一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

本实验的总体目标是确定从感染寨卡病毒的恒河猴血清中收集的血清在体外介导登革病毒抗体依赖性增强感染的能力。该方法有助于解答由寨卡病毒诱导产生的交叉反应性抗体所引起的登革病毒感染抗体依赖性增强相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于通量高、操作简单且易于实施。

本实验操作将由我实验室的新兴传染病学研究生 William Valiant 演示。首先在室温下解冻血清样本。解冻后，将每份血清样本各 100 µL 转移至无菌管中，并在 56 °C 下加热活化 30 分钟。

接下来，用冷的RPMI 10培养基对血清样本进行10倍系列稀释，稀释比例从1:1至1:1000。然后将每种稀释后的血清样本各10 µL转移至无菌96孔V型底板的孔中。接着，在37°C水浴中解冻登革病毒1型、2型、3型和4型的报告病毒颗粒（RVP），确保每种RVP每份血清样本的体积约为170 µL。

解冻后，立即将RVP管转移至冰上。然后用移液器吸取10微升RVP加入含血清样本稀释液的孔中，以及不含血清的对照孔中。通过上下吹打5到10次充分混匀。

将96孔V型底板转移至培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。在96孔V型底板孵育的同时，用70%乙醇清洁生物安全柜表面，并开启紫外灯照射15分钟。随后从培养箱中取出一个完全融合的T-75培养瓶，内含K562细胞。

使用无菌的5毫米移液管充分混匀细胞，取5毫升转移至无菌的15毫升锥形管中。接着，从管中取出10微升细胞，与10微升台盼蓝混合后加载到血细胞计数板中。计数细胞并计算细胞总数。

将细胞在 1200 × g 条件下离心 10 分钟后，倒出上清液，并将细胞重悬于预热的 RPMI 10 培养基中，细胞浓度为每 30 微升培养基含 8 万个细胞。从培养箱中取出 96 孔 V 型底板后，向每孔加入 30 微升 K562 细胞悬液，并用移液器上下吹打 5 至 10 次，充分混匀。

然后将培养板放回培养箱中孵育1小时。孵育结束后，在1200 × g条件下离心培养板5分钟。离心后，将培养板倒置放入含有10%次氯酸钠溶液的容器中，弃去各孔中的培养基。

然后用125微升预热的RPMI 10培养基重悬每个孔中的细胞，按前述方法离心进行洗涤。最后一次洗涤结束后，弃去上清液，向每孔加入100微升预热的RPMI 10培养基。用移液器轻轻吹打混匀，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。

两天后，从培养箱中取出培养板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器混匀每孔中的内容物，并转移至96孔U型底培养板中。用100 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液冲洗96孔V型底培养板的每个孔，将残留的细胞和PBS转移至96孔U型底培养板对应的孔中。

使用多通道移液器充分混匀。用铝箔包裹酶标板，置于培养箱中孵育30分钟以固定细胞。通过运行未染色的K562细胞，使用乙基通道（ethyl-one channel）对GFP荧光进行校准，调节流式细胞仪的侧向散射和前向散射参数。

然后从每个样本中获取 30,000 至 50,000 个细胞。使用流式细胞术分析软件，根据前向散射面积（forward scatter area）与前向散射高度（forward scatter height）设置第一个门控，以纳入单细胞并排除自发荧光的双联体（dublets）进入分析。计算每种条件下 GFP 阳性细胞的平均百分比，然后计算每种血清稀释度的感染增强倍数。

以 y 轴表示折叠增强倍数，x 轴表示稀释倍数，并采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行 Tukey 多重比较事后检验。此处显示的是使用登革热病毒 1 型报告病毒颗粒的代表性动物实验数据。无血清对照样本中 GFP 阳性细胞百分比为 0.253%；未稀释血清样本中 GFP 阳性细胞百分比为 2.58%。

GFP阳性细胞的比例在血清1:10稀释时达到最高，为12.8%，在1:100稀释时降至0.735%，在1:1,000稀释时为0.022%。针对四种登革病毒血清型检测了抗体依赖性增强感染效应。数据显示，感染后16周采集的血清在1:10稀释条件下，可显著增强所有四种登革病毒血清型对K562细胞的感染。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在48小时内完成。在进行此实验时，需注意在30分钟的最终固定步骤完成后，应在一至两小时内完成数据采集。切勿忘记，处理感染性血清具有极高的危险性，在执行该实验过程中，必须始终采取适当的防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）并遵循生物安全二级（BSL2）实验室的操作规范。