频。
- 重要步骤包括构建竞技场、安装设备以及在特定条件下准备幼虫。
主要结果
- 特定嗅觉受体神经元的光刺激导致幼虫跑步长度的显著变化，表明存在不同的行为反应。
- 不同的时间模式的刺激对导航行为产生了不同的影响。
- 该方法有望促进未来对下游神经元对幼虫行为影响的探索。
结论
- 该研究展示了分析嗅觉回路及其行为影响的新方法。
- 它允许研究人员在活体环境中调查针对性神经元的具体作用。
- 这些发现增强了我们对感觉处理和行为中神经元机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise dissection of olfactory circuit function by replacing odor stimuli with optogenetic control, addressing a key challenge in target validation where behavioral readouts must be linked to specific neuronal activity. It supports mechanistic de-risking in early discovery by isolating the contribution of individual olfactory receptor neurons to navigational behavior, improving predictive confidence in target selection. The approach enhances translational continuity from molecular target to circuit-level phenotype, relevant for de-risking targets in neuroscience-focused discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific olfactory neuron activation to defined behavioral outputs.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of neuronal targets using light-based stimulation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through isolated manipulation of individual ORNs to clarify their role in larval navigational behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative behavioral readouts (e.g., run length changes) that enable standardized assessment of neuronal modulation effects.
- Operational Value: Establishes a scalable assay platform for screening genetic or pharmacological modulators of olfactory circuit function.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by eliminating odorant volatility and delivery variability through optogenetic stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling dissection of sensory-to-behavior translation in a genetically tractable organism.
- Operational Value: Provides a preclinical-compatible workflow for evaluating neuronal target effects on behavior prior to mammalian validation.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by clarifying how upstream neuronal activity translates to downstream behavioral phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through behavioral phenotyping and informing lead identification by clarifying neuronal targets that drive measurable outputs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of individual olfactory neuron function in driving larval navigational behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible behavioral metrics (run length) suitable for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides trackable behavioral outputs and statistical comparisons between stimulated and control conditions.
- Translational Research: Connects neuronal circuit activity to behavioral responses, supporting extrapolation to higher-order models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for systematic interrogation of neuronal targets across olfactory and other sensory circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking neuronal activation to behavioral outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through optogenetic control replacing variable odor stimuli.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clearer mechanistic links between targets and behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated behavioral impact in a discovery-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and behavioral assay design.
- Dependent on specialized instrumentation including behavior arena, IR lighting, CCD camera, and Raspberry Pi-based stimulation control.
- Necessitates cross-team standardization for larval preparation, agarose medium preparation, and video tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types (e.g., projection neurons, local neurons) or developmental stages.
- Limited by the need for genetic accessibility and retinal feeding in the model system, which may constrain scalability to non-Drosophila systems.
