Name: 小肠部分梗阻的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学习在小鼠体内建立小肠部分梗阻模型的手术方法，用于研究肠道组织分子与表型变化。该技术可靠、可重复且经济高效，有助于探索肠梗阻的细胞机制及潜在治疗策略。

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作者谨此感谢 Benjamin J Weigler，D.V.M.，Ph.D. 和 Walt Mandeville，D.V.M.（动物资源中心） &amp;感谢内华达大学雷诺分校校园驻场兽医（#38; Campus Attending Veterinarian, University of Nevada, Reno）为小鼠提供的优质动物护理服务，以及在手术操作方面给予的专业指导。

以下方案已获得内华达大学雷诺分校（UNR）动物资源中心的机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并符合所有关于实验动物使用的机构伦理准则。
1. 动物。
<ol>
	<li>获取4至6周龄、体重在20至30克之间的成年C57BL/6小鼠。将实验小鼠群体饲养在内华达大学里诺分校动物资源中心的集中式动物设施中。</li>
</ol>
2. 部分阻塞手术
注意：手术应在专用于外科手术的房间内进行。所有手术器械在手术前均需经过高压灭菌。手术室内所有人员必须全程穿戴无菌手术衣和手套。
<ol>
	<li>手术小鼠的准备
	<ol>
		<li>检查麻醉输送系统，确保氧气和异氟烷的供应足以满足手术过程的需要。打开氧气供应。打开气体流量计，并将其调节至 500–1000 mL/min。将动物放入诱导室，并密封顶部。</li>
		<li>将异氟烷蒸发器开启至 5%，并监测动物直至其失去自主体位。随后将麻醉输送系统切换至鼻罩。</li>
		<li>用氧气冲洗诱导室中残留的气体，然后关闭诱导室管路，同时保持鼻罩管路开放。</li>
		<li>将动物从诱导室中取出，并小心地在其眼睛上涂抹眼用软膏。</li>
		<li>当气体持续流动时，将鼻罩放置在预热的保温垫上。</li>
		<li>将氧气流量调整为 100–200 mL/min，异氟烷浓度为 2–3%。如果动物开始移动，需在鼻罩保持就位的同时轻轻固定动物，直至其再次完全麻醉。</li>
		<li>在手术过程中监测动物的呼吸频率及对刺激的反应，并根据需要调整异氟烷浓度（2–5%）。在开始手术前，通过检测脚趾夹捏反射是否消失来评估动物的麻醉深度。</li>
		<li>在远离切口部位处，通过腹腔注射给予镇痛药物（丁丙诺啡，每克体重 1 µg）。</li>
		<li>使用干净的棉签在小鼠腹部涂抹脱毛膏。让脱毛膏在小鼠皮肤上停留 3–5 分钟，然后用纱布和棉签清除毛发。重复此步骤，直至小鼠腹部所有毛发被彻底清除。</li>
		<li>使用纱布和棉签以 70% 乙醇清洁皮肤。使用棉签或聚维酮碘溶液进一步清洁腹部区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>部分梗阻手术
	<ol>
		<li>使用尺寸为 25 × 50 cm 的无菌手术单覆盖手术区域，中央留出 2.5 × 2.5 cm 的开口用于手术操作。通过在开口边缘及皮肤边界处放置无菌胶带，将手术单固定于动物体表。</li>
		<li>使用 15 号刀片手术刀纵向做一条约 3.0 cm 的腹部切口，确保仅切开皮肤，此时避免损伤肌腹膜层。</li>
		<li>使用镊子和手术剪，小心地将皮肤与肌腹膜层分离，避免损伤肌腹膜层。当两层组织充分分离后（约 1 cm × 4 cm），在肌腹膜层上识别白线，并沿白线剪开约 2 cm，使用显微镊和显微剪暴露腹膜腔。</li>
		<li>仔细寻找并识别盲肠。使用显微镊缓慢而轻柔地将盲肠从腹膜腔中取出，同时将近端结肠和回肠随盲肠一同移出至无菌手术单上。立即使用浸有 0.9% 无菌生理盐水的纱布润湿肠组织，并在组织暴露于腹腔外期间始终保持其湿润。</li>
		<li>定位并识别回肠与近端结肠之间的肠系膜。在肠系膜上，沿回肠下方平行位置做一约 1 cm 的切口，注意避免损伤任何血管结构。</li>
		<li>取一已高压灭菌的硅胶环（长度 6 mm，外径 4 mm，内径 3.5 mm）。沿纵向剪开管状结构，并使用显微镊将环撑开。</li>
		<li>将撑开后的环一端穿过肠系膜切口。通过将环的两端对接，使其恢复为闭合环状结构，并确保回肠被环完全包围。</li>
		<li>确认硅胶环完全包绕回肠后，使用缝线闭合环，并小心地将肠道组织复位回腹膜腔内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术关闭
	<ol>
		<li>沿白线使用可吸收缝线对肌腹膜层进行连续单纯缝合，以关闭肌腹膜层切口。缝合完成后，使用浸有 0.9% 无菌生理盐水的纱布清除任何出血点。</li>
		<li>为完全闭合切口，使用另一根尼龙缝线对皮肤进行连续单纯缝合。</li>
		<li>在两层缝合均完成后，使用新的棉签或聚维酮碘溶液清洁伤口。</li>
		<li>通过腹腔注射给予抗生素（庆大霉素，每只小鼠 150 μL，基于 20–30 g 体重）。</li>
		<li>手术结束后，关闭异氟烷蒸发器，让动物仅吸入流动的氧气，直至其开始恢复意识。</li>
		<li>当动物清醒后，将其转移至配备保温支持的独立恢复区域，直至其完全恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 术后观察。
<ol>
	<li>手术完成后，将动物转移至恢复室内的恒温恒湿培养箱中。动物在培养箱期间，术后最初一小时内每15分钟监测一次，随后一小时内每30分钟监测一次。</li>
	<li>完成规定时间的观察后，立即将动物转移至各自独立的笼具中，并每日监测其是否存在疼痛的临床表现18，同时确保手术切口正常愈合，无任何并发症（如切口裂开）迹象。</li>
</ol>

<ol><li>Millat, B., Guillon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiopathology+and+principles+of+intensive+care+in+intestinal+obstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Prat%22%5BJournal%5D)">Physiopathology and principles of intensive care in intestinal obstructions.</a> Rev Prat. 43, 667-672 (1993).</li>
<li>Tonelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+Crohn%27s+disease%3A+solution+of+doctrinal+mysteries+and+reinstatement+as+a+surgically+treatable+disease.+1.+The+process+is+not+a+form+of+enteritis+but+lymphedema+contaminated+by+intestinal+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Chir+Ital%22%5BJournal%5D)">New developments in Crohn's disease: solution of doctrinal mysteries and reinstatement as a surgically treatable disease. 1. The process is not a form of enteritis but lymphedema contaminated by intestinal contents.</a> Chir Ital. 52, 109-121 (2000).</li>
<li>Limsrivilai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analytic+Bayesian+model+for+differentiating+intestinal+tuberculosis+from+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Meta-analytic Bayesian model for differentiating intestinal tuberculosis from Crohn's disease.</a> Am J Gastroenterol. 112, 415-427 (2017).</li>
<li>Dvorak, D., Adamova, Z., Bar, T., Slovacek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+hernia+as+a+cause+of+small+bowel+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Rozhl+Chir%22%5BJournal%5D)">Internal hernia as a cause of small bowel obstruction.</a> Rozhl Chir. 96, 34-36 (2017).</li>
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<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+hydrogen+sulfide+biosynthesis+accompanies+murine+interstitial+cells+of+Cajal+dysfunction+in+partial+ileal+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of hydrogen sulfide biosynthesis accompanies murine interstitial cells of Cajal dysfunction in partial ileal obstruction.</a> PLoS One. 7, e48249(2012).</li>
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<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+hyperplasia%2Fhypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn%27s+fibrostenosing+bowel+strictures%3A+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> J Crohns Colitis. 11, 92-104 (2017).</li>
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<li>Spencer, N. J., Dinning, P. J., Brookes, S. J., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+colonic+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying colonic motor patterns.</a> J Physiol. 594, 4099-4116 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

我们证明了接受肠部分梗阻（PO）手术的小鼠能够稳定且可重复地出现肠平滑肌肥厚，该现象模拟了人类的肠梗阻。针对不同动物已开发出多种肠梗阻手术模型，包括小鼠7、大鼠10、豚鼠11、狗12和猫13。与其他较大的动物模型相比，小鼠肠梗阻模型在时间、成本、体型和表型方面具有优势。在小鼠或大鼠中，肥厚的形成仅需10–14天10，而豚鼠、狗和猫则需要2–4周11,12,13。在购买和维持饲养方面的成本，小鼠也显著低于其他动物模型。此外，小鼠体型小，便于进行PO手术操作。最重要的是，接受PO手术的小鼠会在小肠中逐步且广泛地发展出肥厚，而其他较大的动物则表现出较轻的组织增生。
<...

肠梗阻是指小肠或大肠部分或完全阻塞，阻碍消化后的食物、液体和气体在肠道内正常通过1。由于梗阻的存在，肠壁会因此增厚，导致肠腔变窄2。肠梗阻可由腹部或盆腔手术引起腹腔粘连组织形成所致，也可由胃肠道疾病引发，如炎症性肠病（克罗恩病）、憩室炎、疝气、肠扭转、狭窄、肠套叠、便秘、粪便嵌塞、假性梗阻、癌症和肿瘤等3,4,5。在这些情况下，肠梗阻常导致肠肌层肥厚6。
肠腔的梗阻（PO）会引起肠管扩张，并因需要维持功能性蠕动而在梗阻部位周围导致平滑肌层增厚7,8,9,10,11,12,13。已建立多种肠道PO动物模型，用于研究小鼠7、大鼠10、豚鼠11、犬12和猫13的肠平滑肌肥厚，这些模型均能稳定地在肠壁肌层中诱导出类似的肥厚性改变。
一种小鼠肠道PO模型是生成和研究肠道梗阻最具成本效益的方法 体内小肠梗阻通过在外科手术中将硅胶环放置于回肠周围在小鼠中建立。术后肠梗阻（PO）小鼠在手术后早期表现出细胞数量增加（增生）以及肌层厚度增加（肥大）。8,15SMC 是在肥厚条件下于平滑肌层内增殖的主要成肌细胞14，但其他细胞如ICC和PDGFRα+ 与SMC密切相关的细胞也得到重新定植。我们先前报道过，PO小鼠的小肠出现肥大，其中SMC去分化为PDGFRα+ 增殖活性高的细胞7,15,16相反，ICC 在肠梗阻发展过程中会随着平滑肌层的肥厚而发生变性并消失。7PO模型的另一主要优势在于其能够诱导肠神经系统的变化以及产生传播性的神经源性运动模式。小鼠小肠中主要的传播性神经源性运动模式是移行性运动复合波（migrating motor complex, MMC），该模式为神经源性，不需要ICC或慢波电活动参与。17PO模型可清晰揭示部分梗阻如何重塑肌间神经丛和肠神经。
本文提出一种利用硅胶环进行小鼠肠道部分梗阻（PO）手术的小鼠模型方案。接受PO手术的小鼠可稳定地在小肠肌层中诱导出肥厚性增生。在肥厚的肌肉组织中，平滑肌细胞（SMC）、Cajal间质细胞（ICC）、PDGFRα+细胞及神经元细胞均发生显著的结构重塑。

<table><tbody><tr><td>手术铺巾</td><td>医疗与兽医用品</td><td>SMS40</td><td>40&amp;rdquo;X100 码</td></tr><tr><td>护理垫，经济型，专业加长款</td><td>医疗与兽医用品</td><td>MSC281224</td><td>17x24&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>SC-i-130</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Vantage</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 电子镊 &amp;和珠宝匠镊子</td><td>杜蒙</td><td>98-180-3</td><td></td></tr><tr><td>编织可吸收缝合线</td><td>Covidien Polysorb</td><td>SL-5687G</td><td>5-0，聚乳酸-羟基乙酸共聚物</td></tr><tr><td>尼龙非吸收性单丝</td><td>阿尔茨海默病手术</td><td>S-N618R13</td><td>6-0，尼龙</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Dynarex</td><td></td><td>15号</td></tr><tr><td>持针器</td><td>雅各布森显微血管</td><td>36-1342TC</td><td>8.5 英寸</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Flinn Scientific</td><td>AB1049</td><td></td></tr><tr><td>显微外科剪刀</td><td>WPI</td><td>503305</td><td></td></tr><tr><td>凡士林眼膏</td><td>Puralube VET</td><td></td><td>3.5 g</td></tr><tr><td>氟烷（异氟烷）</td><td>Vetone</td><td>V1 502017</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>加强型皮肤闭合胶带</td><td>3M</td><td>R1547</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>Medline</td><td>MSG2270</td><td></td></tr><tr><td>耳挂式口罩</td><td>安全区</td><td>RS700</td><td></td></tr><tr><td>Avant 纱布非织造海绵</td><td>护理</td><td>PRM25444</td><td></td></tr><tr><td>手术杯</td><td>海军上将&amp;nbsp; 制备 OYC-2</td><td>725-A42</td><td>2.5 盎司</td></tr><tr><td>Swabstick</td><td>ChloraPrep</td><td>260103</td><td>2% w/v 氯己定&amp;nbsp; 葡萄糖酸盐（CHG）和70% v/v异丙醇（IPA）</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>动物园药学</td><td>BZ8069317</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Vetone</td><td>G-6336-04</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>快速作用凝胶霜去除剂</td><td>Veet</td><td>8111002</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>AHS</td><td>AH01T2516</td><td>1 ml 带针头</td></tr><tr><td>硅环</td><td>VWR</td><td>60985-720</td><td>长6 mm，外径4 mm，内径3.5 mm</td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td>4-6 周龄</td></tr></tbody></table>

一种肠道部分梗阻的小鼠模型

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

阻碍或阻断肠道蠕动的肠梗阻可由腹腔粘连以及包括肿瘤性病变在内的大多数胃肠道（GI）疾病引起。然而，与肠梗阻相关或由其引发的细胞重塑机制目前尚不明确。尽管已建立多种肠梗阻的动物模型，但小鼠模型在成本和时间上最具效益。该模型通过手术植入部分性肠梗阻（PO），但若操作不当，其死亡率较高。此外，若未使用合适的阻断装置或放置位置不准确，接受PO手术的小鼠将无法形成肥厚性改变。本文介绍一种详细的PO手术方案，可产生可靠且可重复的肠梗阻模型，并具有极低的死亡率。该方案采用外科手术方式在回肠周围放置一个硅胶环，以部分阻断小肠内的消化物流动。这种部分性阻塞导致肠道因消化运动停滞而发生扩张。肠道扩张可诱导硅胶环口侧的平滑肌发生肥厚，该过程在两周内逐步发展，最终导致动物死亡。这种手术诱导的部分性肠梗阻小鼠模型提供了一种可用于研究肠梗阻发展过程中肠细胞病理变化的活体（in vivo）模型，适用于研究平滑肌细胞（SMC）、 Cajal间质细胞（ICC）、PDGFRα+细胞以及神经元细胞等组织的改变。

通过在一个月大的小鼠回肠近回盲瓣处放置一个硅胶环，手术诱导部分梗阻（PO）。该环在回肠中造成部分阻塞。同时对年龄和性别匹配的小鼠进行假手术（SO），但不放置硅胶环，这些小鼠未表现出与PO小鼠相似的任何症状。小鼠在PO手术后数小时内迅速恢复，术后第一周内未见明显行为改变或虚弱表现；但在第一周后，逐渐出现PO相关症状：腹部膨胀以及粪便颗粒数量减少且体积变小。在PO手术后第8天和第13天，将PO小鼠与SO对照小鼠一同处死。与SO对照小鼠相比，PO小鼠在术后第8天小肠部分充盈并扩张，至第13天则完全充盈并显著扩张（图1A）。PO手术后第8天和第13天小鼠结肠中的粪便颗粒形成较SO对照小鼠减少（图1B）。取硅胶环上游的回肠组织进行解剖，并通过苏木精和伊红（H&amp;E）染色分析平滑肌。在PO手术后第8天，平滑肌层已出现肥大，至第13天肥大程度进一步加重（Figure 2）。我们还通过免疫化学方法观察到P...

肠梗阻是指肠道出现部分或完全阻塞，可引起严重腹痛、恶心、呕吐，并阻碍粪便排出。该小鼠肠部分梗阻造模方法可靠，可用于研究肠道内病理性细胞增殖与死亡的潜在机制。

肠梗阻会阻碍或阻断蠕动运动，可由腹腔粘连以及包括……在内的大多数胃肠道（GI）疾病引起。

本手术操作的总体目标是稳定、可靠地在小鼠体内诱导肠梗阻，从而促进对胃肠道组织在梗阻刺激下发生的分子及表型变化的研究。该方法有助于解答胃肠研究领域中关于肠梗阻所致表型变化背后细胞机制的关键问题。该技术的主要优势在于其可靠性高、可重复性强且成本较低。该技术在肠梗阻治疗方面具有重要意义，因为它模拟了由肠梗阻引起的人类病理中所观察到的表型特征。本实验操作将由本实验室的博士后 Se Eun Ha 和研究生 Lai Wei 演示。在确认动物对脚趾夹捏无反应后，向其眼部涂抹眼膏，并将小鼠置于加热垫上。使用脱毛膏去除腹部毛发，并用70%乙醇清洁暴露的皮肤。用聚维酮碘溶液对术区进行消毒，将一张25厘米×50厘米的无菌纸巾覆盖于动物体表，其中间留出2.5厘米×2.5厘米的开口暴露手术区域。用无菌胶带将敷巾固定在开口边缘与皮肤交界处，使用15号手术刀片做一条3厘米长的纵向皮肤切口。使用镊子和手术剪，小心地将皮肤与肌腹膜层分离，避免切开组织，并找到腹白线。然后使用显微镊子和剪刀沿腹白线剪开约2厘米，暴露腹膜腔，仔细辨认盲肠。用显微镊子缓慢轻柔地将盲肠、近端结肠和回肠从腹膜腔内移至无菌手术巾上，并立即用浸有0.9%无菌生理盐水的纱布湿润肠组织。在回肠与近端结肠之间找到肠系膜，于肠系膜上紧邻回肠下方平行处做一长度为一厘米的切口，注意避免损伤任何血管结构。沿纵轴切开以暴露肠系膜血管，使用显微镊子撑开一个经高压灭菌消毒的合适尺寸硅胶环。将环的一端经切口插入，并将环的另一端与起始端对接，使器械恢复至原始环状形态。确认环状物完全环绕回肠，并用缝线闭合该环。肠系膜上的切口应足够大以容纳环状物，但又需足够小，避免损伤血管。同时确保环状物置于回肠上，而非结肠上。仔细将肠管复位至其原始解剖位置，并使用可吸收缝线沿腹白线以连续单纯缝合法缝合肌腹膜层。用浸有0.9%无菌生理盐水的纱布清理任何出血部位，然后使用新的尼龙缝线以连续单纯缝合法缝合皮肤。接着用聚维酮碘对伤口部位进行消毒，并注射抗生素，之后将动物置于保温箱中持续监测，直至完全恢复卧位状态。在本实验中，与对照组假手术动物相比，部分梗阻手术后第8天小肠部分充盈并扩张，手术后第13天则完全充盈并显著扩张。此外，部分梗阻手术后第8天和第13天小鼠结肠中的粪便颗粒形成较对照组动物减少。在部分梗阻手术后第8天，环状狭窄近端回肠的平滑肌层出现肥厚，至第13天肥厚程度进一步加重。通过免疫化学分析评估，在部分梗阻手术后第8天和第13天，平滑肌细胞在所有三个组织层中的生长速度均逐渐加快，而卡哈尔间质细胞在肌内和肌间层中发生退化。血小板源性生长因子受体α阳性细胞亚群（也称为PDGFRα细胞）在部分梗阻小鼠的肌间层中发生动态重塑：术后第8天观察到其生长，但在第13天时已出现退化。此外，在部分梗阻小鼠中，神经元细胞在术后第8天和第13天时于肌间和肌内区域也显著减少。掌握该技术后，应在30分钟内完成操作，以确保小鼠存活。进行此操作时，快速而轻柔地处理组织至关重要。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如胃肠道传输测试），以探究梗阻如何改变肠道蠕动的相关问题。该技术问世后，为胃肠道研究领域的研究人员探索小鼠肠梗阻后果奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何快速、规范地在小鼠回肠上套置环状物以建立肠道部分梗阻模型。请务必注意，使用手术器械和针头具有极高危险性，必须采取适当的安全防护措施。此外，在进行该操作时，务必佩戴无菌手套并采用无菌技术。

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一种肠道部分梗阻的小鼠模型

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