Name: 基于流式细胞仪的 Zika 病毒疗养血清测定登革热病毒的体外抗体依赖性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习使用流式细胞术检测寨卡病毒康复血清对登革热病毒的抗体依赖性增强效应。该方法利用报告病毒颗粒评估血清介导的感染增强能力，为疫苗开发和公共卫生研究提供高通量、简便可靠的实验工具。

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本项目由健康科学统一服务大学资助，资助方为JJM。本文所包含的观点或主张均为作者个人观点，不应被视为官方立场，也不代表美国国防部、健康科学统一服务大学或任何其他美国政府机构的观点。
WGV 完成了所有实验并分析了数据；JJM 设计并监督了本研究；WGW 和 JJM 撰写了论文。

本方案所用血清样本来自恒河猴，这些动物的饲养和护理均遵循当地、州级和联邦政策，并在国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会审查并批准，样本通过组织共享方案获得。
1. 第1天
注意：所有下述步骤均须在生物安全二级（BSL-2）实验室中用于组织培养的无菌层流生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>将血清样本在室温下解冻，并将每份血清样本各100 µL转移至无菌管中。在56°C水浴或可调温的恒温混匀仪中加热灭活30分钟。使用冷的RPMI-10培养基（含10%胎牛血清的RPMI）对血清样本进行10倍系列稀释，稀释范围从1:1至1:1,000。</li>
	<li>将系列稀释后的血清样本各10 µL加入到无菌96孔V型底板的每个孔中。设置两组对照孔：一组为仅含RPMI-10和RVPs但不含血清样本的孔，另一组为仅含RPMI-10、不含RVPs和血清样本的孔。每份血清样本及RPMI-10对照组均设三个复孔。</li>
	<li>从-80°C冰箱中取出登革病毒1、2、3和4型RVPs，在37°C水浴中解冻，并立即将解冻后的RVPs置于冰上。每份血清样本需准备约170 µL RVPs（每个血清稀释度（1:1、1:10、1:100、1:1,000）对应3个孔，每孔10 µL RVPs；仅含RPMI-10和RVPs的对照组每个也需3个孔，每孔10 µL RVPs）。</li>
	<li>用移液器将10 µL RVPs加入含有血清样本的96孔V型底板各孔以及仅含RPMI-10和RVPs（无血清）的对照孔中。不要向仅含RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的孔中加入RVPs。通过上下吹打5–10次充分混匀。在仅含冷RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的对照孔中，每孔加入10 µL冷RPMI-10以代替RVPs。</li>
	<li>将96孔V型底板转移至培养箱中，在37°C、5% CO2条件下孵育1小时。在96孔V型底板孵育期间，使用70%乙醇清洁生物安全柜表面，并开启紫外灯照射15分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出一个完全融合的T75培养瓶K562细胞，用无菌5 mL移液管充分混匀细胞，将5 mL细胞悬液转移至无菌15 mL锥形管中。 
	注：K562细胞维持在RPMI-10培养基中，传代密度为1 × 106/mL。</li>
	<li>从无菌15 mL锥形管中取出10 µL细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数，以确定15 mL锥形管中的总细胞数。</li>
	<li>将含细胞的15 mL锥形管在约1,200 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于预热的RPMI-10培养基中，调整浓度为80,000个细胞/30 µL培养基（即2.66 × 106 个细胞/mL）。</li>
	<li>从培养箱中取出96孔V型底板（步骤1.6），向每孔加入30 µL K562细胞，通过上下吹打5–10次充分混匀。将96孔V型底板放回培养箱，在37°C、5% CO2条件下继续孵育1小时。</li>
	<li>孵育1小时后，从培养箱中取出96孔V型底板，在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中，弃去各孔中的培养基。</li>
	<li>通过向每孔加入125 µL预热的RPMI-10培养基重悬细胞，用移液器充分混匀，然后在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中弃去培养基。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>洗涤完成后，向每孔加入100 µL预热的RPMI-10培养基，用移液器上下吹打混匀，然后在37°C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
</ol>
2. 第3天
<ol>
	<li>从培养箱中取出含有100 µL细胞及培养基/孔的96孔V型底板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器混匀各孔内容物，并将细胞和培养基转移至96孔U型底板或预先标记的5 mL聚丙烯管中。</li>
	<li>用100 µL含1%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗96孔V型底板的每个孔，并将冲洗液转移至步骤2.1中的96孔U型底板对应孔或标记的5 mL聚丙烯管中，使每孔或每管中PFA的终浓度为0.5%。使用多通道移液器充分混匀，用铝箔纸覆盖板面，于培养箱中静置30分钟以固定细胞。</li>
	<li>运行未染色的K562细胞，校准流式细胞仪（示例参见材料表）的侧向散射光和前向散射光以及荧光参数设置。仅需使用FL1荧光通道，因为细胞中唯一表达的荧光为GFP。从每个样本中采集约30,000–50,000个细胞。 
	注意：由于感染RVP的细胞仅因表达GFP而发出绿色荧光，无需其他荧光通道，因此任何具备单荧光检测能力的流式细胞仪均可用于数据采集。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>使用任何流式细胞术分析软件（参见材料表）分析流式细胞仪上获得的数据。
	<ol>
		<li>根据FSC-A（前向散射-面积）对FSC-H（前向散射-高度）设置第一个门，以包含单个细胞并从分析中排除自发荧光的双联体12。然后，基于SSC-A（侧向散射-面积）对FSC-A对单细胞门控的细胞进行门控，以排除任何自发荧光碎片。</li>
		<li>对经SSC-A与FSC-A门控的细胞，分析其GFP表达情况，方法为SSC-A对GFP-A。通过在GFP+细胞周围设置门，确定各血清稀释度及对照样品中GFP+细胞的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将三个重复孔中GFP+细胞的总百分比除以3，计算每个血清样品稀释度及对照孔的GFP+细胞平均百分比。</li>
	<li>通过将各稀释度血清样品中GFP+细胞的平均百分比除以RPMI-10加RVPs（无血清样品）对照孔中GFP+细胞的平均百分比，计算感染增强倍数。</li>
	<li>绘制增强倍数（y轴）对稀释度（x轴）的图表，并采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行Tukey多重比较事后检验。</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）在结构蛋白和非结构蛋白方面均存在显著的同源性证据，这些蛋白可诱导产生相互交叉反应的抗体13,14。研究表明，这些交叉反应性抗体可在体内（in vivo）和体外（in vitro）增强异源血清型或其他相关黄病毒的感染1,2。这种交叉增强感染的可能性对疾病防控以及疫苗研发具有重要意义。
传统的基于培养的检测方法采用非许可性细胞，在血清存在的情况下用具有感染性的活体登革病毒（DENV）进行感染。通过标准蚀斑检测法定量上清液中的病毒量，以测量感染增强程度11。该检测需要在两种细胞系中培养病毒，且操作耗时较长。此外，并非所有DENV血清型的蚀斑形成方式都相同，这进一步增加了此类检测的复杂性。
<p class="jove_con...

抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement, ADE）感染是一种由某一病毒血清型诱导产生的部分交叉反应性抗体应答，促进另一种血清型病毒进入细胞的过程，导致病毒复制增加和病毒血症加重。登革病毒（Dengue virus, DENV）感染中已广泛记录了ADE现象，其中存在四种主要的血清型。在部分患者中，ADE与登革出血热（Dengue hemorrhagic fever, DHF）的发生相关。我们近期研究发现，寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染可诱导产生显著高水平的DENV交叉反应性抗体应答，从而引发DENV的ADE现象。 体外 并可能促进了登革病毒血症的增强 体内1,2抗体依赖性增强作用检测是评估抗体增强相关病毒二次感染能力的重要工具，可为黄病毒科病毒感染的致病机制提供有价值的见解，并为疫苗研发提供参考。
本实验所描述的方法利用登革病毒（DENV）报告病毒颗粒（RVPs）以及通常无法被感染的K562细胞。RVPs是结构完整但不具备复制能力的登革病毒颗粒，其携带一个亚基因组的绿色荧光蛋白（GFP）复制子，在经历一轮复制后表达GFP3。因此，被RVPs感染的细胞会发出绿色荧光，可通过流式细胞术或显微镜轻松检测。本实验中使用的RVPs来自商业来源，但也可针对其他病毒制备，并应用于本文所述的实验方案中。与此同时，K562细胞是一种表达FcγIII受体的白血病细胞系，能够结合抗体的Fc区域，并在亚中和浓度抗体存在的情况下被感染4,5。
ADE 实验已被广泛用于研究重症登革热的危险因素，并阐明其作用机制 体外 ADE6,7,8此处描述的 ADE 检测方法可快速、简便地用于测定血清增强病毒感染的能力 体外 使用RVPs和流式细胞术进行感染检测，相较于目前常用的其他检测方法（如在Vero细胞中测定空斑形成单位（pfu）或对感染细胞进行抗体染色）具有优势6,7,8,9,10,11，这两种方法均耗时且劳动强度大。

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>RPMI-10 中含 10% FBS</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>RPMI-10 中含 100 IU 青霉素/mL，100 µg 链霉素/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>RPMI-10 中含 0.025 M</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100&amp;times;）</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>RPMI-10 中使用 1×</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>RPMI-10 中含 1 mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>无菌 V 型底板</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 聚丙烯 5 mL FACS 管</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>非无菌 U 型底板</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>FACS 管的高通量替代方案</td></tr><tr><td>5 mL 无菌刻度移液管</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200 µL 无菌移液器吸头</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20 µL 无菌移液器吸头</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50–200 µL 多通道移液器</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5–50 µL 多通道移液器</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% 甲醛</td><td>Tousimis</td><td>&amp;nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>用于热灭活的水浴锅替代设备</td></tr><tr><td>CO₂ 培养箱</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>液体漂白剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>流式细胞术分析软件</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 流式细胞仪</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体漂白剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

抗体依赖性感染增强作用已被证实在中国台湾登革病毒感染致病过程中发挥重要作用。传统检测方法通过检测抗体或血清在非许可性细胞系中增强感染的能力，依赖于培养基中病毒释放量的测定，随后采用蚀斑实验对感染进行定量。近年来，这些检测方法已转为使用荧光标记抗体来检测登革病毒（DENV）在细胞系中的感染情况。然而，上述两种方法均存在局限性，限制了这些技术的广泛应用。本文中，我们描述了一种简便的 体外 使用表达绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）和K562细胞检测抗体依赖性增强（ADE）的实验方法，血清来源于感染寨卡病毒（ZIKV）16周后的恒河猴。该方法可靠，细胞操作步骤少，无需使用具有复制能力的活病毒，可采用高通量形式进行，并通过流式细胞术获得定量结果。此外，当相应RVPs可用时，该方法可轻松扩展用于检测其他黄病毒属感染（如黄热病毒（YFV）、日本马脑炎病毒（JEEV）、西尼罗病毒（WNV）等）的抗体依赖性增强（ADE）效应。由于实验操作简便、数据分析与结果解读容易，该方法适用于大多数实验室条件。

采集4只恒河猴在感染寨卡病毒（ZIKV）后16周的血清，检测其对登革病毒1、2、3和4型在K562细胞中感染的增强潜力。这些动物在感染后第3天达到病毒血症峰值，血浆中ZIKV RNA拷贝数约为1 × 105 拷贝/mL，随后病毒载量下降，在感染后7天已低于检测限。在感染后16周时，血浆中未检测到病毒血症。随后按照上述方案进行RVP检测并对收集的数据进行分析。
用于鉴定GFP+细胞的设门策略如图1所示。首先根据FSC-A与FSC-H的关系设定初始门，以排除自发荧光双联体，并仅纳入单细胞。下一个图仅显示来自单细胞门的细胞；在此图中，根据SSC-A与FSC-A的关系设定门，以排除任何自发荧光碎片。这些设门后的细胞随后在第三个图中基于SSC-A与FL1-A的关系进行展示，以鉴定GFP+细胞。被RVP感染的细胞表达GFP，通过围绕这些细胞设定门来确定GFP+细胞的百分比。在寨卡病毒...

我们介绍一种简单易行的实验方案，利用登革病毒报告病毒颗粒，通过寨卡病毒感染恢复期血清来检测抗体依赖性增强感染效应。

感染的抗体依赖性增强作用已被证明在登革病毒致病机制中发挥重要作用。用于测量该能力的传统检测方法……

本实验的总体目标是确定从感染寨卡病毒的恒河猴血清中收集的血清在体外介导登革病毒抗体依赖性增强感染的能力。该方法有助于解答由寨卡病毒诱导产生的交叉反应性抗体所引起的登革病毒感染抗体依赖性增强相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于通量高、操作简单且易于实施。本实验操作将由我实验室的新兴传染病学研究生 William Valiant 演示。首先在室温下解冻血清样本。解冻后，将每份血清样本各 100 µL 转移至无菌管中，并在 56 °C 下加热活化 30 分钟。接下来，用冷的RPMI 10培养基对血清样本进行10倍系列稀释，稀释比例从1:1至1:1000。然后将每种稀释后的血清样本各10 µL转移至无菌96孔V型底板的孔中。接着，在37°C水浴中解冻登革病毒1型、2型、3型和4型的报告病毒颗粒（RVP），确保每种RVP每份血清样本的体积约为170 µL。解冻后，立即将RVP管转移至冰上。然后用移液器吸取10微升RVP加入含血清样本稀释液的孔中，以及不含血清的对照孔中。通过上下吹打5到10次充分混匀。将96孔V型底板转移至培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。在96孔V型底板孵育的同时，用70%乙醇清洁生物安全柜表面，并开启紫外灯照射15分钟。随后从培养箱中取出一个完全融合的T-75培养瓶，内含K562细胞。使用无菌的5毫米移液管充分混匀细胞，取5毫升转移至无菌的15毫升锥形管中。接着，从管中取出10微升细胞，与10微升台盼蓝混合后加载到血细胞计数板中。计数细胞并计算细胞总数。将细胞在 1200 × g 条件下离心 10 分钟后，倒出上清液，并将细胞重悬于预热的 RPMI 10 培养基中，细胞浓度为每 30 微升培养基含 8 万个细胞。从培养箱中取出 96 孔 V 型底板后，向每孔加入 30 微升 K562 细胞悬液，并用移液器上下吹打 5 至 10 次，充分混匀。然后将培养板放回培养箱中孵育1小时。孵育结束后，在1200 × g条件下离心培养板5分钟。离心后，将培养板倒置放入含有10%次氯酸钠溶液的容器中，弃去各孔中的培养基。然后用125微升预热的RPMI 10培养基重悬每个孔中的细胞，按前述方法离心进行洗涤。最后一次洗涤结束后，弃去上清液，向每孔加入100微升预热的RPMI 10培养基。用移液器轻轻吹打混匀，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。两天后，从培养箱中取出培养板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器混匀每孔中的内容物，并转移至96孔U型底培养板中。用100 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液冲洗96孔V型底培养板的每个孔，将残留的细胞和PBS转移至96孔U型底培养板对应的孔中。使用多通道移液器充分混匀。用铝箔包裹酶标板，置于培养箱中孵育30分钟以固定细胞。通过运行未染色的K562细胞，使用乙基通道（ethyl-one channel）对GFP荧光进行校准，调节流式细胞仪的侧向散射和前向散射参数。然后从每个样本中获取 30,000 至 50,000 个细胞。使用流式细胞术分析软件，根据前向散射面积（forward scatter area）与前向散射高度（forward scatter height）设置第一个门控，以纳入单细胞并排除自发荧光的双联体（dublets）进入分析。计算每种条件下 GFP 阳性细胞的平均百分比，然后计算每种血清稀释度的感染增强倍数。以 y 轴表示折叠增强倍数，x 轴表示稀释倍数，并采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行 Tukey 多重比较事后检验。此处显示的是使用登革热病毒 1 型报告病毒颗粒的代表性动物实验数据。无血清对照样本中 GFP 阳性细胞百分比为 0.253%；未稀释血清样本中 GFP 阳性细胞百分比为 2.58%。GFP阳性细胞的比例在血清1:10稀释时达到最高，为12.8%，在1:100稀释时降至0.735%，在1:1,000稀释时为0.022%。针对四种登革病毒血清型检测了抗体依赖性增强感染效应。数据显示，感染后16周采集的血清在1:10稀释条件下，可显著增强所有四种登革病毒血清型对K562细胞的感染。一旦掌握，若操作得当，该技术可在48小时内完成。在进行此实验时，需注意在30分钟的最终固定步骤完成后，应在一至两小时内完成数据采集。切勿忘记，处理感染性血清具有极高的危险性，在执行该实验过程中，必须始终采取适当的防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）并遵循生物安全二级（BSL2）实验室的操作规范。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于流式细胞仪的 Zika 病毒疗养血清测定登革热病毒的体外抗体依赖性

来源：Asad, S., 等. 在原代人细胞中对寨卡病毒的抗体依赖性增强作用进行定量分析. J. Vis. Exp.

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基于细胞的电学阻抗平台实时评估寨卡病毒抑制剂

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一种基于流式细胞术的简易检测方法体外利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

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