Name: 长期活细胞成像对紫杉醇反应细胞命运的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习使用长期活细胞成像技术评估紫杉醇处理后细胞命运决策的方法。该技术可实时观察单个细胞对不同药物剂量的动态响应，揭示固定细胞成像无法获取的生物学信息，为癌症治疗策略研究提供重要依据。

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AFB、MAV 和 NJG 感谢 Ryan Quinton 对手稿的评论，以及 Adrian Salic 提供 TDRFP-NLS 载体。AFB 和 MAV 由 NIGMS 生物分子药理学培训基金 5T32GM008541 资助。NJG 是 Shamim 和 Ashraf Dahod 乳腺癌研究实验室成员，获得美国国立卫生研究院（NIH）基金 GM117150 和 CA-154531、Karin Grunebaum 基金会、Smith 家族奖励计划、Searle 学者计划以及黑色素瘤研究联盟的资助。

本方案重点介绍使用非转化且染色体稳定的视网膜色素上皮（RPE-1）细胞系进行活细胞成像实验。然而，只要根据需要调整细胞培养条件，本方案也可适用于任何贴壁细胞系。所有操作必须遵守所在机构的生物安全、伦理准则及相关法规。
1. 活细胞成像前的细胞准备
<ol>
	<li>使用新鲜解冻且处于早期传代的表达人组蛋白H2B与荧光蛋白融合蛋白的RPE-1细胞（例如 H2B-GFP），或FUCCI系统（有关生成表达FUCCI细胞的详细实验方案可参见参考文献）45以评估有丝分裂细胞命运。
	<ol>
		<li>为测量细胞核破裂的频率，使用表达 H2B-GFP 以及带有单个核定位信号的红色荧光蛋白串联二聚体（TDRFP-NLS）的 RPE-1 细胞。 
		注意：三种绿色荧光蛋白串联融合至单一核定位信号的构建体（GFP3-NLS) 也已被用于证明破裂现象（如参考文献所示）42).</li>
		<li>将细胞培养于10 cm组织培养皿中，使用适当的生长培养基。RPE-1细胞培养于不含酚红的达尔伯克改良伊格尔培养基/F-12营养混合物（DMEM:F12），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸弃细胞培养基，用10 mL无菌的室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞培养皿以去除残留培养基，然后吸弃PBS。
	<ol>
		<li>加入2 mL含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育3分钟，或直至大部分细胞从培养皿上脱落。 
		注意：切勿将细胞置于胰蛋白酶中超过所需时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入10 mL完全培养基，用10 mL血清学移液管收集消化后的细胞，并转移至15 mL锥形管中。
	<ol>
		<li>通过离心（180 x g）沉淀细胞 g 室温下持续3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸弃上清液，注意不要扰动沉淀；然后用血清学移液管轻轻吹打，将沉淀在10 mL新鲜培养基中充分重悬。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数46.
	<ol>
		<li>在新的锥形管中，用完全培养基将细胞稀释至30,000个细胞/mL。</li>
		<li>每孔加入30,000个RPE-1细胞（1 mL体积），接种于12孔玻璃底成像培养皿（#1.5厚度）中，以达到次日所需的细胞密度（30–50%汇合度）。 
		注意：操作培养板时务必佩戴手套，并注意避免触碰玻璃底面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于37 °C细胞培养孵箱中，使其在玻璃底成像板上完全贴壁并铺展。细胞最短可在4 h内完成贴壁，但建议次日再进行药物处理和成像。</li>
	<li>将紫杉醇（溶于二甲基亚砜（DMSO）中）加入完全培养基至所需终浓度，并充分混匀。
	<ol>
		<li>使用等体积的DMSO配制完全培养基，作为对照。</li>
		<li>将含有药物或DMSO的培养基在添加至细胞前预热至37 °C。这可防止因温度突然变化导致的焦点漂移。</li>
		<li>向12孔成像培养皿的各个孔中分别加入1 mL含有紫杉醇或仅含DMSO的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 为活细胞成像设置显微镜
<ol>
	<li>使用光学清洁剂清洁成像培养皿的玻璃底部，以去除可能干扰成像的指纹或灰尘。使用足量的光学清洁剂润湿整个玻璃表面。</li>
	<li>将玻璃底培养皿放置在显微镜载物台的成像培养皿适配器上，取下培养皿的塑料盖，并用带有玻璃盖的培养室覆盖培养皿。确保培养室具有阀门，可允许含有5% CO2的气体持续流入。 
	注意：为了使5% CO2气体加湿，需将气体通过插入无菌水浴容器中的管道。这可使气体达到95%的湿度平衡。</li>
	<li>使用控制显微镜的软件程序启动/校准编码载物台。这将确保精确的X-Y坐标，并防止焦平面漂移。</li>
	<li>使用相差光学系统对细胞进行对焦，并执行科勒照明（详见参考文献47），以聚焦光线并提供最佳对比度。</li>
	<li>使用采集软件确定白光及所有使用的荧光通道的最佳曝光时间（理想情况下，相机像素饱和度达到75%为宜，前提是该光照强度对细胞无毒性）。
	<ol>
		<li>使用采集软件从每个孔中选择多个不重叠的视野区域用于成像。选择细胞已良好贴附于玻璃底部且融合度在50%至70%之间的区域。避免选择细胞成簇聚集的区域，因为这会使后续分析变得困难。 
		注意：从每个孔中选择不重叠的视野区域非常重要，以避免重复追踪同一细胞。如果细胞运动性很强，可能需要从一个中心点向外采集多张图像，并将它们拼接成一个较大的视野。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启用显微镜的自动对焦功能，以确保在整个实验过程中所有成像点均保持清晰对焦。</li>
	<li>为评估有丝分裂细胞命运，设置成像软件每10分钟从每个选定的视野区域采集一次图像，持续时间最长可达96小时。未受干扰的有丝分裂持续时间为20–40分钟，因此10分钟的时间间隔足以提供足够的采样频率来识别细胞分裂的时刻。为检测核膜破裂这一短暂事件，应每5分钟采集一次图像。 
	注意：请确保驱动图像采集软件的计算机已关闭自动更新、屏幕保护程序和节能模式，因为这些设置通常会干扰长时间实验中的图像采集。</li>
	<li>启动成像实验。在视频采集过程中定期确认图像采集是否顺利进行。</li>
</ol>
3. 视频分析以鉴定紫杉醇处理下的细胞命运
<ol>
	<li>确认在整个成像实验过程中，所成像的细胞均保持健康状态。经DMSO处理的对照细胞应具有活力并处于活跃增殖状态。 
	注意：若细胞出现应激迹象，则不应进行视频定量分析，而应专注于优化成像条件48。成像应激的迹象包括细胞起泡或死亡、细胞无法贴壁或在培养板上铺展，以及细胞有较低的有丝分裂指数和/或有丝分裂过程延长。可能的应激来源包括成像腔室内温度或CO2水平的波动，以及光毒性48。</li>
	<li>当使用10X或20X物镜对整个视野进行成像时，视野中可能存在数百个独立细胞。因此，为便于定量分析，可利用现有软件工具将视野划分为若干较小的象限，并分别对每个象限内的细胞进行评分（如步骤3.3.1–3.6.2所述）。</li>
	<li>在分析视频时，使用相差和/或荧光图像在合并视图中追踪每个细胞。使用软件分析工具生成合并图像。
	<ol>
		<li>从视频开始处起，识别一个处于间期的单个细胞，并利用相差光学系统追踪其在整个细胞周期中的进展。为追踪单个细胞，需逐帧目视观察该细胞。根据其扁平的形态学特征（通过相差成像判断）以及无DNA凝集现象（通过H2B-GFP判断），识别间期细胞（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过观察细胞变圆（使用相差光学系统）和/或染色体凝集（使用H2B-GFP）来识别进入有丝分裂的细胞（图1A-C）。细胞变圆和染色体凝集均可通过肉眼清晰观察到。
	<ol>
		<li>标注细胞进入有丝分裂的时间点。持续追踪该细胞，直至其达到最终命运（进入后期，见步骤3.5；有丝分裂期间发生细胞死亡，见步骤3.6.1；或发生有丝分裂逃逸，见步骤3.6.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照细胞应能高效地排列染色体，并在1小时内进入后期（图1D）。可通过相差光学系统观察到细胞开始缢缩为两个子细胞，或通过H2B-GFP标记观察到染色体向两极移动，从而识别后期（图1A）。标注细胞发生后期的时间点。</li>
	<li>相比之下，经紫杉醇处理的细胞将保持圆形，并伴有凝集的染色体，持续数小时（3–40小时）（图1B-D）。
	<ol>
		<li>识别经历有丝分裂阻滞并发生细胞死亡的细胞。 
		注意：有丝分裂期间死亡的细胞可通过相差显微镜观察到，表现为细胞起泡、收缩和/或破裂（图1B）。若对H2B-GFP进行成像，染色体也会在细胞死亡过程中发生断裂。</li>
		<li>识别经历有丝分裂阻滞并发生有丝分裂逃逸的细胞。 
		注意：有丝分裂逃逸的细胞可通过相差显微镜观察到，其形态重新变扁平，恢复至间期状态，并在未经历后期的情况下解凝染色体（图1C）。发生有丝分裂逃逸的细胞将产生较大的四倍体细胞，且常为多核细胞（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续追踪原始视野中的细胞。当完成对整个视野的追踪后，切换至同一孔中获取的另一个独立视野，并继续追踪细胞。</li>
</ol>
4. 视频分析以确定有丝分裂逃逸后的细胞命运
<ol>
	<li>使用表达FUCCI系统的RPE-1细胞，评估有丝分裂滑脱后（如步骤3.6.2所述）的细胞命运。除相差成像外，还需同时获取红色荧光（指示G1期）和绿色荧光（指示S/G2/M期）图像。
	<ol>
		<li>按照步骤3.3至3.7所述方法追踪FUCCI RPE-1细胞。
		<ol>
			<li>为确认FUCCI系统正常工作，需通过活细胞成像数据分析，验证对照细胞中红色和绿色荧光蛋白的表达是否随细胞周期正确交替。对照细胞在间期从G1期进入S期时，应由完全的核内红色荧光转变为完全的核内绿色荧光；细胞在整个有丝分裂过程中应持续显示绿色荧光；有丝分裂结束后，细胞在间期应再次显示完全的红色荧光。 
			注：尽管已有方法可通过荧光轨迹定量单个细胞中FUCCI系统的RFP和GFP荧光强度49，但由于荧光颜色变化明显且肉眼可见，通常无需进行定量分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用相差显微镜识别停滞在有丝分裂期的细胞，并追踪至其发生有丝分裂滑脱（如步骤3.4和3.6.2所述）。发生滑脱并返回间期的细胞，其荧光将从有丝分裂期间的绿色转变为G1期的红色（图2A-C）。
	<ol>
		<li>通过肉眼观察相差显微镜和落射荧光成像，追踪这些滑脱细胞，以评估其细胞命运（图2D）。
		<ol>
			<li>识别重新进入细胞周期的细胞。此类细胞可通过FUCCI系统中荧光由红变绿的变化来鉴定，该变化指示G1/S期转换（图2A）。</li>
			<li>识别发生G1期细胞周期阻滞的细胞。此类细胞表现为红色荧光持续表达超过&#62;24小时（图2B）。</li>
			<li>识别在间期死亡的细胞。此类细胞可通过相差成像中观察到的细胞破裂、出芽或皱缩来鉴定（图2C）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 视频分析以确定核膜破裂频率
<ol>
	<li>使用表达 H2B-GFP 和 TDRFP-NLS 的 RPE-1 细胞来评估核膜破裂。除了相差成像外，还需同时采集红色荧光（TRITC）和绿色荧光（FITC）图像。每 5 分钟采集一次图像，以观察核膜破裂过程。 
	注意：关键是要构建出 TDRFP-NLS 能高效进入细胞核、且细胞质中荧光信号极微弱的细胞系。</li>
	<li>按照步骤 3.3 至 3.4 所述方法对细胞进行成像。在间期，TDRFP-NLS 荧光信号与 H2B-GFP 应共定位。进入有丝分裂期后（可通过相差光学观察到细胞变圆，和/或通过 H2B-GFP 观察到染色体凝集），核膜将发生崩解，TDRFP-NLS 信号随之扩散至细胞质中（图 3A）。有丝分裂结束后，子代细胞中核膜重新形成，TDRFP-NLS 信号再次回到细胞核内。</li>
	<li>通过活细胞成像持续追踪子代细胞在整个后续间期的过程。通过观察 TDRFP-NLS 从细胞核内短暂地释放到周围细胞质中的现象，识别核膜破裂事件。数分钟内，核膜将被修复，TDRFP-NLS 信号重新回到细胞核中（图 3A）。 
	注意：通常可观察到由 H2B-GFP 标记的核 DNA 从破裂位点向外突出，形成一个小的出芽状结构。</li>
	<li>统计在间期发生核膜破裂事件的细胞核所占比例。计算该比例时，将发生破裂事件的细胞数量除以被追踪的细胞总数。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

长期活细胞成像最关键的方面是确保被成像细胞的健康状态。必须尽量减少细胞暴露于各种额外的环境应激因素，例如温度、湿度和/或CO2浓度的非理想条件。同时，限制荧光激发光照引起的光损伤也非常重要，因为已知成像过程中的光照应激会影响细胞行为50。限制光损伤可通过多种方式实现，具体方法在其他文献中有详细描述48。通常情况下，最佳策略是使用最短的曝光时间，以获得足够明亮的荧光信号，从而有效追踪细胞，进而降低光毒性。然而，如果细胞每10–20分钟才成像一次，则通常可以耐受较长的曝光时间（接近像素饱和水平），尽管这一参数需针对每种荧光染料和细胞类型通过实验确定。由于被成像的细胞对环境和成像相关的应激均敏感，在活细胞成像实验中必须始终设置对照细胞，并对其进行监测，以确认其增殖行为正常。
长期活细胞成像的一个局限性在于，需要为现有显微镜配备能够维持温度和5%加湿CO2环境的培养箱，或配备同样可维持适当温度和气体环境的载台式培养室。虽然持续通入CO2</s...

抗有丝分裂药物长期以来已被用于多种实体瘤的化疗方案中，且通常表现出显著疗效1,2,3。从作用机制上看，这些药物会破坏正常的有丝分裂进程，促使快速增殖的癌细胞发生有丝分裂阻滞。然而，细胞在有丝分裂阻滞后的命运具有高度变异性：一部分细胞会直接从有丝分裂期进入细胞死亡，而另一些细胞则会退出有丝分裂，以四倍体细胞的形式返回间期（该过程称为有丝分裂逃逸）4,5,6,7,8。这些进入间期的细胞可能执行凋亡、发生永久性细胞周期阻滞，甚至重新进入细胞周期4,5,6,7,8,9,10,11。因此，那些通过逃逸进入间期并能在药物去除后重新进入细胞周期的细胞，可能促成癌细胞群体的再次出现。此外，从有丝分裂中逃逸的细胞为四倍体，而四倍体已知可促进染色体不稳定性，进而驱动肿瘤复发12,13,14,15。因此，明确调控抗有丝分裂药物处理后细胞命运的因子，对于优化现有治疗策略至关重要。
在本实验方案中，我们描述了直接观察和研究细胞在抗有丝分裂药物紫杉醇作用下发生长期有丝分裂阻滞命运的方法。紫杉醇是一种临床上已确立的治疗药物，在多种肿瘤类型中均显示出高度疗效，包括乳腺癌、卵巢癌和肺癌16,17,18,19,20。紫杉醇是一种从红豆杉树皮中提取的植物碱，能够稳定微管，从而抑制其动态性21,22。尽管紫杉醇对微管动态性的抑制并不影响细胞从G1期到G2期的细胞周期进程，但该药物会通过阻碍动粒-微管的连接，导致有丝分裂过程中纺锤体组装检查点持续激活（详见综述23,24）25。因此，经紫杉醇处理的细胞无法启动后期，导致长期的有丝分裂阻滞。
本方案将首先介绍在活细胞成像实验中识别有丝分裂细胞的方法。在贴壁培养的组织细胞中，有丝分裂可通过两个明显的细胞生物学变化进行观察。第一，在核膜破裂前，染色体立即发生高度凝缩。虽然使用标准的相差显微镜通常可检测到染色体凝缩现象，但通过荧光标记染色体的标签可更清晰地检测该过程。例如 荧光标记的组蛋白）。其次，有丝分裂细胞还可通过细胞变圆所引起的显著形态学变化来识别。
本方案将演示如何利用活细胞成像技术来追踪经历长期有丝分裂阻滞的细胞命运。阻滞在有丝分裂期的细胞会经历三种不同的命运之一。第一，细胞可能在有丝分裂过程中发生细胞死亡。这一现象可通过光学显微镜清晰观察到，因为正在死亡的细胞会出现收缩、起泡和/或破裂。第二，细胞可能退出有丝分裂并返回间期，而不发生染色体分离或胞质分裂，此过程称为有丝分裂滑脱（mitotic slippage）。染色体去凝集和/或有丝分裂细胞变扁平可明确识别该过程。从有丝分裂滑脱的细胞通常还表现出不规则的多叶状细胞核，并常含有多个微核5。第三，阻滞在有丝分裂的细胞可能在经历较长延迟后启动后期并完成有丝分裂。尽管在较高药物浓度下这种情况较少见，但该行为提示这些被阻滞的细胞可能已满足纺锤体组装检查点，或该检查点功能部分减弱或存在缺陷。通过活细胞成像观察染色体分离及随后的胞质分裂，可直观识别后期的启动。
本文还将介绍用于追踪通过有丝分裂滑脱（mitotic slippage）逃逸有丝分裂期细胞死亡的细胞命运的活细胞成像方法。经历有丝分裂滑脱的细胞，可能在随后的间期死亡，或触发持久的G1期细胞周期阻滞，或重新进入细胞周期并启动新一轮细胞分裂4。本文将描述一种利用FUCCI（基于荧光泛素化的细胞周期指示系统，fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator）的方法，用于确定在有丝分裂滑脱后重新进入细胞周期的细胞比例。FUCCI系统可直接可视化G1/S期转换，并可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）的长期活细胞成像26,27。该系统利用两种荧光标记蛋白——人源Cdt1（hCdt1，染色质许可与DNA复制因子1）和人源Geminin（hGeminin）的截短形式，其蛋白水平随细胞周期时相呈周期性波动。与红色荧光蛋白融合的hCdt1在G1期高水平表达，促进DNA复制的启动许可；而在S/G2/M期，该蛋白被E3泛素连接酶SCFSkp2泛素化并降解，以防止DNA的重复复制26。相反，与绿色荧光蛋白融合的hGeminin是hCdt1的抑制因子，其水平在S/G2/M期达到峰值，而在有丝分裂末期及整个G1期被E3泛素连接酶APCCdh1泛素化并降解26。因此，FUCCI系统可提供直观的荧光信号以指示细胞周期时相：细胞在G1期呈现红色荧光，在S/G2/M期呈现绿色荧光。相较于其他识别增殖细胞的方法（如溴脱氧尿苷染色），FUCCI是一项重要进步，因其无需固定细胞，且可在无需额外药物处理以同步细胞群体的情况下实现单细胞水平的成像。尽管本实验方案未予详述，但目前已开发出其他多种活细胞传感器用于监测细胞周期进程，包括用于G1期的解旋酶B传感器28、用于S期的DNA连接酶-RFP传感器29和PCDNA-GFP传感器30，以及近期开发的FUCCI-4传感器，可检测细胞周期的所有阶段31。
最后，将介绍一种用于检测核膜破裂的活细胞成像方法。近期研究表明，癌细胞的核膜不稳定，容易发生破裂，从而导致核质与细胞质内容物相互混合。这一现象被称为核膜破裂，可促进DNA损伤并激活先天免疫反应32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44。尽管核膜破裂的根本原因尚未完全阐明，但已知核结构的形变与核膜破裂发生频率升高相关42。紫杉醇处理的一个广为人知的效应是，在有丝分裂后产生显著异常的核结构；因此，本文将描述一种利用活细胞成像来定量核膜破裂的方法，并进一步探讨紫杉醇处理是否会增加核膜破裂事件的发生频率。核膜破裂可通过观察到核靶向荧光蛋白从细胞核泄漏至细胞质来检测（例如，串联二聚体重复的RFP与核定位信号融合的蛋白，TDRFP-NLS）。这种泄漏在显微镜下肉眼即可清晰识别，从而实现对破裂事件的简便定量。
本方案需要配备编码载物台和自动对焦软件的宽场落射荧光显微镜。编码载物台可实现向指定X-Y坐标的精确定位自动移动，而自动对焦软件可在整个成像期间保持细胞处于焦点状态。此外，本方案还需要配备将细胞维持在37 °C并提供加湿5% CO2环境的设备。这可以通过将整个显微镜置于温控和气控环境中实现，也可以通过使用载物台顶部的局部温控和环境控制装置来实现。本方案中使用的相差物镜为10倍平场荧光物镜，数值孔径为0.30。然而，20倍物镜也足以在单个焦平面上识别出呈圆形的有丝分裂细胞和扁平的间期细胞。如果进行相差成像（如本方法所述），盖玻片可以是玻璃或塑料材质。如果使用微分干涉差（DIC）显微镜，则必须使用玻璃盖玻片，以防止光的去偏振化。

<table><tbody><tr><td>无酚红DMEM:F12培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH3027202</td><td></td></tr><tr><td>10% 胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>100 IU/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gemini</td><td>50-753-3104</td><td></td></tr><tr><td>12孔玻璃底成像培养皿</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>TSZ Chem</td><td>RS036</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>NC0215085</td><td></td></tr><tr><td>环境培养室</td><td>In Vivo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7432000201</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 聚苯乙烯组织培养板</td><td>Falcon</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 一次性移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>5804R 15安培离心机</td><td>Eppendorf</td><td>97007-370</td><td></td></tr><tr><td>1000 微升移液器</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>20 微升移液器</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器吸头</td><td>Sharp</td><td>p1126</td><td></td></tr><tr><td>p20 移液器吸头</td><td>Sharp</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170S 培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>CO17011005</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy 移液辅助器</td><td>Integra</td><td>156401</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>用于活细胞成像的Nikon Ti-E-PFS倒置显微镜</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Prior X-Y 载物台系统与白光LED照明器</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H117P1N4</td><td></td></tr><tr><td>带编码器的Prior Proscan 3 XYZ控制器</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H31XYZE</td><td></td></tr><tr><td>Andor 数字相机</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>D10NLC</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements AR 软件</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>用于荧光成像的SOLA LED照明器</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>带CO2流量控制的InVivo环境培养室</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>Ti-IVS-100</td><td></td></tr><tr><td>Ti-ND6-PFS 电动物镜转盘（完美聚焦系统）</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEP59391</td><td></td></tr><tr><td>Ti-C 系统聚光镜转盘</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEL51000</td><td></td></tr><tr><td>用于系统聚光镜转盘的Ti-C LWD长工作距离镜头组件</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEL56200</td><td></td></tr><tr><td>Te-C LWD Ph1 模块</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEH41100</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor DLL 10X 物镜，数值孔径0.3，工作距离16 mm</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MRH10101</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM 物镜</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MRH48230</td><td></td></tr></tbody></table>

长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

活细胞成像是一种强大的技术，可用于在长时间内直接观察单个细胞中的生物学现象。在过去十年中，新兴且创新的技术显著提升了活细胞成像的实用性。如今，细胞可在维持37 °C和5% CO2的细胞培养条件下保持聚焦并持续成像数天。此外，可同时获取代表不同实验条件的多个视野图像，从而提供高通量的实验数据。与固定细胞成像相比，活细胞成像具有显著优势，能够直接可视化并进行动态细胞事件的时间定量分析。活细胞成像还能识别单个细胞行为的差异，而这些差异在基于群体的检测中可能被忽略。本文中，我们描述了通过活细胞成像评估细胞在抗有丝分裂药物紫杉醇处理后命运决定的实验方案。我们展示了可视化有丝分裂阻滞细胞是直接从有丝分裂死亡还是滑脱回间期的方法。我们还介绍了如何利用基于荧光泛素化的细胞周期指示系统（FUCCI）来评估由有丝分裂滑脱产生的间期细胞中能够重新进入细胞周期的比例。最后，我们描述了一种用于识别核膜破裂事件的活细胞成像方法。

采用上述方案，对表达 H2B-GFP 的 RPE-1 细胞用抗有丝分裂药物或对照溶剂（DMSO）处理，并通过活细胞成像进行分析。分析结果显示，100% 的对照组有丝分裂 RPE-1 细胞在进入有丝分裂后平均 22 分钟启动后期（图 1A，1D）。相比之下，经紫杉醇处理的 RPE-1 细胞表现出显著的有丝分裂阻滞，持续数小时（图 1D）。成像结果显示，48% 的有丝分裂阻滞细胞发生了有丝分裂期细胞死亡（图 1B，1E），而其余 52% 的细胞则发生了有丝分裂逃逸（图 1C，1E）。
为评估经历有丝分裂滑脱的RPE-1细...

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。

活细胞成像是一种强大的技术，可用于在较长时间内直接观察单个细胞中的生物学现象。

本实验的总体目标是利用活细胞成像技术，评估细胞在抗有丝分裂药物紫杉醇处理后命运决定的过程。该方法使我们能够直观观察单个细胞对不同浓度抗有丝分裂药物紫杉醇的反应。该技术的主要优势在于，它能够提供关于单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息是固定细胞成像或基于群体的检测方法所无法获得的。本方法由Ganem实验室的医学博士/哲学博士在读生Marc Vittoria进行示范。首先，使用光学清洁剂清洗成像培养皿的玻璃底部，以去除可能干扰成像的指纹或灰尘。使用足量的光学清洁剂，使整个玻璃表面充分润湿。将带有细胞的玻璃底培养皿放入显微镜载物台上的成像培养皿适配器中。移除培养皿的塑料盖，并用带玻璃盖的培养 chamber 覆盖培养皿。确保该 chamber 配有阀门，以允许持续通入含 5% 二氧化碳的空气。为了使5%二氧化碳气体加湿，需将气体通过插入无菌水浴容器中的管路。这可使气体达到95%的湿度平衡。使用控制显微镜的软件程序启动并校准编码载物台。这将确保精确的 XY 坐标并防止焦平面漂移。接下来，通过升高聚光镜并关闭光圈使视野变暗来进行科勒照明。降低聚光镜，直到可见清晰的六边形光斑。然后，使用调中螺丝将视野中的六边形光斑居中。当六边形形状可见后，打开光圈，直至整个视野被均匀照亮。启动显微镜的自动对焦功能，以确保在整个实验过程中所有观察点均保持清晰对焦。使用采集软件从每个孔中选择多个无重叠的视野进行成像。选择细胞已良好贴附于玻璃底部且融合度在50%至70%之间的成像区域。避免选择成团的细胞区域，因为这将使后续分析变得困难。为了评估有丝分裂细胞的命运，将成像软件设置为每10分钟对每个选定的视野采集一次图像，持续最长96小时。正常的有丝分裂持续20至40分钟，因此每10分钟的间隔足以提供足够的采样频率来确定细胞分裂的时刻。为了识别核破裂这一短暂事件，应每5分钟采集一次图像。通过相差光学显微镜观察细胞变圆，和/或使用与绿色荧光蛋白（GFP）融合的人组蛋白H2B观察染色体凝集，来识别进入有丝分裂的细胞。细胞变圆和染色体凝集均可通过肉眼清晰观察。标注细胞进入有丝分裂的时间。持续追踪细胞直至其命运确定。对照细胞应能高效地排列染色体，并在一小时内进入分裂后期。可通过相差显微镜观察到细胞开始向中间收缩形成两个子细胞，或通过观察带有H2B-GFP标记的染色体向两极移动的现象，来识别分裂后期。标注细胞进入后期的时间点。相比之下，经紫杉醇处理的细胞将保持圆形，并伴有凝缩染色体，持续数小时。识别发生有丝分裂阻滞并经历细胞死亡的细胞。通过相差显微镜可观察到在有丝分裂过程中死亡的细胞，这些细胞会出现起泡、收缩和/或破裂现象。若使用H2B-GFP成像，细胞死亡过程中染色体也会发生断裂。请识别发生有丝分裂阻滞并经历细胞滑脱的细胞。通过相差显微镜观察经历有丝分裂滑脱的细胞，这些细胞会变平并重新进入间期，且在未经历后期的情况下解凝染色体。这些细胞将产生体积较大的四倍体细胞，通常为多核细胞。继续追踪原始视野中的细胞。完成整个视野的追踪后，切换至从同一孔中获取的另一个视野，并继续追踪细胞。利用表达FUCCI系统的非转化且染色体稳定的视网膜色素上皮细胞系，评估有丝分裂逃逸后的细胞命运。为确认FUCCI系统正常工作，需通过活细胞成像数据的分析，验证对照细胞中红色和绿色荧光蛋白的表达是否按预期交替出现。对照细胞在从G1期进入S期的过程中，应于间期由完全的细胞核红色荧光转变为完全的细胞核绿色荧光。细胞在完成有丝分裂的整个过程中应持续显示绿色荧光。有丝分裂结束后，细胞在间期应再次表现出完全的红色荧光。使用相差显微镜鉴定停滞在有丝分裂期的细胞，并追踪这些细胞直至其发生有丝分裂滑脱。从有丝分裂滑脱并返回间期的细胞会从有丝分裂期间显示的绿色荧光转变为G1期的红色荧光。通过相差显微镜和落射荧光成像目视追踪这些滑脱的细胞，以评估其细胞命运。鉴定重新进入细胞周期的细胞。这些细胞可通过FUCCI系统中荧光表达由红色变为绿色来识别，该变化指示细胞处于G1/S期转换阶段。鉴定发生G1期细胞周期阻滞的细胞。通过表达持续超过24小时的红色荧光来鉴定这些细胞。同时，鉴定在间期死亡的细胞。这些细胞可通过相差成像观察到细胞破裂、起泡和收缩来识别。以之前的方法对细胞进行成像。在间期，融合了核定位信号的串联二聚体重复RFP（TDRFP-NLS）与H2B-GFP的荧光信号应共定位。通过相差光学观察细胞变圆，和/或通过H2B-GFP观察染色体凝集，可对有丝分裂进行可视化。有丝分裂过程中，核膜将解体，TDRFP-NLS 信号将转为细胞质内分布。有丝分裂结束后，子细胞中核膜重新形成，TDRFP-NLS 信号将再次定位于细胞核内。通过活细胞成像技术，在后续的间期持续追踪子细胞。通过观察细胞核定位的TDRFP-NLS短暂地爆发性释放到周围细胞质中，来识别细胞核破裂事件。数分钟内，核膜将被修复，TDRFP-NLS会重新回到细胞核内。图中显示的是一个典型的细胞在从紫杉醇处理中逃逸后变绿并进入S期的图像。大多数从紫杉醇处理中逃逸的细胞会经历G1/G0期阻滞，并保持红色超过48小时而不发生凋亡。在逃逸后呈红色的细胞最终也会发生凋亡，如本图像所示。紫杉醇处理的细胞中核膜破裂现象增加。经10纳摩尔紫杉醇处理的TDRFP-NLS和H2B-GFP细胞表现出增加的核破裂现象，其中RFP会从细胞核去定位至细胞质中的间期细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行长期活细胞成像，以评估细胞在不同药物处理下的命运变化。

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