利用新的细胞分选策略, 从小鼠骨髓中生成大量的髓样祖细胞和树突状体细胞前体

这种方法可以使研究人员获得足够数量的细胞类型来回答发育免疫学领域的关键问题。该技术的主要优点是它依赖于一些选定的标记物来分离传统上在体外以少量形式发现的大量细胞。该技术的含义延伸到治疗性骨髓移植，因为它允许分离大量祖细胞。

要开始该方案，用 75% 乙醇浸透先前制备的小鼠的后腿和躯干，然后用弯曲的组织剪刀浅切开髋关节周围的皮肤。然后，取出并剥离后腿。使用镊子，将皮肤从臀部牢牢拉向脚踝，露出肌肉，然后用剪刀去除皮瓣。

切开股骨和髋关节上方，切开骨头，切除整个后腿。在无菌生物安全柜中工作，将腿转移到先前准备好的培养皿之一。用剪刀剪开脚踝下方，并尽可能多地小心地去除肌肉和弹性结缔组织。

将清洗干净的骨头转移到第二个准备好的培养皿中。接下来，将股骨、膝盖和胫骨分开。使用镊子将腿固定在膝盖处并找到骨髓，这是股骨顶部和胫骨末端骨腔内的一条微弱的红线。

用剪刀剪断骨髓似乎结束的正上方的胫骨。在膝关节正下方切开，在膝关节正上方切开。然后，从股骨和胫骨冲洗骨髓。

用 50 毫升锥形管中的完全培养基填充 10 毫升注射器，并用 23 号针头盖住注射器。用镊子将骨头放在第三个准备好的培养皿上方，将针头插入骨管，然后将培养基推过，冲洗出细胞。重复此步骤，直到无法通过骨骼看到更多颜色。

通过压碎骨骺继续该过程。当仍在第二个培养皿中时，用镊子牢牢握住膝盖骨，然后用注射器的尖端捣碎膝盖。继续作，直到骨骺不再发红。

使用注射器将细胞从第二个和第三个培养皿转移到 50 毫升试管中。通过轻轻上下移液来打碎团块，并尽量避免形成气泡。离心细胞。

然后用血清移液管去除上清液，轻弹去除沉淀，并在室温下将红细胞置于 1 毫升氯化铵钾或 ACK 裂解缓冲液中孵育 1 分钟，裂解红细胞。使用血清移液管，加入 40 mL HBSS 缓冲液。使用血清移液管，通过 70 微米细胞过滤器将细胞过滤到新的 50 毫升锥形管中，然后离心细胞。

使用血清移液管去除上清液，并在含有 10 ng/mL 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养基中以 10 倍/mL 的密度培养骨髓细胞，至第 6 个细胞/mL。使用血清移液管，将细胞转移到组织培养板中，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育，直到准备好进行染色。轻轻但彻底地上下移液细胞，以去除松散贴壁的细胞。

使用血清移液管，将细胞转移至 50 mL 锥形管中，然后离心细胞。轻轻倒出上清液，然后用血清移液管加入 30 毫升 FACS 洗涤缓冲液或 SFWB 洗涤沉淀的细胞。然后离心细胞并重复洗涤。

接下来，按照抗体制造商的说明对细胞进行悬浮和染色。在 1 毫升 FWB 中重悬第 7 个细胞 10 次 5 次，并添加 2 微克抗 Ly-6C 和抗 CD115，用荧光团标记。为了进一步区分 CMP 和 MODC，添加 2 μg 抗 CD11C 抗体。

将样品在冰上孵育 30 分钟。孵育后，使用血清移液管加入 10 毫升 FWB，并离心细胞。轻轻倒出上清液，用血清移液管加入 30 毫升 FWB 洗涤沉淀的细胞。

离心细胞，然后重复洗涤。在悬浮细胞之前，彻底弹动试管以去除沉淀。使用血清移液管以每毫升 FWB 的 10 至第 7 个细胞一次重悬细胞，并通过 35 微米细胞过滤器过滤它们。

使用血清移液管将过滤后的细胞转移到聚丙烯管中，并将管放在冰上，直到它们准备好进行分选。通过细胞分选仪运行未染色的对照，并应用门以排除小碎片和高颗粒颗粒。通过细胞分选仪运行单个荧光对照样品，并根据需要调整补偿。

运行多标记样品的样本，并观察四个不同的群体。应用一个门来隔离四个主要群体中的每一个。通过添加足够的胎牛血清 （FCS） 来制备收集管，以在装满时达到至少 20% 的最终浓度。

例如，如果使用 5 mL 试管，则在分选前添加 1 mL FCS，并在总体积达到 5 mL 时取出试管。为防止膜更新和抗体摄取，请在整个分拣过程中将所有样品保持在 4 摄氏度。收集所需数量的细胞后，使用血清移液器将细胞转移到新的锥形管中，然后离心细胞。

小心去除上清液，将细胞重悬于 10 ml FWB 中，然后再次离心细胞。重复 FWB 悬浮液，总共洗涤两次。最后，在第二次洗涤后去除上清液，并根据实验设计进行。

为了保持尽可能多的通道可用于分析，根据前向和侧向散射常规选择活细胞，排除非常小和非常精细的事件。为了确定这种设门策略是否可靠地排除了死细胞，样品用 7-氨基放线菌素 D 染色，当典型的 FSC、SSC 门应用于从骨髓中新鲜分离的细胞时，收获后立即分析的细胞具有约 10% 的 7-AAD 阳性细胞。在培养物的第 1 个和第 3 个停留中也存在相似比例的死细胞。

到第 5 天，门内的死细胞数量减少到 5%，因此，使用这种活力门通常适合在第 5 天及之后进行分选。流式细胞术显示，在 Ly6C 阴性、CD115 群体中，CD3、CD45R 阳性细胞在第 0 天到第 3 天强烈存在。第 4 天，只剩下少量 CD3、CD45R 阳性细胞，到第 5 天和第 6 天，没有表达 CD3、CD45R 的细胞存在;因此，在 GM-CSF 培养后 4 天内，谱系阳性细胞基本上不存在，并且在培养的第 5 天和第 6 天根本未检测到。

在尝试此过程时，请务必记住细胞组成取决于培养时间的长短。收获后 3 天分选会产生大量早期和很少的晚期分选，反之亦然，5 天后分选的培养物则相反。