腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

脊髓内递送重组腺相关病毒的总体目标是实现对脊髓背角中基因定义神经元的组织学标记和功能操控。该方法有助于回答疼痛研究领域中的关键问题，例如哪些神经环路参与了不同痛觉模式的感知。该技术的主要优势在于，可对基因标记的神经元进行空间特异性且时间可控的操控。

通过触诊麻醉小鼠的脊柱，定位最尾端的一对肋骨。然后，从最尾端肋骨对的稍前方开始，沿皮肤做一条 1.5 至 2.5 厘米的纵向切口。用镊子提起皮肤，并用剪刀将其与下方肌肉组织分离。在整个手术过程中，使用无菌 0.9% 氯化钠溶液保持暴露组织的湿润。使用精细镊子和小型剪刀，在靠近中线处的下一层薄而膜状的组织上做切口，并将其从棘突处剪除。

多个解剖标志有助于确定需要靶向的正确椎骨。此处，我们介绍三种替代方法。沿脊柱进行触诊，最尾端的一对肋骨位于 T13 椎骨稍前方，而髋部水平的骨盆骨则与 L6 椎骨平齐。或者，将皮肤向尾部方向牵拉以暴露髂嵴；在同一水平，最尾端的一对可见横突间韧带连接于 L6 椎骨棘突。从此处开始由尾侧向头侧方向倒数，以确定目标椎骨。另外，可寻找沿脊柱侧面的肌腱最白且位置最靠内侧的部位，T13 椎骨即位于其稍前方。腰段脊髓节段 L4 位于该椎骨内部。

接下来，将动物置于卷起的纸巾垫上，以抬高至立体定位仪脊柱夹的位置。将夹子对准目标椎骨旁，先固定一个夹子，然后用Adson镊子夹住脊柱，同时固定第二个夹子。

通过轻压目标椎骨仔细确认夹持是否正确。然后，清除目标椎骨上方的椎旁肌。首先，在肌腱内侧沿脊柱方向做一平行切口。

然后，在目标椎骨的头侧和尾侧做垂直切口。接着，使用咬骨钳撕开或切除目标椎骨上方的椎旁肌。根据需要使用镊子清除残留在椎骨上或椎管内硬脊膜上方的组织。

背侧血管应已可见，标志着脊髓的中线。对于单侧注射，使用带有0.5毫米球形切割头的精细牙科钻头进行部分椎板切除术，小心地在目标侧椎骨中部钻孔。用26号斜面针清除残留的骨碎片，以暴露脊髓。

使用针头在目标椎骨头侧和尾侧的椎间间隙处穿刺硬脑膜，位置大约在背侧血管外侧300微米处。随后，在钻孔下方穿刺硬脑膜。此时，脑脊液应从孔中流出，脊髓应轻微膨出。

通过先将玻璃毛细管安装到微升注射器上来准备注射用注射器。拧紧螺母以确保连接紧密牢固。用无菌蒸馏水填充微升注射器，然后推动活塞。

如果水分不易从尖端排出，则微移液管可能已被堵塞，应予以更换。将注射器安装到连接电子控制微注射仪的显微操作仪上。然后，使用微注射仪吸入约一微升空气，以分隔水和病毒溶液。接着，将2.5微升稀释后的病毒溶液滴加到一片石蜡膜上。利用体视显微镜支架小心地将微移液管尖端移入液滴中，并将溶液吸入微移液管内。随后，按压“排出”按钮，直至病毒溶液在尖端形成液滴。

回撤注射器，使用记号笔在微量移液管上标记刻度，以监测已分配的体积。使用立体定位臂将微量移液管的尖端移至硬脊膜上的一个孔上方，然后缓慢下移，直至暴露的脊髓表面出现轻微凹陷。为将注射靶向脊髓背角，以每次100微米的步长将尖端下移至500微米深度，随后上移200微米，以实现组织的机械稳定。最终尖端深度为300微米。将泵程序设置为以每分钟50纳升的注射速度注入300纳升后，按下启动按钮开始输注。注射完成后，检查微量移液管上的刻度，观察病毒液面是否下降。

将微量移液器留在原位额外三分钟，以使压力达到平衡。三分钟后，缓慢撤回微量移液器，然后对另外两个注射位点重复该操作。最后一次注射完成后，取下脊柱夹具以及小鼠下方的垫片。

用间断缝合关闭切口各层，浅层组织使用可吸收缝线缝合，皮肤使用不可吸收缝线缝合。在缝合后的伤口处涂抹碘类消毒剂。停止麻醉，将动物留在加热垫上直至其恢复意识，然后将其放回饲养笼中。

实验结束时需检查注射部位的脊髓组织。这是为了验证注射和转导是否成功，并排除手术造成的过度组织损伤。为了说明通过脊髓内注射重组腺相关病毒（rAAV）所能获得的表达水平，将编码eGFP荧光蛋白的病毒注射到野生型小鼠的腰段脊髓中。

相隔约一毫米的三次注射可实现腰段脊髓L3至L5节段近乎连续的感染。从脊髓表面深度300微米处进行病毒注射，主要感染脊髓背角的细胞，但在腹角也可发现被感染的细胞。将表达eGFP的Cre依赖型flex载体注射至GlyT2:Cre转基因小鼠的脊髓中。

这使得eGFP的表达范围更局限，反映了GLYT2阳性神经元的分布。按照本方案操作可靶向三个连续的脊柱节段。我们发现，这足以获得可靠的行为学结果。

该技术将有助于研究特定神经元亚群和感觉通路的功能。