高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

该方法有助于解答结肠癌患者肿瘤生物学领域中有关微转移灶的关键问题。此技术的主要优势在于，它能够利用小鼠体内经GFP标记的患者来源结肠癌类器官诱导产生的微转移灶，实现高灵敏度检测。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为在小鼠远端器官中检测源自结肠肿瘤类器官的微转移灶具有较大挑战性。

本实验操作将由我团队中的博士生兼外科医生水越浩介和小山优共同示范，与冈崎优一起完成。为了生成人结直肠癌细胞类器官，首先在冰上向12孔板的每个孔中加入150 µL人工细胞外基质。当所有孔均完成包被后，将培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育30至60分钟，以使凝胶充分固化。

接下来，将来源于患者的肿瘤异种移植细胞沉淀重悬于新鲜的结直肠癌类器官培养基中，培养基中添加5%胎牛血清（FCS），调整细胞浓度至每毫升3 × 10⁵个细胞，并将1毫升细胞悬液接种至每份人工细胞外基质中。然后，将细胞放回细胞培养孵箱中。次日早晨，小心地将培养上清液（包括悬浮细胞）转移至1.5毫升微量离心管中进行离心，再将沉淀物重悬于70微升预冷的新鲜人工细胞外基质中，置于冰上。

为了提高结直肠癌细胞的存活率，将含有悬浮肿瘤细胞的人工细胞外基质重新覆盖到已包被人工细胞外基质的孔板上，并将肿瘤细胞培养物置于细胞培养箱中孵育30分钟。当新形成的细胞外基质凝胶完全凝固后，向培养物中加入1毫升新鲜的结直肠癌类器官细胞培养基（添加1% FCS），然后将细胞放回细胞培养箱中继续培养。培养7至10天后，使用无菌细胞刮棒机械性分离类器官，并将类器官转移至1.5毫升微量离心管中进行离心处理。

然后，用轻柔敲击的方式将沉淀重悬于500 µL PBS中，进行下一次离心。为解离结直肠癌类器官，向各管中加入500 µL蛋白酶和胶原酶消化液，并通过轻柔敲击混匀。室温孵育10分钟后，向细胞中加入500 µL添加了1% FBS的培养基，并用移液器非常轻柔地反复吹打数次，以分散类器官。

在处理过程中轻柔吹打人源结直肠癌类器官，对于维持其在培养中完整的球状结构至关重要。再次离心细胞，并将沉淀重悬于100 µL 5X GFP慢病毒原液和400 µL新鲜的结直肠癌类器官培养基中。使用高滴度的GFP慢病毒感染人源结直肠癌类器官至关重要，尤其是为了实现接近100%的类器官感染率。

调整每管体积，使细胞浓度达到每500微升培养基含5×10⁵个解离的肿瘤细胞，并如图所示将500微升细胞悬液接种至预先包被人工细胞外基质的12孔板中各孔。细胞在培养箱中培养18小时后，将含有悬浮细胞的上清液分别转移至1.5毫升微量离心管中，离心后弃上清，每管用70微升人工细胞外基质在冰上重悬沉淀。为提高结直肠癌细胞的存活率，将含肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖于12孔板中的肿瘤类器官上，然后将培养板置于细胞培养箱中孵育30分钟。

当人工细胞外基质包被凝固后，加入一毫升添加了1% FCS的新鲜结直肠癌类器官培养基对类器官进行培养，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养三天。随后，通过荧光显微镜观察感染细胞，确认其GFP阳性率接近100%，然后将细胞再次放回培养箱中继续培养四至六天。为了建立结直肠癌患者来源肿瘤异种移植的自发性转移小鼠模型，按照前述方法将GFP标记的类器官解离，并将单细胞肿瘤悬液稀释至每50微升磷酸盐缓冲液（PBS）中含有5 × 10⁵个肿瘤细胞，且缓冲液中含50%人工细胞外基质浓度。

将每只小鼠50微升细胞加入配备22号针头的注射器中，并将肿瘤细胞置于冰上。接着，确认小鼠对脚趾夹捏无反应，将第一只麻醉后的NOG小鼠仰卧置于实验台面上。使用无菌镊子轻轻将直肠黏膜从肛门拉出，立即向直肠黏膜下层注射肿瘤细胞。

为建立结直肠癌患者来源肿瘤异种移植的实验性转移模型，将单细胞悬液稀释至每50微升含4×10⁴个细胞的浓度，并将每只小鼠50微升细胞悬液装入配备22号针头的注射器中。将首只麻醉后的NOG小鼠俯卧置于实验台，于左侧腹下部做一小切口。使用无菌剪刀和镊子小心剪开腹膜并暴露脾脏，再用镊子夹住附着在脾脏上的脂肪组织。

然后，缓慢向脾脏内注射 50 µL 肿瘤细胞悬液，注意观察，确保无渗漏。所有小鼠完成注射并根据需要进行缝合后，将动物放回其原饲养笼中，并在肿瘤细胞接种后一天检查缝合处是否渗漏以及动物存活情况。每周使用游标卡尺测量肿瘤体积，并在达到适当的实验终点时，处死动物并收获原位肿瘤及相关组织。

将解剖获得的肿瘤和器官转移至置于冰上的10厘米培养皿中含5毫升预冷PBS的溶液内，在体视荧光显微镜下观察解剖组织，以评估其GFP表达情况。如所示，利用GFP慢病毒对结直肠癌类器官进行感染，可使几乎所有类器官均表达强烈的GFP荧光。将标记GFP的类器官原位移植或脾内注射至继代受体NOG小鼠体内，于注射后2.5个月对小鼠进行检测，结果显示在原位部位以及多数小鼠的肺组织中均形成了GFP阳性的原发性肿瘤。

此外，在脾内注射后一个月，可在受体NOG动物中观察到肝转移灶。观看本视频后，您应能够充分掌握如何检测GFP标记的人源结直肠癌细胞类器官在移植入受体小鼠后所形成的微转移灶。在进行该实验操作时，需牢记人源结肠癌细胞类器官在小鼠体内的成瘤及转移归巢效率，在很大程度上取决于原始肿瘤细胞的患者间异质性。