Name: 利用新的细胞分选策略, 从小鼠骨髓中生成大量的髓样祖细胞和树突状体细胞前体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习利用高速细胞分选技术从小鼠骨髓中分离髓样祖细胞的方法。该技术通过Ly6C和CD115标记识别五种不同细胞群，为发育免疫学研究和骨髓移植治疗提供可靠的细胞分离方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢奥本大学兽医学院流式细胞术实验室的 Alison Church Bird 提供的技术支持，感谢美国国立卫生研究院（NIH）为 EHS 提供的 R15 AI107773 项目资助，以及奥本大学细胞与分子生物学项目为 PBR 提供的暑期研究经费支持。

所有动物实验均经奥本大学机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。
1. 骨髓采集的准备工作
<ol>
	<li>通过将含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50 µM 2-巯基乙醇的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基溶液加入至0.22 µm真空过滤装置的顶部，并施加真空，制备250 mL完全培养基。 
	注意：完全培养基可在4 °C保存最多2个月。</li>
	<li>在500 mL烧瓶中，将350 mL 100%乙醇与150 mL无菌H2O混合，配制70%乙醇溶液。</li>
	<li>将离心机设定为4 °C。</li>
	<li>将镊子、手术刀和剪刀在70%乙醇中进行灭菌处理。</li>
	<li>使用移液管向三个60 mm培养皿中各加入5 mL完全培养基。</li>
	<li>使用移液管向一个50 mL锥形管中加入30 mL完全培养基。</li>
</ol>
2. 小鼠骨髓细胞的收集
<ol>
	<li>通过 CO₂ 处死一只 C57BL/6 小鼠2 根据2013年美国兽医协会（AVMA）《安乐死指南》规定的标准实施麻醉。</li>
	<li>去除并剥离后肢。
	<ol>
		<li>用75%乙醇浸透后肢和躯干，用弯头组织剪在髋关节周围皮肤上做浅切口。用镊子从髋部向下牢固地拉扯皮肤至踝部，暴露肌肉。用剪刀移除皮肤瓣。</li>
		<li>通过在股骨/髋关节上方的骨骼处切割，取下整个后腿。 
		注意：除了对操作区域进行消毒外，乙醇还有助于实现干净的切割，并防止毛发污染样本。</li>
		<li>若需将腿部转移至新位置以采集骨髓，应将腿部浸入完全培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌生物安全柜中操作，将腿部组织转移至一个预先准备好的培养皿中。</li>
	<li>使用剪刀在踝关节下方剪断，并尽可能仔细地去除大部分肌肉和弹性结缔组织。将清理后的骨骼转移至第二个已准备好的培养皿中。 
	注意：虽然无需去除全部肌肉组织，但残留过多组织可能会妨碍骨髓的冲洗。</li>
	<li>分离股骨、膝关节和胫骨。
	<ol>
		<li>用镊子夹住腿部膝关节处，找到骨髓。 
		注意：骨髓应表现为股骨顶端和胫骨末端骨腔内一条淡红色的细线。
		<ol>
			<li>使用剪刀进行如下三次切割。
			<ol>
				<li>在胫骨骨髓似乎终止的位置上方进行截断。</li>
				<li>在膝关节下方进行切割。</li>
				<li>在膝关节上方进行切割。</li>
				<li>如果髋关节仍与股骨相连，则在髋关节下方进行切割。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将三个片段放回培养皿中，并在另一条腿上重复此过程。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从股骨和胫骨中冲洗出骨髓。
	<ol>
		<li>从50 mL离心管中吸取完全培养基至10 mL注射器，并接上23 G针头。</li>
		<li>用镊子夹住骨骼置于第三个已准备好的培养皿上方，将针头插入骨髓腔，推注培养基以冲洗出细胞（细胞可能以完整组织团块形式流出） &#34;塞子&#34; 或呈多个簇状）。重复操作，直至透过骨骼看不到更多颜色为止。根据需要，重新向注射器中添加培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压碎骨骺。
	<ol>
		<li>仍在第二个培养皿中时，用镊子牢固夹住膝关节软骨，用注射器尖端压碎膝部。持续操作直至骨骺不再呈红色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器将第二和第三个培养皿中的细胞转移至50 mL离心管中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，尽量避免产生气泡。在250 x g 4 °C 下孵育 10 分钟</li>
	<li>裂解红细胞
	<ol>
		<li>用血清移液管吸除上清液，轻弹管底使沉淀松动，加入1 mL ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液，室温孵育1分钟以裂解红细胞。</li>
		<li>使用血清移液管加入 40 mL HBSS（Hanks 平衡盐溶液）缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血清移液管将细胞通过70 µm细胞滤网过滤至新的50 mL锥形管中。在250 x g 4 °C 下 10 分钟</li>
	<li>使用血清移液管吸除上清液，并用 40 mL 完全培养基洗涤细胞。在 250 x g 4 °C 下 10 分钟 
	注意：在此阶段，可通过流式细胞分选（FACS）或磁珠柱分选去除谱系阳性淋巴细胞。然而，淋巴ocytes在体外培养中无法长期维持。尽管在骨髓的Ly6C-CD115-细胞群中存在大量谱系阳性细胞 离体，到第5天时几乎全部消失图2).</li>
	<li>使用血清移液管吸除上清液，然后将骨髓细胞接种于完全培养基中，加入10 ng/mL重组小鼠GM-CSF，细胞密度为1 x 106 cells/mL 
	注意：通常为 4 x 107 在红细胞裂解后可收获总细胞。但预计细胞数量可能低至 2 x 107 适用于初学者，最高可达 5 x 107 有经验的收获者适用的细胞</li>
	<li>使用血清学移液管将细胞转移至组织培养板中，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2若使用24孔板，每孔接种2 mL细胞悬液。</li>
	<li>每 48 小时，使用血清移液管移除一半培养基，并补充新鲜的完全培养基和 GM-CSF。 
	注意：培养物最长可保存9天，但其成分会随时间发生变化。更多信息请参见第3节。</li>
</ol>
3. 选择分选日期
<ol>
	<li>由于细胞群体组成随时间变化，应选择目标细胞数量最多的培养时间点。</li>
	<li>参见表1，了解在GM-CSF中培养3、5和7天后，每1 × 107个细胞分选后各细胞群体的预期细胞得率。</li>
</ol>
4. 染色策略
<ol>
	<li>使用少量细胞 aliquot 制备对照样本。包括未染色对照、每种荧光抗体单独染色的补偿对照，以及除一种抗体外其余抗体均加入的荧光减一对照（fluorescence-minus-one control），以校正该检测通道的非特异性荧光。若采用间接标记法，需包括仅加一抗、仅加二抗以及一抗和二抗均添加的对照。 
	注意：当联合使用时，藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）标记的抗体可实现明显分离且串色极少。然而，若荧光染料选择有限，需注意CD115表达水平相对较低，而Ly6C表达水平非常高。因此，抗CD115抗体宜选用较亮的荧光染料，而抗Ly6C抗体的荧光染料则应选择以避免荧光串色。</li>
	<li>在50 mL锥形管中，将97 mL预冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）与3 mL胎牛血清混合，配制100 mL FACS洗涤缓冲液（FWB），并置于冰浴中。</li>
	<li>使用移液器轻柔但彻底地上下吹打细胞，以去除任何松散贴壁的细胞。</li>
	<li>使用血清移液管将细胞转移至50 mL锥形管中。在250 x g 4 °C 下 10 分钟
	<ol>
		<li>如果细胞体积超过50 mL，将细胞转移至所需数量的离心管中，并在染色步骤合并。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻倒去上清液，用移液管加入30 mL FWB重悬细胞沉淀进行洗涤。250 x g 4 °C 下离心 10 分钟，重复洗涤一次。 
	注意：如果预期细胞死亡率较高，可用含低至0.5%胎牛血清（FCS）的FWB洗涤细胞，以防止细胞聚团。</li>
	<li>根据抗体生产商的说明悬浮并染色细胞。
	<ol>
		<li>将5 × 10⁶细胞悬浮于7 1 mL FWB 中的细胞，加入 2 µg 带有荧光染料标记的抗 Ly6C 抗体和 2 µg 带有荧光染料标记的抗 CD115 抗体（荧光染料由研究人员自行选择）。为进一步区分 CMP 与 moDC（两者均为 Ly6C 阴性和 CD115 阴性），加入 2 µg 抗 CD11c 抗体（CMP 为 CD11c 阴性）-；moDC 为 CD11c+）。冰上孵育30分钟。 
		注意： 图3 使用 Ly6C-PE 和 CD115-APC 生成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血清移液管加入 10 mL FWB，于 250 x g 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>轻轻倒出上清液，然后用血清移液管加入30 mL FWB重悬沉淀细胞进行洗涤。以250 x g 4 °C 下离心 10 分钟，重复洗涤一次。</li>
	<li>在悬浮细胞前，用力轻弹离心管以充分松动沉淀。使用刻度移液管将细胞重悬于 1 x 107 每毫升FWB中加入细胞，经35-µm细胞滤器过滤。使用血清学移液管将过滤后的细胞转移至聚丙烯管中，置于冰上保存，待分选时使用。 
	注意：如果无法获得聚丙烯材料，可使用蛋白质包被（脱脂干奶或FCS）的聚苯乙烯管以减少结合。</li>
</ol>
5. 根据对照样本设置门控
注意：为防止高速流动液流压力导致细胞破裂，细胞分选时应使用 100–130 µm 的喷嘴。
<ol>
	<li>将未染色对照样本（见步骤 4.1）上样至流式细胞分选仪，并设置门控以排除微小碎片（前向散射光信号低；FSC）和高颗粒性（侧向散射光信号高；SSC）的颗粒。
	<ol>
		<li>若仅分析后期阶段细胞（单核细胞、moMac/MoDP 和 MoDC），则通过门控仅包含体积较大的细胞（FSC 信号高）。</li>
		<li>若使用了活力染料，可利用其排除染色的非活细胞事件（示例见图 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单荧光对照样本上样至流式细胞分选仪，并根据需要调整补偿参数。</li>
	<li>上样多标记样本，观察到四个明显不同的细胞群：Ly6C+CD115-（GMPs）、Ly6C+CD115+（单核细胞）、Ly6C-CD115+（moMacs/moDP）和 Ly6C-CD115-（CMPs/moDCs）。对这四个主要细胞群分别设置门控以进行分离。 
	注意：CMPs 与 moDC 具有相同的 Ly6C-CD115- 表型，但可根据 CD11c 的表达水平加以区分：CMP 不表达 CD11c，而 MoDC 表达 CD11c。</li>
</ol>
6. 分离群体的收集
<ol>
	<li>通过向收集管中加入足量的 FCS，使管子装满时终浓度至少达到 20%。例如，若使用 5 mL 的管子，则分选前先加入 1 mL FCS，并在总体积达到 5 mL 时移走该管。</li>
	<li>为防止膜转运和抗体摄取，整个分选过程中所有样品（混合和已分选的）均需保持在 4 °C。
	<ol>
		<li>若无法实现此条件，则尽可能将待分选细胞的管子置于冰上，并根据需要将等分试样转移至分选仪。</li>
		<li>此外，每 20–30 分钟将已分选的样品转移至冰上一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集到目标数量的细胞后，使用血清移液管将细胞转移至新的锥形管中，在 4 °C 下以 250 x g 离心 10 分钟。
	<ol>
		<li>通过分选后对每个收集群体的小量等分试样进行分析，确认纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液，加入 10 mL FWB 重悬细胞，在 4 °C 下以 250 x g 离心 10 分钟。共重复洗涤两次。 
	注意：在不扰动沉淀的情况下完全去除上清液可能较困难。可将移液管头连接至真空管线以辅助去除。若无此设备，建议将上清液收集至新管中，以防沉淀解离。</li>
	<li>第二次洗涤后弃去上清液。</li>
	<li>若用户的实验设计要求细胞重新培养，则执行步骤 2.12–2.14；否则，若细胞将用于即时分析，则根据所需方案处理细胞。 
	注意：典型的功​​能分析示例见图 4。</li>
</ol>

<ol><li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF%3A+more+than+a+hematopoietic+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+cytokine%2C+GM-CSF%2C+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li>
<li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF%3A+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10449155">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li>
<li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li>
<li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+antigen+presentation%2C+accessory+function+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li>
<li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li>
<li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+developmental+stages%2C+kinetics%2C+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985(2017).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li>
<li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation%3A+timing+matters%21%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li>
<li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li>
<li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327(2017).</li>
<li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li>
<li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CD8%7Balpha%7D-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方案可分离出足够数量的由GM-CSF驱动的祖细胞和前体细胞，适用于多种分析，包括生化检测和细胞功能检测 体外或灌注 体内该方法代表了单核细胞来源的树突状细胞发育领域的一项重大进展，能够可靠地分离和鉴定该发育途径早期阶段的细胞，以及既往研究中更常分离的已分化细胞类型。
既往从骨髓中分离祖细胞和前体细胞的方案 体外 依赖CFSE染色来鉴定增殖性前体细胞&#160;17 或使用 CD31 和 Ly6C 染色标记髓系细胞&#160;18Naik 描述的 CFSE 染色方案旨在用于 Flt3L 诱导的树突状细胞前体和祖细胞的生成&#160;17当我们尝试在GM-CSF培养体系中采用该方法时，遇到了两个主要问题。CFSE对发育中的细胞具有一定的细胞毒性，且其荧光信号过强（即使在已分裂的细胞中），导致补偿设置困难。该方法被证明不适合我们的研究目标，即从增殖活跃的细胞（如CMPs/GMPs）到高度分化...

利用细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF）培养小鼠骨髓细胞，是一种广泛用于大量生成单核细胞来源的树突状细胞（moDC；也称为炎症性树突状细胞）的方法1,2,3,4,5。这些细胞在多种树突状细胞（DC）功能研究中具有重要价值6,7,8。通常情况下，这些小鼠骨髓细胞需培养6–8天，随后用于树突状细胞功能的研究5。长期以来，此类培养物被认为具有较高的均一性，主要由已分化的moDC组成。然而，近年来的研究表明，在6–8天培养结束时，培养体系中不仅存在大量moDC，还包含一个显著的单核细胞来源的巨噬细胞（moMacs）亚群9,10,11。我们先前的研究进一步证实，即使在培养7天后，仍存在少量其他发育阶段较早的细胞亚群，例如moDC前体细胞（moDP）和单核细胞10。因此，利用该体系生成的细胞进行树突状细胞（DC）功能研究时，其观察到的反应可能反映了比以往认知更为广泛的多种细胞类型的共同作用。
通过对GM-CSF诱导生成的moDC的研究，我们已深入了解这些细胞在终末分化阶段的功能&#160;12,13,14。然而，关于这些细胞的发育通路&#160;2,15,16，以及它们在何时、以何种方式表现出特定功能（如对病原体相关分子模式（PAMPs）的响应、吞噬作用、抗原加工与呈递&#160;13以及抗菌活性）等方面，我们的认识仍十分有限。已有研究报道了一种用于分离大量传统Flt3L驱动的树突状细胞（DC）祖细胞和前体细胞的方案&#160;17。该方法通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的骨髓细胞（用于追踪分裂细胞）并在Flt3L中培养3天来实现这些不同细胞群体的分离。随后去除谱系阳性细胞，并根据CD11c的表达水平将细胞分选为祖细胞和前体细胞群体&#160;17。Leenen研究组提出的另一种在GM-CSF驱动培养体系中鉴定DC早期祖细胞的方法，是基于CD31和Ly6C的表达进行细胞分选18。本研究的最初目标是建立一种类似的方法，用于获取GM-CSF驱动的moDC的祖细胞和前体细胞。鉴于GM-CSF所诱导产生的特定细胞类型，我们调整了分选策略，依据发育早期和晚期阶段表达的分子标志物进行细胞分离。最终我们确定，Ly6C、CD115（CSF-1受体）和CD11c是区分这些细胞类型的最佳标志物&#160;10。
本文介绍了一种方法，用于分离在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）驱动的分化通路中处于不同发育阶段的细胞：共同髓系祖细胞（CMP）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞（MoMac）以及单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）。根据MHC II类分子表达水平的不同，可进一步将MoMac群体进行分离，从而鉴定出一种MoDC前体细胞群体（moDP）&#160;10。我们采用高速荧光激活细胞分选（FACS）策略，依据Ly6C、CD115和CD11c的表达情况，分离上述五种细胞群体。随后，我们通过功能实验检测这些细胞对病原体相关分子模式（PAMP）刺激的反应能力。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>用于补充完全培养基和FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>用于补充完全培养基</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（2-ME）</td><td>MP Biomedical</td><td>190242</td><td>用于补充完全培养基</td></tr><tr><td>75 mM 真空滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>用于完全培养基的灭菌</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>用于裂解红细胞</td></tr><tr><td>HBSS缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>用于红细胞裂解后回收白细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），Dulbecco's配方</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>必须无内毒素；在4 &amp;deg;C预冷</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m细胞滤网</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>在上样流式细胞仪前用于分散细胞团块</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>使用浓度为10 ng/mL</td></tr><tr><td>组织培养处理板</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>用于收获骨髓细胞后培养</td></tr><tr><td>抗-Ly6C，克隆HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD115，克隆AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD11c，克隆HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>用于区分CMP和MoDCs</td></tr><tr><td>MoFlo XPD 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>雌性；10–20周龄</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&amp;nbsp;R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件 v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

近年来，人们认识到利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从小鼠骨髓诱导生成的单核细胞来源树突状细胞（moDC）培养物比以往所认为的更具异质性。这些培养物通常不仅包含moDC，还含有单核细胞来源的巨噬细胞（moMac），甚至一些发育程度较低的细胞，例如单核细胞。本实验方案的目标是提供一种稳定的方法，用于识别和分离这些培养物在发育过程中存在的多种细胞类型，以便进一步研究它们各自的功能。本文介绍的分选策略首先根据Ly6C和CD115的表达情况将细胞分为四个群体，这两种分子在GM-CSF驱动的培养过程中均呈短暂表达。这四个群体包括：共同髓系前体细胞（CMP，Ly6C⁻, CD115⁻）、粒细胞/巨噬细胞前体细胞（GMP，Ly6C⁺, CD115⁻）、单核细胞（Ly6C⁺, CD115⁺）以及单核细胞来源的巨噬细胞（moMac，Ly6C⁻, CD115⁺）。分选策略中还加入了CD11c的检测，以区分Ly6C⁻, CD115⁻群体中的两个亚群：CMP（CD11c⁻）和moDC（CD11c⁺）。最后，在Ly6C⁻, CD115⁺群体中，可根据MHC II类分子的表达水平进一步区分两个亚群：moMac表达较低水平的MHC II类分子，而单核细胞来源的树突状细胞前体（moDP）则表达较高水平的MHC II类分子。该方法可稳定分离出多个发育阶段不同的细胞群体，且数量足以满足多种功能与发育分析的需求。我们以其中一种功能检测为例，展示了这些细胞类型对病原体相关分子模式（PAMPs）刺激的不同反应特性。

为了尽可能保留更多的通道用于分析，通常根据前向散射和侧向散射选择活细胞，排除体积过小和颗粒度过高的事件（在图1A的所有散点图中均应用了典型的设门策略）。为了确定这种设门策略是否能可靠地排除死细胞，我们使用了7-氨基放线菌素D（7-AAD）进行染色（图1B）。由于膜通透性的改变，7-AAD可进入死亡或濒死细胞并与DNA结合，而活细胞则能将其排除。对GM-CSF培养的骨髓细胞的活力分析分别在收获后立即（PH）以及培养第1、3和5天进行。在收获后立即分析的细胞中，当对从骨髓中新鲜分离的细胞应用典型的FSC/SSC设门时，约有10%的细胞呈7-AAD阳性（图1，收获后）。在培养第1天（约12%）和第3天（约11%）也观察到相似比例的死细胞（图1，第1天PH和第3天PH）。到第5天时，设门范围内的死细胞比例下降至约5%（<strong class...

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。

利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从小鼠骨髓诱导生成的单核细胞来源树突状细胞（moDC）培养物具有……

该方法可使研究人员获得足够数量的细胞类型，以回答发育免疫学领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，它仅依赖少数特定标记物即可分离出大量传统上在体外数量稀少的细胞。该技术的应用意义延伸至治疗性骨髓移植，因为它能够实现大量前体细胞的分离。开始实验步骤时，用75%乙醇充分浸润一只预先准备好的小鼠的后肢和躯干，在髋关节周围用弯头组织剪在皮肤上做浅切口。随后，取下并剥离后肢。用镊子从髋部向下牢固地拉扯皮肤至踝部，暴露出肌肉组织，再用剪刀移除皮肤瓣。在股骨和髋关节上方进行切割，通过切断骨骼移除整个后肢。在无菌生物安全柜中操作，将后肢转移至一个预先准备好的培养皿中。使用剪刀在踝关节下方进行切割，并尽可能仔细地去除大部分肌肉和弹性结缔组织。将清洗后的骨骼转移至第二个已准备好的培养皿中。接着，分离股骨、膝关节和胫骨。用镊子夹住腿部的膝关节处，寻找骨髓，骨髓位于股骨顶端骨腔内以及靠近胫骨末端处，呈一条淡红色细线。用剪刀在胫骨骨髓似乎终止位置的上方剪断。在膝关节下方剪断，再在膝关节上方剪断。随后，从股骨和胫骨中冲洗出骨髓。从50毫升锥形管中吸取完全培养基，注入10毫升注射器中，并在注射器前端安装23号针头。用镊子夹住骨骼，置于第三个已准备好的培养皿上方，将针头插入骨髓腔，推注培养基以冲洗出细胞。重复此步骤，直至骨组织中不再有颜色流出为止。继续操作，压碎骨骺。仍在第二个培养皿中时，用镊子牢固夹住膝盖骨，用注射器的尖端捣碎膝盖组织，直至骨骺不再呈现红色为止。使用注射器将第二和第三个培养皿中的细胞转移至50毫升离心管中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，尽量避免产生气泡。离心细胞。然后用移液管吸除上清液，轻弹管底使沉淀松动，加入1毫升氯化铵钾溶液（ACK裂解缓冲液），在室温下孵育1分钟以裂解红细胞。使用移液管加入40毫升HBSS缓冲液。使用移液管将细胞通过70微米细胞滤网过滤至新的50毫升锥形管中，然后离心收集细胞。使用血清学移液管吸除上清液，并将骨髓细胞接种于完全培养基中，加入终浓度为10纳克/毫升的重组小鼠GM-CSF，细胞密度为每毫升1×10⁶个细胞。使用血清学移液管将细胞转移至组织培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至准备进行染色操作。轻柔但充分地反复吹打细胞，以悬浮松散贴壁的细胞。使用血清移液管将细胞转移至一个50毫升的锥形管中，并离心细胞。轻轻倒掉上清液，然后用血清移液管加入30毫升FACS洗涤缓冲液（或SFWB）重悬细胞沉淀进行洗涤。随后再次离心细胞，并重复洗涤步骤一次。接下来，按照抗体生产商的说明书对细胞进行悬浮和染色。将5 × 10⁷个细胞重悬于1毫升FWB中，并加入各2微克的荧光标记抗Ly-6C抗体和抗CD115抗体。为进一步区分CMP与MODC，加入2微克抗CD11C抗体。将样品置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，使用刻度移液管加入10毫升FWB，并离心细胞。轻轻倒掉上清液，然后用刻度移液管加入30毫升FWB重悬沉淀细胞，进行洗涤。离心细胞，并重复洗涤一次。在重悬细胞前，轻轻弹击离心管底部，充分混匀以使沉淀完全悬浮。使用血清移液管将细胞重悬于FWB中，使细胞浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并通过35微米细胞滤网进行过滤。使用刻度移液管将过滤后的细胞转移至聚丙烯管中，并将管子置于冰上，直至准备进行分选。将未染色对照样品上机通过细胞分选仪，并设置门控以排除微小碎片和高颗粒性物质。将单一荧光对照样品上机通过细胞分选仪，并根据需要调整补偿参数。运行多标记样本，并观察到四个不同的细胞群。对四个主要细胞群分别设置门控以进行分离。在收集管中加入足量的胎牛血清（FCS），确保加样完成后终浓度不低于20%。例如，若使用5 mL离心管，在分选前加入1 mL FCS，并在总体积达到5 mL时取出离心管。为防止膜转换和抗体摄取，整个分选过程中所有样品均需保持在4°C。在收集到所需数量的细胞后，使用血清移液管将细胞转移至新的锥形管中，并对细胞进行离心。小心吸除上清液，并将细胞重悬于 10 毫升 FWB 中，再次离心细胞。用 FWB 重悬共重复两次洗涤。最后，在第二次洗涤后吸除上清液，根据实验设计进行后续操作。为了尽可能保留更多可用于分析的通道，通常根据前向散射和侧向散射选择活细胞，排除体积过小和颗粒度过大的事件。为了确定该设门策略是否能可靠地排除死细胞，样本使用了7-氨基放线菌素D（7-Aminoactinomycin D）进行染色。收获后立即分析的细胞在对骨髓中 freshly isolated 的细胞应用典型的FSC、SSC设门时，约有10%的细胞呈7-AAD阳性。在培养第1天和第3天时，死细胞的比例也相似。到第五天时，门控范围内的死细胞数量已减少至5%，因此，使用此类活率门控通常适用于第五天及之后的分选。流式细胞术结果显示，在Ly6C阴性、CD115阳性群体中，CD3、CD45R阳性细胞从第0天至第3天持续大量存在。到第4天时，仅存少量CD3、CD45R阳性细胞，而到第5天和第6天时，已无任何CD3、CD45R表达细胞存在；因此，在GM-CSF中培养4天后，谱系标记阳性细胞基本消失，并在培养第5天和第6天时完全检测不到。进行该操作时，需注意细胞组成与培养时间长短密切相关。收获后第三天分选可获得大量早期阶段细胞而晚期阶段细胞较少，而第五天分选的培养物则相反。

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用新的细胞分选策略, 从小鼠骨髓中生成大量的髓样祖细胞和树突状体细胞前体

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。...

小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

本研究中，我们介绍了一种 体外 可高效生成浆细胞样树突状细胞的培养系统 由 在Flt3配体存在下，将普通淋巴样祖细胞与AC-6饲养细胞共培养。...

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

本文介绍了培养小鼠髓系前体细胞32D/G-CSF-R细胞系、进行病毒感染以及开展增殖和分化检测的详细实验方案。该细胞系适用于研究髓系细胞发育，以及目的基因在髓系细胞生长和中性粒细胞分化中的作用。...

小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

学习利用高速细胞分选技术从小鼠骨髓中分离髓样祖细胞的方法。该技术通过Ly6C和CD115标记识别五种不同细胞群，为发育免疫学研究和骨髓移植治疗提供可靠的细胞分离方案。

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

探索更多视频