Name: 利用光致硫醇-烯/yne Hydrothiolation 构造硫醚类/乙烯基硫化物栓系螺旋肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学习利用光诱导硫醇-烯/炔点击化学反应构建硫醚/乙烯基硫化物栓系螺旋肽的方法。该技术通过无痕修饰位点显著扩展稳定肽的化学空间，为肽化学研究提供高效合成策略。

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作者感谢国家自然科学基金（项目编号：21372023、21778009 和 81701818）；中华人民共和国科学技术部（项目编号：2015DFA31590）；深圳市科技创新委员会（项目编号：JCYJ20170412150719814、JCYJ20170412150609690、JCYJ20150403101146313、JCYJ20160301111338144、JCYJ20160331115853521、JSGG20160301095829250 和 GJHS20170310093122365）；以及中国博士后科学基金（项目编号：2017M610704）提供的经费支持。

1. 仪器设备准备
<ol>
	<li>对于手动多肽合成装置，将真空多联管（材料表）置于通风良好的通风橱中。随后，将三通旋塞安装到真空多联管上，并将其连接至氮气或氩气管线。使用橡胶隔垫封闭所有未使用的入口。</li>
	<li>通过三通旋塞将装有树脂的柱子（0.8 × 4 cm，10 mL 储液端，参见 材料表）连接至多联管（图1）。使用连接至真空系统的泵进行抽滤，或通过挤压橡胶洗耳球去除柱中的溶剂。</li>
	<li>使用配备十个350 nm 灯管的光反应器（图2）进行紫外照射（材料表）。通过光反应器的进气口将灯管连接至氩气瓶，以确保在光反应开始前及进行过程中，光反应器内部充满氩气。</li>
	<li>在开启光反应器的紫外灯之前，务必确认光反应器门已关闭，以防紫外光辐射外泄。</li>
</ol>
2. 树脂准备
注意：通常，多肽底物的构建采用基于Fmoc的固相多肽合成方法。该方法使用Rink酰胺树脂，使多肽裂解后保留C端酰胺。本文中均采用此方案。
警告：N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、4-甲基吗啉（NMM）和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）有毒，吸入、食入或皮肤接触均有害。乙醚高度易燃。三氟乙酸（TFA）具有腐蚀性。1,2-乙二硫醇（EDT）具有强烈恶臭。因此，所有有机溶剂和化学品均须在化学通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备（腈类手套、实验服和护目镜）。
<ol>
	<li>使用以下公式计算所需树脂的量： 
	规格（mmol）/（树脂载样量（mmol/g）× 1,000（mg/g））= 树脂质量（mg） 
	例如，对于 25 µmol（即 0.025 mmol）反应规模，使用载样量为 0.5 mmol/g 的 Rink 酰胺 MBHA 树脂时，所需树脂质量为：0.025 mmol /（0.5 mmol/g × 1,000 mg/g）= 50 mg。随后，在反应柱中称取 50 mg 树脂，并使用三通活塞将其连接至真空 manifold 装置。</li>
	<li>向反应柱（尺寸 0.8 × 4 cm，配备 10 mL 储液器）中的树脂加入 1–2 mL DCM。为使树脂充分溶胀，用氮气或氩气气流轻轻吹洗 10 分钟。随后通过真空抽滤除去溶剂。</li>
</ol>
3. N端Fmoc脱保护与洗涤
<ol>
	<li>配制N端Fmoc脱保护溶液：在玻璃瓶中配制适量体积（200 mL）的含50%（v/v）吗啉的DMF溶液。</li>
	<li>向树脂中加入1 - 2 mL脱保护溶液，轻轻振荡10分钟，然后用真空抽滤除去溶液。依次使用DMF（1 - 2 mL）和DCM（1 - 2 mL）彻底洗涤树脂和反应容器，每种溶剂洗涤3次。随后，重复脱保护及洗涤步骤1次。</li>
</ol>
4. Fmoc 保护的氨基酸偶联
<ol>
	<li>以丙氨酸残基的偶联为例，在25 µmol规模的手动合成中，称取Fmoc-Ala-OH（5当量，41.4 mg）和2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU；4.9当量，50.5 mg）于聚丙烯容器中，加入DMF（0.5 mL）溶解。</li>
	<li>加入 DIPEA（10 当量，43.5 µl），以制备 0.25 M 的活化氨基酸溶液（表 1）。预活化约 1 分钟后，将该溶液加入树脂中，然后用 N₂ 鼓泡2 约 1 - 2 小时。</li>
	<li>从这一步开始，按照以下步骤序列将每个氨基酸依次加入肽链：首先脱去N端的Fmoc保护基团，然后进行洗涤，接着使用HCTU活化进行氨基酸偶联。 
	注意：更长的偶联时间（例如，建议在偶联位点后接有空间位阻较大的氨基酸残基时采用较长的偶联时间（2小时）[例如Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。含烯烃或炔烃的非天然氨基酸使用3当量而非5当量，并反应3小时。</li>
	<li>使用 Kaiser 或氯萘胺试验（chloranil test）监测肽的合成进程，具体方法参照 Arora 的描述 等36 这些测试可对游离伯胺和仲胺的存在与否进行定性评估。或者，可将约2 - 3 mg的肽从树脂上裂解下来，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。</li>
</ol>
5. 巯基-烯烃加成反应与巯基-炔烃环化反应
<ol>
	<li>通过树脂上环化反应构建硫醚连接子（图3).
	<ol>
		<li>配制约 50 mL 去保护溶液（TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0）。对 Cys 和 mS 进行处理5含树脂 [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys(Trt)-R'-树脂，50 mg] 置于10 mL柱中，加入1–2 mL Trt脱保护溶液。用N₂轻轻搅拌溶液10分钟2最后，用二氯甲烷（1–2 mL）洗涤，共洗涤 3 次。 
		注意：MS5 表示带有亚烷基的构建单元（见所示结构图） 图6用于肽偶联和硫代-烯烃环化反应38.</li>
		<li>重复上述步骤，总共约进行6次，以去除半胱氨酸的三苯甲基保护基，直至溶液颜色不再呈黄色。</li>
		<li>通入 N₂2，洗涤R-mS5-A-A-A-Cys(-SH)-R'-树脂 [含游离巯基(-SH)的半胱氨酸] 依次用DMF（1 - 2 mL）和DCM（1 - 2 mL）洗涤。随后用甲醇（1 - 2 mL）收缩树脂2分钟，通过过滤除去溶剂。接着，在氮气流下依次干燥树脂2 在色谱柱中用气体冲洗约5分钟。</li>
		<li>提前在圆底烧瓶中通过长针向溶剂内通入氮气约1小时，以制备脱气的DMF。</li>
		<li>将树脂通过称量纸转移至10 mL圆底烧瓶中。用2 mL脱气的DMF悬浮树脂，随后加入光引发剂2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮（MMP；1当量，5.6 mg）和4-甲氧基苯乙酮（MAP；1当量，3.8 mg）。</li>
		<li>将一个搅拌子（0.3 cm）放入烧瓶中，并用合适的橡胶塞密封烧瓶，然后使用油泵用氮气置换烧瓶中的空气。 
		注意：在固相上进行有效的硫醇-烯光反应时，惰性气氛并非严格必需。然而，在溶液相中进行硫醇-炔光反应时，惰性气氛则非常必要。 图5否则，硫将在紫外照射过程中发生氧化。</li>
		<li>将反应烧瓶放入光反应器中，在室温下紫外光照射条件下搅拌树脂1小时（图2). 
		警告：开启光反应器紫外灯前，务必关闭光反应器门，以防紫外光产生有害辐射。 
		注意：对于新的反应序列，建议在光反应过程中频繁取样检测反应混合物，因为线性肽前体与产物的分子量相同。通常情况下，线性肽与环状肽在亲水性上存在显著差异，可通过高效液相色谱（HPLC）轻松区分。 alternatively，也可使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）试剂检测游离巯基的存在。37.</li>
		<li>将树脂从烧瓶转移至层析柱中，并通过真空过滤去除溶剂。按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。</li>
		<li>准备约 10 mL 裂解缓冲液（TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) 在通风橱中。</li>
		<li>将树脂转移至一个2 mL聚丙烯容器中，加入1 mL裂解液（TFA/TIPS/EDT/H2向容器中加入 O 94/1/2.5/2.5)，用螺旋盖将容器密封。然后在通风橱中，以 60 rpm 的转速在轨道摇床中轻轻振荡 1.5 - 2 小时。 
		警告：三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性，操作时需穿戴防护服，并在通风良好的通风橱中进行。乙二硫醇（EDT）具有强烈恶臭，必须在通风良好的通风橱中操作。</li>
		<li>通过氮气下蒸发去除TFA混合液2 在通风橱中的气流条件下，加入冷的乙醚（1 mL）沉淀残余物，持续30秒，随后在12,000 × g离心2分钟以分离沉淀。离心后，小心倾去乙醚相。重复沉淀和离心步骤两次。将残余物完全蒸发至干燥。</li>
		<li>最后，将残余物溶于1 mL H2O/乙腈（2:1）混合溶剂，采用C18分析柱（4.6 × 250 mm，流速1.0 mL/min）进行HPLC纯化。使用H2O（含0.1%三氟乙酸）和纯乙腈作为流动相，在25分钟内以每分钟2%的线性梯度从20%乙腈升至70%乙腈。使用280 nm和220 nm紫外波长监测HPLC图谱（表2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分子间硫醇-烯反应构建硫醚连接子，然后通过大环内酰胺化反应使肽环化图4).
	<ol>
		<li>合成带有线性肽 H 的亚烷基残基2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-树脂（50 mg），采用标准的Fmoc固相多肽合成法（SPPS），具体步骤如2–4所述。随后，按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。</li>
		<li>将树脂悬浮于一个10 mL圆底烧瓶中，烧瓶内含2 mL按步骤5.1.4所述脱气的DMF。</li>
		<li>加入光引发剂MMP和MAP（MMP：1当量，5.6 mg；MAP：1当量，3.8 mg）、Fmoc-Cys-OH（3当量，25.7 mg）以及搅拌子（0.3 cm）至烧瓶中。用合适的橡胶塞密封烧瓶，随后使用油泵将烧瓶中的空气置换为氮气。</li>
		<li>将反应瓶放入光反应器中，在室温下避光搅拌1 - 2小时（图2).</li>
		<li>通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析监测反应：使用裂解缓冲液裂解 2 - 3 mg 树脂。随后用冷的乙醚（300 µL）沉淀残余物，通过离心分离残余物，并按照步骤 5.1.11 所述将残余物蒸发至干燥。之后，将残余物溶解于 100 µL 的 H2O/乙腈（2:1）。使用0.22 µm微孔滤膜过滤肽溶液，并采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行分析，化合物通过电喷雾离子化（ESI）并在正离子模式下检测。</li>
		<li>如有必要，重复步骤 5.2.2 - 5.2.4，以确保反应完全进行。</li>
		<li>光反应完成后，将树脂从烧瓶转移至层析柱中，并通过减压过滤除去溶剂。按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。</li>
		<li>将苯并三唑-1-基-氧-三(吡咯烷基)磷六氟磷酸盐（PyBob；2.4 当量，31.2 mg）、1-羟基苯并三唑（HoBt；2.4 当量，8.1 mg）和 N-甲基吗啉（NMM；4 当量，11 µL）的 DMF 溶液加入柱中树脂，用于大环内酰胺化反应。用 N₂ 鼓泡处理该溶液2 2小时。
		<ol>
			<li>此外，使用液相色谱-质谱法（LC-MS）监测此偶联反应，方法见步骤5.2.3。如有必要，重复此步骤以确保反应完全进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用标准的Fmoc固相肽合成法（SPPS）按照步骤3和4所述延长肽链。</li>
		<li>在所有氨基酸残基组装完成后，按照步骤5.1.10和5.1.11所述将肽从树脂上切割下来，并按照步骤5.1.12所述进行纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在溶液相中构建乙烯基硫醚连接子图5).
	<ol>
		<li>使用标准的Fmoc固相肽合成法（SPPS）按照步骤2-4所述合成带有炔基残基的线性肽。根据先前研究中描述的成熟方案合成含炔基的氨基酸。20.</li>
		<li>将多肽从树脂上裂解并使用冷的乙醚沉淀，具体步骤如5.1.9 - 5.1.11所述。裂解并沉淀树脂后，于12,000 × g离心2分钟以收集多肽。</li>
		<li>在真空条件下干燥所得残余物。将残余物溶于已脱气的DMF（50 mL）中，置于100 mL圆底烧瓶内，使最终浓度达到0.5 mM（根据树脂载量计算：0.025 mmol ×（1000 mL/L / 0.5 mmol/L）= 50 mL）。
		<ol>
			<li>加入光引发剂 DMPA（0.5 当量，3.2 mg），然后用 N₂ 对反应溶液脱气 10 分钟2 通过一根伸入溶液的长针通入。随后，在室温下将样品置于紫外光中照射0.5–1小时，期间不进行搅拌。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在高真空下除去DMF，并加入乙醚沉淀粗产物，以溶解其有机副产物。随后，在12,000 × g离心2分钟以分离沉淀物。离心后，小心倾去乙醚相。将残留物蒸发至干燥。最后，将残留物溶于1 mL H2O/乙腈（2:1）混合溶剂，并按照步骤5.1.7所述方法通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在图3所述的树脂上分子内硫-烯环化反应中，发现去除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基是后续光反应的关键步骤。此外，反应前后肽的分子量相同，如图6B所示。因此，必须使用高效液相色谱（HPLC）鉴定或DTNB测定法来监测反应进程。对于图4所述的分子间硫-烯反应，需通过质谱（MS）进行监测。尽管构建硫醚交联结构还需额外的内酰胺偶联步骤，但我们建议将该方案用于较长肽段，以实现更高的整体反应效率。
硫代炔光化学反应生成的乙烯基硫醚键在用于树脂裂解的强酸性三氟乙酸（TFA）溶液中不稳定。因此，采用在溶液相中进行硫代炔光化学反应。该反应被稀释至较低浓度（0.5 mM），以避免潜在的分子间副反应。同样重要的是，需对溶剂进行脱气处理，以防止光化学反应过程中产物被氧化。反应完成后，应小心进行有机溶剂DMF的真空蒸发，以避免肽的氧化或降解，以及设备的腐蚀损耗。图5所示的硫代...

开发用于调控蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的配体，为现代药物发现提供了一种极具吸引力的策略。因此，大量研究致力于探索能够有效调控PPIs的新型化学模态1,2,3。PPIs通常涉及浅表、大面积和/或不连续的相互作用界面，因此小分子通常被认为不适合用于调控PPIs4,5。当存在合适的暴露相互作用表面积时，能够模拟蛋白质界面结构特征的短肽是解决这一问题的理想候选分子6,7。然而，短肽在水溶液中通常缺乏明确的结构，这是因为水分子会与肽骨架的分子内氢键网络发生竞争，导致在水中形成明确构象在熵上不利8。此外，肽类固有的低稳定性和细胞通透性在很大程度上限制了其在生物应用中的使用9,10。根据蛋白质数据库（PDB）的分析，&#62;50%的PPIs涉及短α-螺旋相互作用11。因此，已发展出多种化学方法用于螺旋结构的稳定化，包括二硫键/硫醚键的形成12,13,14、环闭合复分解反应15、内酰胺环的形成16、&#34;点击化学&#34;17、引入全氟芳烃18,19以及乙烯基硫醚的形成20。
稳定化的螺旋肽被广泛用于多种细胞内靶点，包括 p53、雌激素受体、Ras、BCL-2 家族蛋白等21,22,23,24。ALRN-6924 是一种全碳氢链固定的肽类双重抑制剂，可同时抑制 MDM2 和 MDMX，目前正处于临床研究阶段25。在过去几年中，我们课题组致力于开发基于硫醇-烯和硫醇-炔反应的新型肽链稳定化方法26,27,28。总体而言，我们已证明，当使用天然存在的半胱氨酸时，这些光引发反应在温和条件下具有高效性。此外，我们还表明，这些反应对官能团具有优异的耐受性，具有生物正交性，并已被证实适用于肽和蛋白质的修饰29。所生成的硫醚/乙烯基硫醚连接肽显著拓展了约束肽的化学空间，提供了可进行连接链上修饰的活性位点，并已被证实可用于多种生物应用30,31,32。迄今为止，关于硫醇-烯/硫醇-炔肽环化的报道仍十分有限。Anseth 等. 于 2009 年发表的一项研究中，展示了在树脂上通过活化烯烃与半胱氨酸发生分子内硫醇-烯反应实现肽环化的方法33。2015 年，Chou 等. 描述了一种双组分自由基引发的硫醇-烯反应用于肽链固定34，以及随后的连续硫醇-炔/烯偶联反应35。最近，我们报道了一系列基于硫醚/乙烯基硫醚连接肽的研究工作20,26,27。本实验方案详细描述了上述硫醚/乙烯基硫醚连接肽的合成方法，希望对更广泛的研究领域有所帮助。

<table><tbody><tr><td>Rink Amide MBHA 树脂（0.53 mmol/g）</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>标准 Fmoc 保护氨基酸</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-2-吡咯烷酮</td><td>深圳恩迪生物科技有限公司</td><td>3230</td><td>对皮肤有害</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>对皮肤有害</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>对皮肤有害</td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>J&amp;K</td><td>101398</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>J&amp;K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-乙二硫醇</td><td>J&amp;K</td><td>248897</td><td>恶臭</td></tr><tr><td>2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵&amp;nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>851012</td><td></td></tr><tr><td>吗啉</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>易燃</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>有毒</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>有毒</td></tr><tr><td>2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮</td><td>Energy</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-甲氧基苯乙酮</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)</td><td>J&amp;K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐</td><td>Energy</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-羟基苯并三唑</td><td>Energy</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基吗啉</td><td>Energy</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>电喷雾电离质谱</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩系统</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>真空 manifold</td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯层析柱&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

在此，我们描述了一种利用树脂上分子内/分子间硫醇-烯烃加硫醇化反应制备硫醚连接肽的详细方案。此外，本方案还介绍了通过溶液中分子内硫醇-炔烃加硫醇化反应制备乙烯基硫醚连接肽的方法，该反应发生在侧链含烯烃/炔烃的氨基酸与位于i, i+4位置的半胱氨酸残基之间。线性肽采用标准的Fmoc基固相肽合成法（SPPS）进行合成。硫醇-烯烃加硫醇化反应根据肽链长度的不同，可选择分子内或分子间硫醇-烯反应方式进行。在本研究中，对于较短的肽链，在完成线性肽的全合成后，首先在树脂上脱除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基，随后进行分子内硫醇-烯反应。然后加入光引发剂4-甲氧基苯乙酮（MAP）和2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮（MMP），对树脂进行紫外光照射。分子间硫醇-烯反应则通过将Fmoc-Cys-OH溶于 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶剂。随后，利用树脂上带有烯烃的残基与肽进行反应。接着，在树脂上使用苯并三氮唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBop）、1-羟基苯并三氮唑（HoBt）和4-甲基吗啉（NMM）作为活化试剂进行大环内酰胺化反应。完成大环内酰胺化后，继续采用标准固相肽合成法（SPPS）进行肽链的延伸。在硫-炔氢硫化反应的情况下，将线性肽从树脂上裂解下来，干燥后溶于脱气的DMF中。然后在光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）存在下用紫外光照射。反应完成后，蒸发除去DMF，粗产物经沉淀并采用高效液相色谱法（HPLC）纯化。这些方法有望简化含硫醚键环肽的制备，得益于硫-烯/炔点击化学反应具有优异的官能团耐受性和较高的产率。将硫醚键引入肽分子中，可利用半胱氨酸残基的亲核性，且相较于二硫键，硫醚键具有氧化还原惰性。

采用树脂上分子内硫醇-烯烃光反应生成的肽 Ac-YmS5AAAC-NH2 及其环化产物 Ac-Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC]-NH2 的 HPLC 和 MS 谱图如图6B所示。环状肽的分子量与其线性前体相同，但在相同的分离条件下，其 HPLC 保留时间比前体肽约提前 2 分钟。不同序列的短肽均表现出良好的转化率，如图6C所示。
硫代炔光反应条件的筛选过程如图7B所示，异构体转化率及比例通过反相高效液相色谱（HPLC）积分测定。在紫外光照射后仅观察到微量的肽2c。这可能是由于在形成20元大环的缩合步骤中，硫醇自由基在N端被捕获的构象偏好所致。肽1a和1b均生成了两种具有8元...

我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。

本文详细描述了一种在树脂上通过分子内/分子间硫醇-烯反应制备硫醚连接肽的实验方案。

由于采用了具有优异官能团耐受性和高产率的硫醇-烯或硫醇-炔点击化学反应，这些方法简化了硫醚交联环肽的制备。该技术的主要优势在于，硫醚交联可提供一个无痕迹的修饰位点，从而在肽合成后显著拓展稳定肽的化学空间。开始操作时，将装有50毫克Rink Amide MBHA树脂的柱子通过三通旋塞连接至台式真空装置以及氮气或氩气管线。向树脂床中加入一到二毫升二氯甲烷，并用惰性气体气泡流轻轻搅拌混合物10分钟，使树脂溶胀。完成后，用橡胶吸头滴管将树脂排干。然后，向树脂中加入一到二毫升N端Fmoc脱保护溶液。用惰性气体鼓泡轻轻搅拌混合物10分钟，然后用橡胶吸头移液器抽干树脂。以相同方式用一至二毫升DMF洗涤柱子，接着用一至二毫升DCM洗涤。重复脱保护步骤一次。接下来，将0.125毫摩尔的Fmoc保护氨基酸与50.5毫克HCTU加入聚丙烯容器中，并加入0.5毫升DMF。振荡混合物约1分钟，使固体溶解。然后加入43.5微升DIPEA，再振荡容器1分钟，得到0.25摩尔的活化氨基酸溶液。将该溶液加入洗涤后的树脂中，并向混合物中通入惰性气体鼓泡反应 1 至 2 小时。随后，脱除保护基并洗涤已结合的氨基酸残基。以此方式继续将氨基酸逐个偶联至肽链，形成线性肽。采用固相肽合成法制备负载线性肽的树脂，该线性肽包含一个三苯甲基保护的半胱氨酸残基，该残基与一个单-S-五残基之间相隔三个单元。向50毫克含肽树脂中加入一到二毫升三苯甲基脱保护溶液。向混合物中通入氮气鼓泡10分钟。排空去保护溶液，用一至二毫升的二氯甲烷分三次洗涤树脂。重复去保护步骤六次，或直至溶液不再呈现黄色，以完全去除半胱氨酸的保护基。半胱氨酸的Trt保护基的完全去除对于后续的光反应步骤至关重要。依次用一至两毫升的DMF和DCM洗涤树脂。然后，将树脂浸泡在一至两毫升甲醇中两分钟，使树脂收缩。除去甲醇，并用氮气干燥树脂五分钟。将干燥树脂通过称量纸转移至10毫升圆底烧瓶中。用2毫升经氮气脱气的DMF悬浮树脂。然后加入5.6毫克MMP和38毫克MAP作为光引发剂。在烧瓶中放入一个搅拌子，用橡胶隔垫密封烧瓶。用氮气对烧瓶内气氛进行三次置换，总置换时间约为五分钟。将反应烧瓶固定在配备有UVA灯、惰性氮气入口和搅拌装置的光反应器中。开始搅拌混合物，并关闭光反应器。用氩气对光反应器吹扫10分钟。然后将氩气流速设定为每分钟1升，并在室温下用UVA光照照射混合物1小时。使用HPLC监测反应进程。反应完成后，洗涤、裂解并纯化环状肽。准备50毫克负载线性肽的树脂，该线性肽包含一个γ-取代的单-S-五元残基。依次用DMF和DCM洗涤树脂。用甲醇收缩树脂，并用氮气干燥。然后，在一个10毫升的圆底烧瓶中，将树脂悬浮于2毫升经氮气鼓泡除氧的DMF中。向混合物中加入 5.6 毫克 MMP、3.8 毫克 MAP 和 25.7 毫克 Fmoc 保护的半胱氨酸。向烧瓶中加入搅拌子，用橡胶隔膜密封，并用氮气吹扫烧瓶内的空气。然后，在室温下搅拌反应混合物，并在充满惰性氮气的光反应器中用 UVA 光照射一至两小时。使用液相色谱-质谱法（LC-MS）监测反应进程。光反应完成后，洗涤已结合的肽段，并进行大环内酰胺化反应。随后，继续向环肽上偶联氨基酸，以形成目标结构。完成反应后，裂解并纯化肽。准备50毫克载有线性肽的树脂，该线性肽包含一个末端为炔基的残基，该残基与另一个末端为巯基的残基相隔三个单元。将肽从树脂上裂解下来，并用1毫升冷的乙醚沉淀。将肽混合物在12,000 × g离心两分钟。小心倾去上清液，加入1毫升冷的乙醚。重复洗涤两次，然后在真空下干燥肽残留物。在圆底烧瓶中，将残余物溶于50毫升经氮气除氧的DMF中。向肽溶液中加入3.2毫克DMPA，并向反应混合物中通入氮气10分钟。溶液相中高效的硫-炔光化学反应必须在惰性气氛下进行。否则，我们观察到在紫外光照射过程中发生硫的氧化。然后，将混合物置于充满惰性氮气的光反应器中，在室温下用UVA光照射30分钟至1小时，期间不进行搅拌。反应完成后，分离并纯化环状肽。该肽在树脂上环化后生成一个硫醚键连接的环状五肽，其分子量与线性肽相同。环化产物的HPLC保留时间比线性肽短两分钟。其他几种短肽在树脂上的环化反应也观察到良好的转化率。通过光诱导的硫醇-炔烃加硫醇化反应，筛选了线性肽发生肽链稳定化修饰的能力。两个c的产率较低，归因于在形成20元大环的过程中，硫酰自由基在N端发生捕获的构象偏好。肽one a和one b均生成了两种异构体，含有八元乙烯基硫醚交联结构。产物肽two a-A和two a-B具有不同的保留时间，并在不同辐照时间下以不同比例生成。质子核磁共振（NMR）光谱表明，two a-A为乙烯基硫醚的E-异构体，而two a-B为Z-异构体。在生成肽two d、two e和two f时，Z-异构体为主要产物，这归因于七元环乙烯基硫醚交联形成过程中的构象偏好。圆二色光谱显示，所有形式的肽二a和二b均呈现无规卷曲结构，而肽二d则呈现螺旋构象。我们开发了一系列化学方案，利用光诱导的硫醇-烯和硫醇-炔点击化学反应来构建硫醚和乙烯基硫醚连接的肽。我们相信这将对科研领域有所帮助。

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利用光致硫醇-烯/yne Hydrothiolation 构造硫醚类/乙烯基硫化物栓系螺旋肽

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。...

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

本文介绍了一种利用市售起始单体合成和编程主链型液晶弹性体的新方法。通过调节交联剂的用量，可定制一系列不同的热机械性能，而驱动性能则取决于编程过程中施加的应变程度。...

使用两步硫醇-丙烯酸酯反应合成可编程主链型液晶弹性体

细胞黏附性在生物材料研究和组织工程的多种方法中至关重要。本文介绍了一种利用湿化学法对重要聚合物聚四氟乙烯（PTFE）进行肽类表面修饰的逐步技术。...

湿化学法及聚四氟乙烯表面肽固定化以增强细胞黏附

为了以高特异性将抗癌药物递送至肿瘤部位并减少副作用，需要基于纳米颗粒的新方法。本文描述了可通过过氧化氢介导的氧化反应简便制备的二硫键交联胶束，该胶束在还原性的肿瘤微环境中能有效解离，从而释放所载药物。...

一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

详细介绍了N-(2-烷氧基乙烯基)磺酰胺的合成及其后续转化为酞喃和苯乙胺衍生物的代表性实验步骤。...

由 N-对甲苯磺酰基-1,2,3-三唑制备N-(2-烷氧基乙烯基)磺酰胺及其后续转化为取代的酞烷和苯乙胺

在此，我们介绍一种一锅法、无过渡金属参与的合成方法，由芳香卤化物与甲硫化钠反应制备硫醇和硫酯，随后利用生成的硫醇物种制备金属二硫烯网络的单晶 原位 从更稳定且易于处理的硫酯。...

合成用于结晶半导体陀螺形金属-硫框架的巯基构筑单元

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。...

合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

本文介绍了能够生长的基于多肽的小单层囊泡的制备方案。为促进 在体外...

在囊泡内合成肽类膜前体以实现囊泡自主生长

本文介绍了一种合成信息编码的肽模拟寡聚物的方案，并利用胺类和醛类作为动态共价反应对，以及路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐作为多功能试剂，指导这些肽模拟物进行序列定向的自组装，形成分子梯状结构。...

信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

本方案介绍了环状肽的合成方法 通过...

利用连接臂上的硫鎓中心构建环状多肽

学习利用光诱导硫醇-烯/炔点击化学反应构建硫醚/乙烯基硫化物栓系螺旋肽的方法。该技术通过无痕修饰位点显著扩展稳定肽的化学空间，为肽化学研究提供高效合成策略。

通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

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