腺相关病毒介导的脊髓基因神经元的转基因表达

重组腺相关病毒脊髓内递送的总体目标是实现背脊髓中遗传定义的神经元的组织学标记和功能作。这种方法可以帮助回答疼痛领域的关键问题，例如感知不同的疼痛模式需要哪些神经元回路。这种技术的主要优点是可以以特殊限制和时间控制的方式纵遗传标记的神经元。

通过沿麻醉小鼠的脊柱触诊来定位最尾部的肋骨对。然后，在皮肤上做 1.5 到 2.5 厘米的纵向切口，从喙部开始到最尾部的一对肋骨。用镊子提起皮肤，然后用剪刀将其从下面的肌肉上分离。

在整个手术过程中，用无菌的 0.9% 氯化钠保持暴露的组织湿润。使用细镊子和小剪刀，在中线旁边的薄膜层上切开一个切口，然后将其从棘突上切开。几个解剖标志可以帮助确定要瞄准的正确椎骨。

在这里，我们描述了三种替代方案。沿脊柱触诊。最尾的肋骨对位于 T13 椎骨的喙部，臀部水平的骨盆骨位于 L6 椎骨的水平。

或者，将皮肤向尾部拉，露出髂嵴。在同一水平上，最尾部的一对可见中间韧带加入 L6 脊柱突。沿尾部到喙部方向向后计数，以确定感兴趣的椎骨。

否则，找到沿脊柱一侧肌腱最白且最内侧的部位。T13 椎骨位于喙部。腰椎脊髓段 L4 位于该椎骨内。

接下来，将动物放在卷起的组织垫上，将其提升到立体定位框架的脊柱夹上。对齐与目标椎骨相邻的夹具。将一个夹子固定到位，然后用 Adson 镊子固定脊柱，同时固定第二个夹子。

通过小心按压目标椎骨来确认正确夹紧。然后，切除感兴趣椎骨上方的棘旁肌。首先，在平行于脊柱的肌腱内侧做一个切口。

然后，在目标椎骨的嘴部和尾部做垂直的切口。接下来，使用 rongeurs 撕裂或切掉感兴趣椎骨上方的棘旁肌。根据需要使用镊子去除残留在椎骨上或椎内间隙硬脑膜上方的组织。

现在应该可以看到背血管，标记脊髓的中线。对于单侧注射，使用配备 0.5 毫米球形切割器的精细牙医钻头进行部分椎板切除术，非常小心地在椎骨目标侧的中间钻一个孔。用 26 号斜面针去除任何剩余的骨碎片，以暴露脊髓。

使用针头在目标椎骨的喙部和尾部的椎内间隙（背血管外侧约 300 微米）穿孔。然后，在钻孔下方的硬脑膜上穿孔。此时，脑脊液应从孔中逸出，脊髓应略微凸出。

首先将玻璃毛细管安装到微升注射器上，以准备注射注射器。拧紧螺母以确保紧密和牢固的配合。用无菌蒸馏水填充微升注射器，然后按下柱塞。

如果水不容易从吸头排出，则微量移液器可能被堵塞，应更换。将注射器安装到连接到电子控制显微注射器的显微作器上。然后，使用显微注射器吸入约 1 微升空气以分离水和病毒。

接下来，将 2.5 微升稀释的病毒溶液液滴移到一块石蜡膜上。使用立体取向框架小心地将微量移液器的尖端移动到液滴中，然后将其向上吸入微量移液器中。然后，按压分液，直到尖端出现一滴病毒溶液。

缩回注射器并用笔用刻度标记微量移液器，以监测分配的体积。使用立体定位臂将微量移液器的尖端移过硬脑膜上的一个孔，然后向下移动，直到暴露的脊髓表面出现轻微的凹陷。要将注射目标对准脊髓背角，以 100 微米的增量将尖端向下移动到 500 微米的深度，然后向上移动 200 微米，以实现组织的机械稳定性。

尖端的最终深度为 300 微米。对泵进行编程以每分钟 50 纳升的注射速度注射 300 纳升后，按下启动按钮开始输注。注射完成后，检查微量移液器上的刻度，看看病毒水平是否下降。

将微量移液器再放置 3 分钟，以平衡压力。三分钟后，慢慢缩回微量移液器，然后对其他两个注射部位重复该过程。最后一次注射后，取下鼠标下方的脊柱夹和垫子。

用间断缝线闭合切口层，用可吸收缝线缝合浅表组织层，用不可吸收缝线缝合皮肤。在缝合的伤口上涂抹碘消毒剂。终止麻醉，将动物留在加热垫上，直到它恢复，然后再将其放回家笼中。

注射部位的脊髓组织将在实验结束时进行检查。这对于验证注射和转导成功以及排除手术导致的过度组织损伤是必要的。为了说明通过脊髓内注射重组 AAV 可以获得的表达水平，将编码 eGFP 荧光蛋白的病毒注射到野生型小鼠的腰椎脊髓中。

三次注射间隔约 1 毫米，导致腰椎节段 L3 至 L5 几乎连续感染。在距脊髓表面 300 微米深度的病毒注射导致脊髓背角细胞的主要感染。然而，感染细胞也可以在腹角中找到。将表达 eGFP 的 cre 依赖性 flex 载体注射到 GlyT2：Cre 转基因小鼠的脊髓中。

这导致反映 GLYT2 阳性神经元分布的 eGFP 表达更加受限。遵循此协议将允许靶向三个连续的脊柱段。我们发现这足以获得稳健的行为结果。

该技术将允许研究特定神经元和细胞群以及感觉通路的功能。