利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

该方法可使研究人员获得足够数量的细胞类型，以回答发育免疫学领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，它仅依赖少数特定标记物即可分离出大量传统上在体外数量稀少的细胞。该技术的应用意义延伸至治疗性骨髓移植，因为它能够实现大量前体细胞的分离。

开始实验步骤时，用75%乙醇充分浸润一只预先准备好的小鼠的后肢和躯干，在髋关节周围用弯头组织剪在皮肤上做浅切口。随后，取下并剥离后肢。用镊子从髋部向下牢固地拉扯皮肤至踝部，暴露出肌肉组织，再用剪刀移除皮肤瓣。

在股骨和髋关节上方进行切割，通过切断骨骼移除整个后肢。在无菌生物安全柜中操作，将后肢转移至一个预先准备好的培养皿中。使用剪刀在踝关节下方进行切割，并尽可能仔细地去除大部分肌肉和弹性结缔组织。

将清洗后的骨骼转移至第二个已准备好的培养皿中。接着，分离股骨、膝关节和胫骨。用镊子夹住腿部的膝关节处，寻找骨髓，骨髓位于股骨顶端骨腔内以及靠近胫骨末端处，呈一条淡红色细线。

用剪刀在胫骨骨髓似乎终止位置的上方剪断。在膝关节下方剪断，再在膝关节上方剪断。随后，从股骨和胫骨中冲洗出骨髓。

从50毫升锥形管中吸取完全培养基，注入10毫升注射器中，并在注射器前端安装23号针头。用镊子夹住骨骼，置于第三个已准备好的培养皿上方，将针头插入骨髓腔，推注培养基以冲洗出细胞。重复此步骤，直至骨组织中不再有颜色流出为止。

继续操作，压碎骨骺。仍在第二个培养皿中时，用镊子牢固夹住膝盖骨，用注射器的尖端捣碎膝盖组织，直至骨骺不再呈现红色为止。

使用注射器将第二和第三个培养皿中的细胞转移至50毫升离心管中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，尽量避免产生气泡。离心细胞。

然后用移液管吸除上清液，轻弹管底使沉淀松动，加入1毫升氯化铵钾溶液（ACK裂解缓冲液），在室温下孵育1分钟以裂解红细胞。使用移液管加入40毫升HBSS缓冲液。使用移液管将细胞通过70微米细胞滤网过滤至新的50毫升锥形管中，然后离心收集细胞。

使用血清学移液管吸除上清液，并将骨髓细胞接种于完全培养基中，加入终浓度为10纳克/毫升的重组小鼠GM-CSF，细胞密度为每毫升1×10⁶个细胞。使用血清学移液管将细胞转移至组织培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至准备进行染色操作。轻柔但充分地反复吹打细胞，以悬浮松散贴壁的细胞。

使用血清移液管将细胞转移至一个50毫升的锥形管中，并离心细胞。轻轻倒掉上清液，然后用血清移液管加入30毫升FACS洗涤缓冲液（或SFWB）重悬细胞沉淀进行洗涤。随后再次离心细胞，并重复洗涤步骤一次。

接下来，按照抗体生产商的说明书对细胞进行悬浮和染色。将5 × 10⁷个细胞重悬于1毫升FWB中，并加入各2微克的荧光标记抗Ly-6C抗体和抗CD115抗体。为进一步区分CMP与MODC，加入2微克抗CD11C抗体。

将样品置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，使用刻度移液管加入10毫升FWB，并离心细胞。轻轻倒掉上清液，然后用刻度移液管加入30毫升FWB重悬沉淀细胞，进行洗涤。

离心细胞，并重复洗涤一次。在重悬细胞前，轻轻弹击离心管底部，充分混匀以使沉淀完全悬浮。使用血清移液管将细胞重悬于FWB中，使细胞浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并通过35微米细胞滤网进行过滤。

使用刻度移液管将过滤后的细胞转移至聚丙烯管中，并将管子置于冰上，直至准备进行分选。将未染色对照样品上机通过细胞分选仪，并设置门控以排除微小碎片和高颗粒性物质。将单一荧光对照样品上机通过细胞分选仪，并根据需要调整补偿参数。

运行多标记样本，并观察到四个不同的细胞群。对四个主要细胞群分别设置门控以进行分离。在收集管中加入足量的胎牛血清（FCS），确保加样完成后终浓度不低于20%。

例如，若使用5 mL离心管，在分选前加入1 mL FCS，并在总体积达到5 mL时取出离心管。为防止膜转换和抗体摄取，整个分选过程中所有样品均需保持在4°C。在收集到所需数量的细胞后，使用血清移液管将细胞转移至新的锥形管中，并对细胞进行离心。

小心吸除上清液，并将细胞重悬于 10 毫升 FWB 中，再次离心细胞。用 FWB 重悬共重复两次洗涤。最后，在第二次洗涤后吸除上清液，根据实验设计进行后续操作。

为了尽可能保留更多可用于分析的通道，通常根据前向散射和侧向散射选择活细胞，排除体积过小和颗粒度过大的事件。为了确定该设门策略是否能可靠地排除死细胞，样本使用了7-氨基放线菌素D（7-Aminoactinomycin D）进行染色。收获后立即分析的细胞在对骨髓中 freshly isolated 的细胞应用典型的FSC、SSC设门时，约有10%的细胞呈7-AAD阳性。在培养第1天和第3天时，死细胞的比例也相似。

到第五天时，门控范围内的死细胞数量已减少至5%，因此，使用此类活率门控通常适用于第五天及之后的分选。流式细胞术结果显示，在Ly6C阴性、CD115阳性群体中，CD3、CD45R阳性细胞从第0天至第3天持续大量存在。到第4天时，仅存少量CD3、CD45R阳性细胞，而到第5天和第6天时，已无任何CD3、CD45R表达细胞存在；因此，在GM-CSF中培养4天后，谱系标记阳性细胞基本消失，并在培养第5天和第6天时完全检测不到。

进行该操作时，需注意细胞组成与培养时间长短密切相关。收获后第三天分选可获得大量早期阶段细胞而晚期阶段细胞较少，而第五天分选的培养物则相反。