高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

本视频展示了我们在角膜上皮细胞毒性损伤模型中进行高通量siRNA筛选的方法。这项工作具有重要意义，因为高通量siRNA筛选是一种经济高效且省时的方法，可用于阐明细胞对毒性物质反应的通路和调控因子。该研究可能有助于进一步理解角膜如何应对毒性物质的侵害。

在一次性培养基瓶中，用预热的含有0.5微克/毫升氢化可的松的培养基制备角膜上皮细胞悬液。轻轻旋转瓶子使细胞均匀悬浮，然后倒入自动液体处理仪的轨道摇床巢中的储液槽内。在细胞接种过程中，将细胞悬液置于37摄氏度的加热板上保温。

使用自动化液体处理仪，在96孔板中每孔加入70微升培养基，接种密度为每孔一千个细胞。针对每块待研究的siRNA文库板，至少需接种14块96孔板。在接种过程中，持续以每分钟100个循环的速度运行轨道摇床，并在所有步骤中使用每秒50微升的移液速度。

在接种第一块培养板之前，使用自动液体处理仪混匀细胞悬液。吸取140微升细胞悬液，向两块细胞培养板的每孔中各分配70微升。重复混匀和分配操作，直至所有培养板均完成细胞接种。

根据需要补充细胞悬液储液槽。培养板加样完成后，将其从液体处理仪中取出，在室温下孵育30分钟，随后转移至细胞培养箱中。

次日早晨使用位于细胞培养孵育箱内的自动成像系统评估所有培养板的细胞密度。排除培养板内孔中细胞融合度不在15%至22%范围内的实验组。接种细胞24小时后，按如下方法进行转染：每孔加入4皮摩尔的siRNA和0.3微升的转染试剂。

从供应商处获取siRNA文库板，配置为每板包含80个siRNA靶点，第一列和第十二列留空。根据生产商说明书，用siRNA缓冲液重新配制siRNA文库板，使每孔siRNA的终浓度为每微升2皮摩尔。所有转染操作均使用自动化液体处理仪，并在所有步骤中采用每秒25微升的移液速度。

使用预设的加样提示框，仅对需要转染的孔进行操作。使用文库板的上半部分转染一组六块复制板，称为“上板组”；使用文库板的下半部分转染另一组六块复制板，称为“下板组”。这十二块板共同构成一个完整的板组，每块细胞板均包含相同的对照组。在所有上板组和下板组均完成文库siRNA转染后，对所有板的B2至B6孔转染阴性对照池siRNA。

另取两块未加入文库siRNA的培养板，将其中B2至B6孔转染阴性对照siRNA混合物，作为未暴露对照组。所有细胞培养板在加入转染混合物后，于细胞培养箱中孵育4小时，每隔1小时轻轻敲击培养板混匀。

使用自动化液体处理仪，用预热的培养基（按1:5比例用PBS稀释）将孔板洗涤两次，并以每孔100 µL预热培养基重新加样。所有步骤均采用每秒50 µL的移液速度。将C2至C6孔用作未转染对照。

将B7至B11以及C7至C11的孔保持未转染状态，用作毒性物质暴露实验中的药物和溶剂对照。转染后24小时，使用自动化液体处理仪重新换液。所有步骤中，移液速度均设为每秒50微升。

从每个孔中吸出 100 微升液体，并弃入废液槽中。每孔加入 100 微升预热的 H-Cort. 培养基进行换液。根据需要清空废液槽。

根据需要向储液槽中补充培养基。转染后两天，在暴露前两小时，用H-Cort.培养基配制62.5微摩尔的阳性对照卡达明（Cardamonin）溶液，并加入8排稀释储液槽的B行。

在H-Cort.培养基中配制06.25%的DMSO溶液，并加入同一储液槽的C行。DMSO用作溶剂对照。

使用自动化液体处理仪从每块细胞培养板的B7至B11和C7至C11孔中移除10微升培养基，并将其弃至储液板的G行和H行。务必使用预配置的吸头盒，仅处理将要加入阳性对照和载体对照的孔，并在所有步骤中采用每秒50微升的移液速度。向这些孔中转移10微升的阳性对照和载体对照，并混合三次。

将这些细胞板放回培养箱。对所有其他细胞板重复上述步骤。所有化学暴露操作均须在化学通风橱中进行，并佩戴双层腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。

将接触过氢氟酸的移液器吸头和储液槽，以及任何液态氢氟酸，在排入危险废物处理系统前，均使用2.5%葡萄糖酸钙进行去污处理。针对每一块待检测的文库板，在150毫升瓶中，向80毫升预热的H-Cort.培养基中加入288微升1%氢氟酸，配制0.0036%氢氟酸培养液。

轻轻旋转瓶子，将稀释的氢氟酸置于化学通风橱内的37度培养箱中孵育10分钟。将氢氟酸培养基溶液加入到置于板式加热器上的试剂储液槽中。由两名技术人员协同操作完成暴露步骤。

让右侧的技术人员使用十二通道移液器从细胞培养板中移除培养基，然后将培养板传递给左侧的技术人员。让左侧的技术人员向每孔加入 100 µL 氢氟酸培养基溶液。对所有需要暴露于毒物的细胞培养板重复此操作。

同时，对未暴露的对照组培养皿重复此过程，使用新鲜培养基代替氢氟酸溶液。将培养皿置于化学通风橱内的培养箱中孵育20分钟，然后放回细胞培养箱中。当所有培养皿完成暴露并返回细胞培养箱后，重复之前所示的阳性对照添加步骤。

收集细胞培养上清液，并在暴露后24小时使用MTT法检测细胞活力。配制含有10克/升葡萄糖的PBS溶液，其中加入0.5毫克/毫升的MTT底物，并预热至37度。将MTT底物溶液加入自动液体处理系统的储液槽中。

所有步骤均使用每秒 50 微升的移液速度。预先配置吸头盒，仅对应需要检测的孔位。使用自动化液体处理设备从细胞板内侧 60 个孔中吸取 95 微升培养基，并将 42.5 微升分别加入两个 384 孔储存板中的对应孔位。

立即向细胞培养板的每孔中加入 100 微升 MTT 底物溶液，并在 37 度的细胞培养箱中孵育一小时。密封 384 孔储存板，并于 -80 度保存以用于后续分析。对所有顶部和底部板组及其相应的未暴露对照组重复此过程。

根据需要补充 MTT 底物储液。若需在重复样本间重复使用吸头，可在添加 MTT 底物溶液以及在不同培养板组之间切换时进行清洗。在 1 小时孵育后，使用自动化液体处理仪从每块细胞培养板的内侧 60 个孔中移除 MTT 底物溶液，并向每个孔中加入 100 微升 DMSO。

所有步骤均使用每秒50微升的移液速度，并预先配置吸头盒，仅针对需要检测的孔进行操作。根据需要清空废液储槽并重新填充DMSO储槽。将板在板式振荡器上振荡三分钟。

使用酶标仪在570纳米和690纳米处测定吸光度。将570纳米处的吸光度减去690纳米处的背景吸光度，然后计算未暴露组中每个对照组的吸光度平均值。通过将每个处理组的吸光度值除以未暴露对照组的平均吸光度值，计算细胞存活率百分比。

使用平均未暴露的阴性对照组来计算所有靶标的细胞活力百分比。根据生产商说明书，采用无需洗涤的基于微珠的检测方法测定细胞培养上清液中IL-8的浓度。设计检测板布局以容纳样本和标准品。

从-80℃冰箱中取出384孔储存板，在室温下解冻。短暂离心以使样品沉降至孔底。向黑色384孔储存板中加入抗IL-8受体珠和生物素化抗体。

根据检测板布局，将磁珠-抗体混合物加入指定用于样品和标准曲线的孔中。在含有354 µM氯化钠的培养基中重悬标准品。对标准品进行两倍系列稀释，并以三复孔形式加入另一黑色384孔储存板中。

使用自动化液体处理仪进行检测。根据检测板布局，使用预配置的吸头盒对孔位进行加样。所有步骤的移液速度为每秒50微升。

将8微升受体珠-抗体混合物转移至白色384孔浅孔检测板中。根据检测板布局，将珠-抗体混合物加入指定用于样品和标准曲线的孔中。随后，将标准曲线样品加入浅孔检测板上的相应孔中。

接下来，在浅层储液槽中配制3.54摩尔的氯化钠溶液。通过向黑色384孔储存板中的样品加入4.5微升氯化钠溶液，调节样品的盐浓度，使其与标准曲线的浓度一致。使用30微升的混匀体积将样品重复混匀三次，然后根据检测板布局，将2微升样品转移至白色浅孔检测板中。

室温避光孵育1小时。将二抗磁珠加入黑色384孔储存板中。根据检测板布局，将磁珠加入指定用于样品和标准曲线的孔中。

根据检测板布局，将10微升的二抗磁珠转移至白色384孔浅孔检测板中用于标准曲线或样品的各孔中。每次移液后需在不同板之间更换吸头。室温避光再孵育一小时。

使用透明板封膜将检测板密封，并使用与基于微球的检测兼容的酶标仪进行扫描。扫描时，设置板与检测器之间的距离为0.2毫米，激发时间为180毫秒，检测时间为550毫秒。将IL-8检测的原始数据导入电子表格中。

使用自动曲线拟合方法对IL-8检测的标准曲线进行拟合，然后将每个样本的原始数据转换为每毫升皮克（pg/mL）。计算每个目标样本六个重复的平均值，随后计算相对于暴露阴性对照的SSMD值和倍数变化。

使用双荧光棒图显示每个靶标的数据，其中x轴表示倍数变化，y轴表示严格稳健的Z值（SSMD）。综上所述，我们已开发出适用于毒物引起眼部损伤的高通量筛选研究的方法和培养条件，并通过在氢氟酸损伤模型中完成siRNA文库的初筛，验证了这些方法的有效性。

高通量基因组数据集可极大促进对特定基因在损伤或疾病中所起作用的理解，从而有助于更高效地开展后续的体外或体内研究。