Name: 淋巴结慢病毒北疆-转基因 Organoids 培养的大鼠结肠肿瘤的高灵敏度检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解利用GFP慢病毒转导患者来源结直肠癌类器官的方法，实现小鼠体内微转移灶的高灵敏度检测。该技术有助于深入研究结直肠癌肿瘤生物学机制。

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本研究得到了顺天堂大学青年研究者奖（2013年、2014年和2015年）对Y.O.的资助，联合项目奖（2013年和2014年）对K.M.的资助，以及日本文部科学省科学研究费补助金（16K15625资助Y.K.，16K15598资助M.G.）。我们特别感谢结直肠外科与分子病理学系全体成员在讨论和实验技术方面提供的宝贵支持。我们还感谢近野博幸博士（滨松医科大学）、北岛英树博士（国际医疗福祉大学）在小鼠原位移植手术方面提供的慷慨技术指导，以及日野良贤博士（千叶癌症中心）在肿瘤类器官培养技术方面给予的技术建议。

患者提供了书面知情同意书，且本项目已获得顺天堂大学医学院研究伦理委员会的批准。小鼠实验也已获得顺天堂大学医学院动物研究伦理委员会的批准。
1. 在免疫缺陷小鼠中建立结直肠癌PDX模型
建立结直肠癌PDX模型的实验步骤（步骤1）如图1A所示。
<ol>
	<li>在患者肿瘤手术切除后立即处理原发性结直肠癌组织。</li>
	<li>在50 mL锥形管中，用30 mL冰上预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡洗涤原代结直肠癌组织数次，并将组织置于冰上保存。</li>
	<li>使用无菌镊子将组织置于10 cm培养皿中，用无菌剪刀尽可能彻底地去除坏死区域，并将实体瘤组织剪切成小块（5 × 5 × 5 mm）3 使用无菌剃须刀片按尺寸切割。 
	注意：坏死区域通常比周围区域更白、更软且更易碎。</li>
	<li>使用无菌镊子将肿瘤小块置于6孔板中2 mL冰预冷的无菌PBS中。</li>
	<li>在无菌条件下饲养6周龄NOD/Shi-scid IL2Rγ null（NOG）重度免疫缺陷小鼠-无特定病原体-无菌条件</li>
	<li>使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。确保呼吸频率和深度正常，且无趾夹反射，以确认麻醉效果充分。可选择在眼睛上涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>使用干热灭菌法对所有手术器械进行灭菌，随后在所有操作中使用这些器械，以防止受体小鼠伤口感染。</li>
	<li>将麻醉的小鼠俯卧位放置于实验台面上。使用无菌剪刀在受体小鼠左右侧下腹部做小切口，以创建皮下 pockets 用于组织移植。注意避免刺破腹膜。该操作应几乎无出血。</li>
	<li>将上述制备好的肿瘤碎片轻轻浸入50 µL人工细胞外基质中，然后植入左右皮下袋的下部区域。</li>
	<li>使用伤口夹对接受手术的小鼠切口进行缝合。确保植入的肿瘤组织位于皮下，且与切口保持一定距离。 
	注意：根据减少手术操作的原则，本研究未给予术后疼痛和感染的治疗措施。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，并保持仰卧位，直至意识充分恢复。待小鼠完全苏醒并能够用四肢站立坐起后，可将其放回原有饲养笼。为防止捕食行为发生，禁止与未手术动物同笼饲养和繁殖。</li>
	<li>术后次日检查手术组小鼠缝合处是否有渗漏，并确认小鼠处于稳定状态。此后每周检查小鼠有无疾病症状，并使用游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤大小。</li>
</ol>
2. 小鼠中结直肠癌PDX模型的解剖
结直肠癌PDX模型解剖的实验步骤（步骤2）如图1B所示。
<ol>
	<li>让肿瘤在皮下生长至约 1 cm3 大小，通常需要大约 1–3 个月。</li>
	<li>使用小动物吸入麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用 70% 乙醇对皮肤进行消毒。</li>
	<li>将小鼠俯卧位放置于实验台上。切开皮肤，暴露肿瘤，并使用无菌剪刀小心地将皮肤与肿瘤分离。切除肿瘤后，将其置于一个 10 cm 的培养皿中，去除肿瘤中明显坏死的区域，然后用 5 mL PBS 冲洗两次。 
	注意：坏死区域通常比周围组织颜色更白、质地更软、更易碎。</li>
	<li>将肿瘤置于冰上，并将其均等地分为至少 4 部分，用于不同用途，包括 1）结直肠癌类器官培养，2）移植至继代小鼠，3）组织学检查，以及 4）肿瘤组织碎片的冷冻保存。
	<ol>
		<li>为建立结直肠癌类器官，将实体肿瘤组织置于含有 1 mL 无菌 PBS 的 6 cm 培养皿中。处理前（步骤 3）保持组织处于冰上。</li>
		<li>为建立人源结直肠癌 PDX 模型，将新鲜的结直肠癌 PDX 组织传代至继代小鼠。使用无菌刀片将肿瘤组织切成小块（大小为 5 x 5 x 5 mm3），并将这些组织碎片轻轻浸入 50 µL 人工细胞外基质中。然后，按照步骤 1.8–1.11 所述方法，将这些碎片植入 NOG 小鼠左右侧皮下袋的下部。</li>
		<li>用于组织学分析时，将样本置于含有 5 mL 10% 中性缓冲福尔马林的 15 mL 离心管中，在室温下固定 2 天。</li>
		<li>用于冷冻保存时，将肿瘤组织切成小块（大小为 5 x 5 x 5 mm3），并将样本轻轻浸入 1–1.5 mL 冻存管中的 500 µL 细胞冻存液中。然后，将冻存管转移至 -80 °C 冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于结直肠癌类器官培养的PDX组织解离为单细胞悬液
结直肠癌PDX模型解离的实验步骤（步骤3）详见图1B。
<ol>
	<li>将上述（步骤 2.4.1）制备的肿瘤组织碎片置于一个 10 cm 的培养皿中。</li>
	<li>使用无菌剃刀片将组织碎片切碎，并转移至含有 8 mL 含 10% 胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和 80 µL 胶原酶酶原液（见材料表）的 15 mL 锥形管中。</li>
	<li> tightly 封闭管口，并用封口膜包裹管盖以防止泄漏。为将切碎的肿瘤组织碎片解离成细胞悬液，于 37 °C 轻柔振荡 2 小时。注意：此时管内仍会残留大量未消化的组织碎片。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 10 mL 含 10% FCS 的 DMEM 重悬细胞沉淀，制成细胞悬液。</li>
	<li>为去除未消化的组织碎片，将细胞悬液通过置于 50 mL 锥形管上的 40 µm 细胞筛过滤两次。随后将滤过液在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 在人工细胞外基质上培养的结直肠癌类器官的生成
结肠PDX来源的结直肠癌类器官培养实验步骤（步骤4）详见图1B。
<ol>
	<li>使用先前描述的人类结肠类器官培养基11，配制适用于PDX来源的结直肠癌（CRC）类器官的培养基（参见材料表中的“CRC类器官培养基”）。</li>
	<li>在冰上向12孔板的每个孔中加入150 µL人工细胞外基质（参见材料表），然后在37 °C、5% CO2培养箱中孵育30–60分钟，使凝胶固化。</li>
	<li>将步骤3.5获得的细胞沉淀用CRC类器官培养基（来自步骤4.1）重悬，并添加5%胎牛血清（FCS），调整细胞密度至3 × 105 个细胞/mL。随后，将1 mL细胞悬液接种至步骤4.2中已包被人工细胞外基质的培养板中，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数，包括单个细胞和多细胞簇（即黏附成团的细胞）。 
	注意：本研究中使用5% FCS以淬灭胶原酶的残余酶活性。</li>
	<li>次日，小心收集培养基，包括从人工细胞外基质包被的孔板上脱落的漂浮细胞，转移至1.5 mL离心管中，在1,400 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在冰上用70 µL人工细胞外基质重悬。</li>
	<li>为提高CRC细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖于已贴附在人工细胞外基质包被孔板上的肿瘤类器官细胞上，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，使人工细胞外基质涂层固化。随后，加入1 mL含1% FCS的CRC类器官细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养。</li>
	<li>每两天更换一次培养基。当CRC类器官在培养基中大量增殖时，可能需要每天更换培养基。</li>
</ol>
5. GFP 慢病毒颗粒的产生与富集
生成和富集GFP慢病毒颗粒的实验步骤（步骤5）如图1C所示。
<ol>
	<li>使用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基培养HEK293T细胞 准备六个10 cm培养皿（2 x 106 每皿细胞数）用于后续转染实验。</li>
	<li>每皿转染时，配制500 µL混合液，其中包含20 µL转染试剂、DMEM培养基和PRRL-GFP质粒（5 µg）12 以及两种慢病毒包装质粒，例如 pCMV-VSV-G（1 µg）和 pCMV-dR8.2 dvpr（5 µg），加入无菌的 1.5 mL 微量离心管中。室温静置 20 分钟，然后将混合物覆盖至各 10 cm 培养皿中，孵育 18 小时。</li>
	<li>吸除培养基，每皿加入 5 mL 新鲜的含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基，静置培养 24 h。</li>
	<li>将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，总共保存30 mL培养基于4 °C过夜。向每皿中加入5 mL新鲜RPMI 1640培养基，静置24 h。</li>
	<li>将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，总共保留30 mL培养基置于冰上。随后弃去细胞。</li>
	<li>将步骤5.4–5.5中获得的培养基60 mL通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞，并将滤液分装至十二个5 mL聚丙烯离心管中，用于超速离心。</li>
	<li>为浓缩病毒，使用水平转子离心机进行离心（参见 材料表) 在 85,327 x g 4 °C 下孵育 1.5 小时。</li>
	<li>立即移除培养基。为溶解浓缩的病毒沉淀物，在每支十二根试管中加入250 µL不含FCS的F-12/DMEM培养基（Nutrient Ham's Mixture F-12/DMEM），并在4 °C下静置过夜。注意病毒沉淀物通常不可见。</li>
	<li>轻轻吹打培养基，总共收集 3 mL 浓缩的 5x GFP 慢病毒原液，其中可能包含带有 10 的 GFP 慢病毒颗粒8 转导单位/毫升（TU/mL）。然后将十二个1.5 mL微量离心管（每管含250 µL）在无菌条件下于-80 °C保存，可保存长达一年。制备大量原始溶液的小份分装，以避免反复冻融-冻融循环。</li>
</ol>
6. 在人工细胞外基质上培养的结直肠癌类器官细胞的GFP慢病毒颗粒标记
用GFP慢病毒标记结直肠癌类器官细胞的实验步骤（步骤6）如图1C所示。
<ol>
	<li>将第4.6步制备的结直肠癌类器官培养7–10天，期间避免干扰，然后使用无菌细胞刮刀机械收获，并转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：结直肠癌类器官在培养中的生长情况取决于患者来源肿瘤的性质。在传代前应维持类器官汇合度在60–70%，以避免过度生长，并按1:2的分割比例将其接种至新的包被有人工细胞外基质的12孔板中。</li>
	<li>以1,400 x g离心3分钟，弃去培养基，通过轻柔敲击将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中。</li>
	<li>以1,400 x g离心3分钟，弃去PBS。</li>
	<li>为解离贴壁的结直肠癌类器官，在离心管中的细胞沉淀中加入500 µL含有蛋白酶和胶原酶的细胞解离溶液，轻柔敲击混匀，然后将离心管在室温下静置10分钟。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，用额外的500 µL含1% FCS的DMEM培养基，极其轻柔地反复吹打细胞悬液，以粗略解离细胞团块。剧烈吹打以获得单细胞会显著降低细胞活力。因此，必须仅通过极其轻柔的吹打操作，使细胞悬液中仍可见一定量的细胞团块。</li>
	<li>以1,400 x g离心3分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，通过轻柔敲击将细胞沉淀重悬于100 µL 5x GFP慢病毒原液（&#62;108 TU/mL）与400 µL结直肠癌类器官培养基的混合液中，调整终浓度为每500 µL含5 x 105 个解离的肿瘤细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数（包括单个细胞和细胞团），方法如前所述（第4.3步）。</li>
	<li>按照第4.2步所述方法准备包被有人工细胞外基质的12孔板。然后将第6.7步制备的500 µL细胞悬液加入孔中，于37 °C、5% CO2条件下培养18小时。</li>
	<li>收集从包被有人工细胞外基质的培养板上脱落的漂浮细胞及其培养基，转移至1.5 mL离心管中。以1,400 x g离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于70 µL人工细胞外基质中，并置于冰上。</li>
	<li>为提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖至已贴壁于包被有人工细胞外基质的12孔板中的肿瘤类器官上，操作如第4.5步所述。随后，将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，使人工细胞外基质凝固，然后加入1 mL含1% FCS的结直肠癌类器官培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养。</li>
	<li>感染后3天，在荧光显微镜下观察细胞，确认由于使用了高滴度的慢病毒颗粒，GFP阳性率接近100%（见图2A）。</li>
	<li>将结直肠癌类器官继续培养7–10天，以扩增细胞数量，为后续注射至受体小鼠做准备。</li>
</ol>
7. 通过GFP标记的结直肠癌类器官在受体小鼠中生成转移灶
使用GFP标记的结直肠癌类器官（步骤7）生成转移灶的实验流程如图1C所示。
<ol>
	<li>为了将GFP标记的结直肠癌类器官解离为单细胞悬液，使用无菌细胞刮刀机械收获类器官，并转移至1.5 mL微量离心管中，具体操作如上文所述（步骤6.1）。</li>
	<li>将微量离心管在1,400 x g条件下离心3分钟 g，移除培养基，通过轻柔敲击将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中。</li>
	<li>将微量离心管在1,400 x g条件下离心3分钟 g 并去除 PBS。</li>
	<li>在离心管中的细胞沉淀上覆盖500 µL细胞解离溶液，轻轻敲击混匀。然后于室温静置10分钟，以酶解法解离贴壁的结直肠癌类器官，具体操作如上文所述（步骤6.4）。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，用500 µL含1% FCS的DMEM轻轻吹打细胞悬液数次，以大致解离细胞，操作如上所述（步骤6.5）。剧烈吹打结直肠癌类器官以获得单细胞会显著降低细胞活力。因此，在1.5 mL微量离心管中仅需极其轻柔地吹打，使细胞团块在细胞悬液中仍可被肉眼观察到即可。</li>
	<li>将细胞悬液在1,400 × g离心3分钟，弃去上清液。</li>
	<li>建立结直肠癌PDX自发转移小鼠模型：
	<ol>
		<li>制备含有 5 x 105 每只小鼠使用50 µL PBS悬浮细胞，其中含50%人工细胞外基质。使用前将悬浮液置于冰上保存。按照步骤4.3所述，使用血细胞计数板对癌细胞进行计数。</li>
		<li>使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒，如步骤1.6所述。</li>
		<li>将NOG小鼠仰卧置于实验台面上。用无菌镊子夹住直肠黏膜并轻轻将其拉出肛门。随后，立即注射步骤7.7.1中制备的细胞悬液。&#160;使用注射器（针头规格：22 G）将样本注入小鼠直肠黏膜下层。通常每组使用4–6只小鼠以评估实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立结直肠癌PDX的实验性转移模型：
	<ol>
		<li>制备包含 4 x 10⁵ 个细胞的结直肠癌类器官细胞悬液4 每只小鼠用 50 µL PBS 重悬细胞，使用前将细胞悬液置于冰上保存。使用血细胞计数板对癌细胞进行计数（步骤 4.3）。</li>
		<li>使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒，如步骤1.6所述。</li>
		<li>将麻醉后的NOG小鼠俯卧置于实验台面上。用无菌剪刀和镊子在左侧腹下部做一小切口，剪开腹膜，小心暴露脾脏。用无菌镊子夹住附着在脾脏上的脂肪组织，缓慢向脾脏内注射50 µL细胞悬液（按上述步骤8.1制备）。确保细胞悬液准确注入脾脏，无外漏。通常每组使用4只小鼠以评估实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术后将所有小鼠置于保温垫上，并保持胸卧位，直至意识充分恢复，具体操作如步骤1.11所述。待小鼠完全恢复后，将其放回原笼。为防止捕食行为，禁止与同笼中未手术动物进行繁殖。</li>
	<li>检查手术组小鼠次日缝合处是否有渗漏，并确认小鼠存活。每周使用游标卡尺检查所有小鼠是否有疾病迹象，并测量肿瘤大小。</li>
	<li>观察小鼠在注射后长达2.5个月内的自发性转移及1个月内的实验性转移。</li>
	<li>在指定时间点通过麻醉和颈椎脱位处死小鼠。解剖原发肿瘤及包括肝脏和肺在内的各种组织。将解剖所得的肿瘤和器官置于盛有5 mL冰浴PBS的10 cm培养皿中，并置于冰上保存。</li>
	<li>为检测GFP阳性的结直肠癌类器官细胞，在体视荧光显微镜下观察解剖后的组织。使用CCD相机采集图像，并采用标准图像处理软件进行制备。</li>
</ol>

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</ol>

作者无潜在利益冲突需披露。

尽管结直肠癌PDX模型已被广泛用于研究原发性肿瘤的生长，但该模型是否同样适用于肿瘤转移的研究，目前尚未完全阐明。在已报道的多种结肠PDX模型中，肝脏和肺部的自发性转移灶也极难检测到4,10。为了以高灵敏度检测微转移灶，我们建立了一种实验方案：在将PDX来源的结直肠癌类器官进行原位或静脉注射至受体小鼠之前，先将其转导GFP慢病毒颗粒。值得注意的是，我们证实该方法能够高灵敏度地检测到结直肠癌类器官来源的微转移灶，无论其为自发形成还是实验诱导，均可在远端器官中被发现。
实验方案中的关键步骤包括：在传代过程中轻柔吹打结直肠癌类器官，以维持其在人工细胞外基质上完整的球状结构，避免发生失巢凋亡。此外，通过超速离心浓缩制备高滴度的慢病毒颗粒，对于实现结直肠癌类器官接近100%的GFP阳性率也至关重要。 另外，建议在感染后10–14天内将GFP标记的结直肠癌类器官移植至受体小鼠体内。感染后若扩增时间过长，可能会导致GFP表达较弱的类器官被选择性富集。
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结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因1。晚期疾病患者对传统疗法反应不足，表明目前尚无法有效根治CRC。为了开发更有效的治疗策略，已建立了多种模拟CRC特征的临床前小鼠模型。由于操作简便且易于处理，多种CRC细胞系已被广泛用于构建肿瘤异种移植模型。然而，长期培养癌细胞系常常导致在特定培养条件下具有较强增殖能力的独特细胞亚群被选择出来，从而造成实验结果不可靠，并在临床前药物研发中带来重要局限性。
未经培养 体外，通过将患者来源的结直肠癌组织经手术切除后植入动物模型，也已建立了患者来源的肿瘤异种移植模型（PDXs）2,3,4PDX 模型被广泛认为能够重现其来源患者肿瘤中的主要组织病理学特征和遗传改变。此外，通过在三维条件下培养，建立了由肿瘤细胞簇组成的患者来源肿瘤类器官，该培养条件高度模拟了原始肿瘤的生物学特性5,6这些肿瘤类器官还被应用于高通量药物筛选，从而有助于设计个体化治疗方案5然而，肿瘤组织内可能存在显著异质性的结直肠癌细胞群体。特定的结直肠癌细胞群体可能在过程中选择性增殖并扩增 体内 和 体外 PDX和肿瘤类器官的连续传代。这还可能导致受影响的结直肠癌整体基因表达谱和表观/遗传状态发生改变，从而使其与亲本结直肠癌的相似性显著降低。
源自患者的结直肠癌（CRC）类器官，以及通过基因工程在非癌性人结肠组织中引入多种致癌突变而构建的类器官，已被用于研究人类肿瘤细胞的典型特征，如肿瘤侵袭和转移6,7,8,9。然而，将源自患者的CRC异种移植到免疫缺陷小鼠体内后，其自发转移的发生率极低，这使得研究侵袭-转移级联反应的多步骤过程变得困难，该过程包括局部侵袭、内渗、血液中循环、外渗以及远端器官的定植4,10。在实验小鼠模型中，对受累远端器官切片进行组织病理学分析时，常忽略由源自患者的CRC类器官形成的、直径≤2 mm的微转移灶。此外，由于在将肿瘤类器官细胞注射入受体小鼠前，难以高效地引入荧光标记物，导致在活体中对自发性微转移灶的可视化观察也极为有限。in vivo 本研究中，我们建立了一种在三维培养条件下，于注射前高效地将GFP慢病毒转导至PDX来源的CRC类器官细胞的实验方案，并利用立体荧光显微镜实现对这些细胞在不同器官中定植并形成微转移灶的高灵敏度检测。

<table><tbody><tr><td>NOD/Shi-scid IL2R&amp;gamma; null (NOG) 小鼠</td><td>日本神奈川中央实验动物研究所</td><td></td><td>在无菌和特定病原体-free条件下饲养6周龄雄性小鼠</td></tr><tr><td>伤口夹&lt;br/&gt; 2&amp;times;10 mm</td><td>日本Natsume制造公司</td><td>#C-21-S</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>Hamilton注射器&lt;br/&gt; 针头规格：22号</td><td>东京科学，日本</td><td></td><td>用70%乙醇和无菌PBS消毒</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>BMBio</td><td>#92006</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>BMBio</td><td>#92412</td><td></td></tr><tr><td>15 ml锥形管</td><td>住友贝克莱特</td><td>MS-57150</td><td></td></tr><tr><td>50 ml锥形管</td><td>住友贝克莱特</td><td>MS-57500</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>#0030120086</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Erma</td><td>#03-202-1</td><td></td></tr><tr><td>40&amp;mu;m细胞筛</td><td>Corning</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel基底膜基质</td><td>Corning</td><td>#354234</td><td>分装后于-20&amp;deg;C保存。&lt;br/&gt; 使用前置于冰上</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>#C1030</td><td>将Ⅰ型胶原酶配制成150 mg/ml的1&amp;times;PBS溶液。分装后于-20&amp;deg;C保存，可保存长达1年</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovate Cell Technologies</td><td>#5V2623A</td><td>4&amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>含GlutaMAX&amp;trade;的DMEM/F-12培养基</td><td>Gibco</td><td>#10565018</td><td>4&amp;deg;C保存。使用前于37&amp;deg;C预热</td></tr><tr><td>Cell banker 1plus</td><td>ZENOAQ</td><td>#628</td><td>4&amp;deg;C保存。1个月内使用完毕</td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>4&amp;deg;C保存。1个月内使用完毕</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>4&amp;deg;C保存。1个月内使用完毕</td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PEPROTECH</td><td>#AF-100-15</td><td>-20&amp;deg;C保存。当日使用时加入培养基</td></tr><tr><td>Y27632（ROCK抑制剂）</td><td>Wako</td><td>#253-00591</td><td>-20&amp;deg;C保存。当日使用时加入培养基&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>培养基</td><td>Gibco</td><td></td><td>DMEM/F-12含GlutaMAX&amp;trade;补充剂，并添加5% FBS、100 U/ml青霉素和100 &amp;micro;g/ml链霉素。&lt;br/&gt; 4&amp;deg;C保存。1个月内使用完毕。</td></tr><tr><td>CRC类器官培养基&lt;br/&gt; 含1%或5% FCS</td><td></td><td></td><td>DMEM/F-12含GlutaMAX&amp;trade;补充剂（Gibco #10565018），并添加1%或5% FCS、100 U/ml青霉素、100 &amp;micro;g/ml链霉素、2 ng/ml hEGF和10 &amp;micro;M Y27632（ROCK抑制剂）。&lt;br/&gt; 4&amp;deg;C保存。1个月内使用完毕。</td></tr><tr><td>FuGENE 6转染试剂</td><td>Roche</td><td>11814 443001</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.45 &amp;micro;m滤器</td><td>Sartorius stedim</td><td>17598-K</td><td></td></tr><tr><td>5 ml聚丙烯离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>PRRL-GFP载体</td><td>由Robert A. Weinberg博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>由Robert A. Weinberg博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2 dvpr</td><td>由Robert A. Weinberg博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW55Ti摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司Axioplan 2体视荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经gfp慢病毒转导培养后产生的微转移灶

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

尽管目前在人类结直肠癌（CRC）治疗方面已取得进展，但对于CRC晚期仍缺乏有效的根治性疗法。为应对这一临床挑战，研究人员已开发出多种临床前模型，包括利用长期建立的人源癌细胞系构建的肿瘤异种移植小鼠模型以及多种携带肿瘤的转基因小鼠模型。这些模型可在一定程度上模拟人类癌瘤的特征，但往往无法充分重现人类恶性肿瘤的关键特征，如侵袭和转移。因此，人们一直期待能够更准确反映人类结直肠癌恶性进展的替代模型。
本文展示了通过将患者来源的结直肠癌（CRC）小组织片段经手术分离后皮下植入，从而建立患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）。结肠PDX模型在体内生长，并在组织病理学上与患者原发肿瘤相似。然而，在PDX模型中，常规的远端器官横切面检测仅能发现极少数的自发微转移灶。为了促进对肿瘤向远端器官转移播散的检测，我们从结肠PDX中分离出肿瘤类器官细胞进行体外培养，并在将其注射至重度免疫缺陷的NOD/Shi-scid IL2Rγnull（NOG）小鼠前，用GFP慢病毒进行感染。原位注射的PDX来源CRC类器官细胞在受体小鼠中稳定形成表达GFP的原发性肿瘤。此外，通过荧光显微镜可明显检测到这些小鼠肺组织中出现表达GFP的自发性微转移病灶。此外，经脾内注射CRC类器官细胞可频繁诱导肝脏定植。综上所述，这些结果表明，经GFP标记的PDX来源CRC类器官细胞可在侵袭-转移级联这一多步骤过程中实现可视化检测。本文所述实验方案包括建立人源CRC的PDX模型，以及利用GFP慢病毒颗粒转导相应的CRC类器官细胞并进行三维培养。

一名76岁女性患者经手术切除一例中分化原发性结直肠腺癌，TNM分期为IIIa期，术后接受化疗。免疫组织化学染色显示，原发性结直肠癌细胞对癌胚抗原、Ki-67、广谱细胞角蛋白及E-钙黏蛋白呈阳性反应。将切除的肿瘤组织片段皮下植入NOG小鼠体内，建立结肠癌患者来源异种移植（PDX）模型。随后从这些小鼠体内皮下生长的结肠PDX组织中分离结直肠癌类器官细胞并进行体外培养。该结直肠癌类器官在人工细胞外基质上连续传代过程中，能够持续形成多细胞簇。由于肿瘤类器官在组织学和遗传学特征上能够反映患者原发肿瘤的特性5,6我们尝试开发一种小鼠模型，以实现 体内 在转移扩散过程中以高灵敏度检测结直肠癌类器官细胞。为实现这一目标，将结直肠癌类器官感染GFP慢病毒，从而使几乎所有类器官均呈现强烈的GFP荧光信号（图2A）。随后将这些类器官原位及脾内注射至继代NOG小鼠，并在荧光显微镜下检测远端器官中GFP阳...

为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

尽管目前在人类结直肠癌（CRC）治疗方面已取得进展，但针对CRC晚期阶段的有效根治性疗法仍然有限。为克服这一难题……

该方法有助于解答结肠癌患者肿瘤生物学领域中有关微转移灶的关键问题。此技术的主要优势在于，它能够利用小鼠体内经GFP标记的患者来源结肠癌类器官诱导产生的微转移灶，实现高灵敏度检测。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为在小鼠远端器官中检测源自结肠肿瘤类器官的微转移灶具有较大挑战性。本实验操作将由我团队中的博士生兼外科医生水越浩介和小山优共同示范，与冈崎优一起完成。为了生成人结直肠癌细胞类器官，首先在冰上向12孔板的每个孔中加入150 µL人工细胞外基质。当所有孔均完成包被后，将培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育30至60分钟，以使凝胶充分固化。接下来，将来源于患者的肿瘤异种移植细胞沉淀重悬于新鲜的结直肠癌类器官培养基中，培养基中添加5%胎牛血清（FCS），调整细胞浓度至每毫升3 × 10⁵个细胞，并将1毫升细胞悬液接种至每份人工细胞外基质中。然后，将细胞放回细胞培养孵箱中。次日早晨，小心地将培养上清液（包括悬浮细胞）转移至1.5毫升微量离心管中进行离心，再将沉淀物重悬于70微升预冷的新鲜人工细胞外基质中，置于冰上。为了提高结直肠癌细胞的存活率，将含有悬浮肿瘤细胞的人工细胞外基质重新覆盖到已包被人工细胞外基质的孔板上，并将肿瘤细胞培养物置于细胞培养箱中孵育30分钟。当新形成的细胞外基质凝胶完全凝固后，向培养物中加入1毫升新鲜的结直肠癌类器官细胞培养基（添加1% FCS），然后将细胞放回细胞培养箱中继续培养。培养7至10天后，使用无菌细胞刮棒机械性分离类器官，并将类器官转移至1.5毫升微量离心管中进行离心处理。然后，用轻柔敲击的方式将沉淀重悬于500 µL PBS中，进行下一次离心。为解离结直肠癌类器官，向各管中加入500 µL蛋白酶和胶原酶消化液，并通过轻柔敲击混匀。室温孵育10分钟后，向细胞中加入500 µL添加了1% FBS的培养基，并用移液器非常轻柔地反复吹打数次，以分散类器官。在处理过程中轻柔吹打人源结直肠癌类器官，对于维持其在培养中完整的球状结构至关重要。再次离心细胞，并将沉淀重悬于100 µL 5X GFP慢病毒原液和400 µL新鲜的结直肠癌类器官培养基中。使用高滴度的GFP慢病毒感染人源结直肠癌类器官至关重要，尤其是为了实现接近100%的类器官感染率。调整每管体积，使细胞浓度达到每500微升培养基含5×10⁵个解离的肿瘤细胞，并如图所示将500微升细胞悬液接种至预先包被人工细胞外基质的12孔板中各孔。细胞在培养箱中培养18小时后，将含有悬浮细胞的上清液分别转移至1.5毫升微量离心管中，离心后弃上清，每管用70微升人工细胞外基质在冰上重悬沉淀。为提高结直肠癌细胞的存活率，将含肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖于12孔板中的肿瘤类器官上，然后将培养板置于细胞培养箱中孵育30分钟。当人工细胞外基质包被凝固后，加入一毫升添加了1% FCS的

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

淋巴结慢病毒北疆-转基因 Organoids 培养的大鼠结肠肿瘤的高灵敏度检测

本研究报道的新方案通过联合方法实现了在小鼠中以单细胞分辨率选择性检测肺转移灶 原位 肺灌注与固定及X-Gal染色...

通过联合方法在单细胞分辨率下实现小鼠肺转移灶的优化可视化 原位 肺组织灌注与X-Gal染色 lacZ-标记的肿瘤细胞

本视频介绍了通过在包被人工细胞外基质的培养板上扩增小鼠模型来源的结直肠癌细胞，从而生成三维类器官的详细实验方案。这些结直肠癌类器官可作为研究人类肿瘤细胞原位生长及转移的模型。...

结直肠癌类器官培养：一种从结直肠癌细胞获取三维类器官的方法

本视频介绍了通过GFP慢病毒颗粒转导生成结直肠癌类器官的技术，以实现荧光成像。将这些GFP标记的类器官植入动物模型后，有助于研究肿瘤的侵袭和转移过程。...

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本视频介绍了将经GFP慢病毒标记的PDX来源的结直肠癌类器官移植至免疫缺陷小鼠脾脏以生成转移瘤的实验方案。通过荧光显微镜检测GFP表达，可观察到定植于其他器官的癌症微转移灶。...

建立实验性转移小鼠模型：在PDX模型中植入表达GFP的结直肠癌类器官细胞以检测微转移灶

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我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

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用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

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高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

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