通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

由于采用了具有优异官能团耐受性和高产率的硫醇-烯或硫醇-炔点击化学反应，这些方法简化了硫醚交联环肽的制备。该技术的主要优势在于，硫醚交联可提供一个无痕迹的修饰位点，从而在肽合成后显著拓展稳定肽的化学空间。开始操作时，将装有50毫克Rink Amide MBHA树脂的柱子通过三通旋塞连接至台式真空装置以及氮气或氩气管线。

向树脂床中加入一到二毫升二氯甲烷，并用惰性气体气泡流轻轻搅拌混合物10分钟，使树脂溶胀。完成后，用橡胶吸头滴管将树脂排干。然后，向树脂中加入一到二毫升N端Fmoc脱保护溶液。

用惰性气体鼓泡轻轻搅拌混合物10分钟，然后用橡胶吸头移液器抽干树脂。以相同方式用一至二毫升DMF洗涤柱子，接着用一至二毫升DCM洗涤。重复脱保护步骤一次。

接下来，将0.125毫摩尔的Fmoc保护氨基酸与50.5毫克HCTU加入聚丙烯容器中，并加入0.5毫升DMF。振荡混合物约1分钟，使固体溶解。然后加入43.5微升DIPEA，再振荡容器1分钟，得到0.25摩尔的活化氨基酸溶液。

将该溶液加入洗涤后的树脂中，并向混合物中通入惰性气体鼓泡反应 1 至 2 小时。随后，脱除保护基并洗涤已结合的氨基酸残基。以此方式继续将氨基酸逐个偶联至肽链，形成线性肽。

采用固相肽合成法制备负载线性肽的树脂，该线性肽包含一个三苯甲基保护的半胱氨酸残基，该残基与一个单-S-五残基之间相隔三个单元。向50毫克含肽树脂中加入一到二毫升三苯甲基脱保护溶液。向混合物中通入氮气鼓泡10分钟。

排空去保护溶液，用一至二毫升的二氯甲烷分三次洗涤树脂。重复去保护步骤六次，或直至溶液不再呈现黄色，以完全去除半胱氨酸的保护基。半胱氨酸的Trt保护基的完全去除对于后续的光反应步骤至关重要。

依次用一至两毫升的DMF和DCM洗涤树脂。然后，将树脂浸泡在一至两毫升甲醇中两分钟，使树脂收缩。除去甲醇，并用氮气干燥树脂五分钟。

将干燥树脂通过称量纸转移至10毫升圆底烧瓶中。用2毫升经氮气脱气的DMF悬浮树脂。然后加入5.6毫克MMP和38毫克MAP作为光引发剂。

在烧瓶中放入一个搅拌子，用橡胶隔垫密封烧瓶。用氮气对烧瓶内气氛进行三次置换，总置换时间约为五分钟。将反应烧瓶固定在配备有UVA灯、惰性氮气入口和搅拌装置的光反应器中。

开始搅拌混合物，并关闭光反应器。用氩气对光反应器吹扫10分钟。然后将氩气流速设定为每分钟1升，并在室温下用UVA光照照射混合物1小时。

使用HPLC监测反应进程。反应完成后，洗涤、裂解并纯化环状肽。准备50毫克负载线性肽的树脂，该线性肽包含一个γ-取代的单-S-五元残基。

依次用DMF和DCM洗涤树脂。用甲醇收缩树脂，并用氮气干燥。然后，在一个10毫升的圆底烧瓶中，将树脂悬浮于2毫升经氮气鼓泡除氧的DMF中。

向混合物中加入 5.6 毫克 MMP、3.8 毫克 MAP 和 25.7 毫克 Fmoc 保护的半胱氨酸。向烧瓶中加入搅拌子，用橡胶隔膜密封，并用氮气吹扫烧瓶内的空气。然后，在室温下搅拌反应混合物，并在充满惰性氮气的光反应器中用 UVA 光照射一至两小时。

使用液相色谱-质谱法（LC-MS）监测反应进程。光反应完成后，洗涤已结合的肽段，并进行大环内酰胺化反应。随后，继续向环肽上偶联氨基酸，以形成目标结构。

完成反应后，裂解并纯化肽。准备50毫克载有线性肽的树脂，该线性肽包含一个末端为炔基的残基，该残基与另一个末端为巯基的残基相隔三个单元。将肽从树脂上裂解下来，并用1毫升冷的乙醚沉淀。

将肽混合物在12,000 × g离心两分钟。小心倾去上清液，加入1毫升冷的乙醚。重复洗涤两次，然后在真空下干燥肽残留物。

在圆底烧瓶中，将残余物溶于50毫升经氮气除氧的DMF中。向肽溶液中加入3.2毫克DMPA，并向反应混合物中通入氮气10分钟。溶液相中高效的硫-炔光化学反应必须在惰性气氛下进行。

否则，我们观察到在紫外光照射过程中发生硫的氧化。然后，将混合物置于充满惰性氮气的光反应器中，在室温下用UVA光照射30分钟至1小时，期间不进行搅拌。反应完成后，分离并纯化环状肽。

该肽在树脂上环化后生成一个硫醚键连接的环状五肽，其分子量与线性肽相同。环化产物的HPLC保留时间比线性肽短两分钟。其他几种短肽在树脂上的环化反应也观察到良好的转化率。

通过光诱导的硫醇-炔烃加硫醇化反应，筛选了线性肽发生肽链稳定化修饰的能力。两个c的产率较低，归因于在形成20元大环的过程中，硫酰自由基在N端发生捕获的构象偏好。肽one a和one b均生成了两种异构体，含有八元乙烯基硫醚交联结构。

产物肽two a-A和two a-B具有不同的保留时间，并在不同辐照时间下以不同比例生成。质子核磁共振（NMR）光谱表明，two a-A为乙烯基硫醚的E-异构体，而two a-B为Z-异构体。在生成肽two d、two e和two f时，Z-异构体为主要产物，这归因于七元环乙烯基硫醚交联形成过程中的构象偏好。

圆二色光谱显示，所有形式的肽二a和二b均呈现无规卷曲结构，而肽二d则呈现螺旋构象。我们开发了一系列化学方案，利用光诱导的硫醇-烯和硫醇-炔点击化学反应来构建硫醚和乙烯基硫醚连接的肽。我们相信这将对科研领域有所帮助。