银纳米颗粒修饰的多壁碳纳米管的合成及其抗菌活性与细胞毒性评估

本实验的总体目标是制备由碳纳米管表面原位合成银纳米颗粒所构成的抗菌纳米复合物。该方法可用于开发新型细菌用纳米材料，这类材料对人体具有较低毒性，同时对多种细菌及生物膜具有强效抑菌性能。本方案描述了在保持纳米复合物对人体生物相容性的前提下，评估其清除细菌效果的实验流程。

开始实验时，将30至50毫克多壁碳纳米管（MWCNTs）放入一个50毫升的小瓶中。使用配备1毫升吸头的微量移液器，缓慢加入8毫升体积比为3:1的浓硫酸与浓硝酸混合溶液至多壁碳纳米管中。等待30分钟，待放热反应结束后，将溶液在60至80摄氏度、160瓦条件下超声处理，直至多壁碳纳米管沉降至小瓶底部，通常需要约1小时。

将混合物转移至离心管中。使用微量移液器小心地将30毫升蒸馏水逐滴加入羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）中，必要时暂停操作以使混合物冷却。随后，将混合物在12,000 ×g条件下离心15分钟。

用带有1 mL吸头的移液器吸除上清液。向沉淀中加入5 mL乙醇，并用额外的乙醇冲洗离心管管壁。再次以相同条件离心混合物，并用pH试纸检测上清液的pH值。

继续通过离心法用乙醇洗涤固体，直至上清液pH呈中性，然后移除上清液，并向沉淀中加入1毫升蒸馏水。将羧基功能化的多壁碳纳米管（MWCNTs）分散于水中，并在真空条件下于-60摄氏度冷冻干燥该分散液。取10毫克冻干的羧基功能化多壁碳纳米管（MWCNTs）置于50毫升锥形离心管中。

向试管中加入 30 毫升蒸馏水。在另一个 50 毫升锥形管中，混合 6 毫升 0.1 当量的硝酸银和 18 毫升蒸馏水。将两种混合物在 60 摄氏度、160 瓦条件下超声处理一小时。

然后，在持续对MWCNT分散液于60摄氏度、160瓦功率下进行超声处理的同时，使用配备1毫升吸头的移液器将硝酸银溶液逐滴加入MWCNT分散液中。加样完成后，继续超声处理混合物1小时，随后在室温下以12,000 G离心15分钟，并弃去上清液。通过在24摄氏度下超声处理30分钟，将银修饰的MWCNT重新分散于30毫升蒸馏水中。

在30毫升蒸馏水中重复离心并去除上清液两次。随后，将洗涤后的银修饰多壁碳纳米管在1毫升蒸馏水中通过超声分散5分钟。向该分散液中加入5毫升乙醇，并在室温下搅拌混合物1小时。

然后在室温下以12,000 G离心混合物15分钟，并检测上清液的pH值。弃去上清液，通过涡旋振荡将沉淀物重新悬浮于5毫升乙醇中。继续通过离心用乙醇洗涤沉淀物，直至上清液pH呈中性。

最后，将洗涤后的银修饰多壁碳纳米管分散于1毫升蒸馏水中。在真空条件下，于-70摄氏度冷冻干燥24小时，并将所得分散液储存于密封容器中。开始准备实验时，将18.12克R2A琼脂与1升蒸馏水混合并进行高压灭菌。

将凝胶在室温下冷却。当凝胶准备就绪后，将10毫升凝胶倒入90毫米的培养皿中，并让琼脂凝固。在通风橱中，使用经酒精火焰灭菌的接种环和接种针，在培养基表面划线接种100微升甲基杆菌属（Methylobacterium）菌种混合物。

将培养皿在30摄氏度下孵育48小时，然后将3.12克R2A肉汤与一升蒸馏水混合，并在121摄氏度下高压灭菌15分钟。使用灭菌的接种环和接种针将菌落转移至R2A生长培养基中。将样品置于摇床培养箱中，在30摄氏度、180 RPM条件下孵育。

每小时测量一次600纳米处的光密度，直至光密度大于0.7。接着，准备另一块含有10毫升R2A琼脂的培养皿。然后将3.12克R2A肉汤和8克琼脂与1升蒸馏水混合。

在121摄氏度下高压灭菌该混合物15分钟。将100微升的甲基杆菌培养物加入琼脂混合物中。将含有甲基杆菌的凝胶10毫升倒入培养皿中R2A琼脂底层上，然后在蒸馏水中制备所需浓度的冻干银多壁碳纳米管分散液。

使用微量移液器将 50 微升该分散液加样到一个 6×1 毫米的无菌纸片上。另取一个无菌纸片，加入蒸馏水作为对照。将两个纸片置于真空室中，在紫外光下干燥并灭菌 30 分钟。

然后将银修饰的多壁碳纳米管样品和对照样品放置在琼脂培养基上，于30摄氏度培养48小时。培养结束后，测量银修饰的多壁碳纳米管样品周围的抑菌圈大小。试验前，将三蒸水在121摄氏度下高压灭菌15分钟。

在无菌水中配制浓度为1000微克/毫升的羧基功能化多壁碳纳米管分散液，以及浓度分别为50微克/毫升、40微克/毫升和30微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液。开始进行抗菌测试时，按先前所述方法制备甲基杆菌培养物，并在600纳米波长下监测其光密度。当光密度达到最大值时，将100微升甲基杆菌培养物接种至3毫升新鲜R2A培养基中。

将500微升该溶液分别加入五个15毫升锥形管中。向其中一根管中加入100微升甲醇，以制备甲醇参考样品。以相同方式制备其余四种分散液的样品。

将样品和剩余的甲基杆菌对照培养物在180 rpm、30°C条件下振荡培养，直至对照组的光密度显示达到最大活性。使用无菌涂布棒将每个样品涂布于培养皿中的固体R2A琼脂凝胶表面。将培养皿在30°C条件下培养48小时。

计数获得的细菌菌落，并确定最小杀菌浓度。采用所述方法成功合成了银多壁碳纳米管（Silver MWCNTs）。沉积的银颗粒平均尺寸约为3.83纳米。

当使用50 微克/毫升或40 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液培养时，未观察到甲基杆菌的生长。当使用30 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液培养时，细菌数量较对照样品减少了100,000倍。在由10 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液制备的样品周围观察到抑菌圈。

由1微克/毫升分散液制备的样品未观察到抑菌圈。当加入40微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液时，观察到一定的细胞毒性。当加入30微克/毫升的分散液时，未观察到显著的细胞毒性。

台盼蓝实验确认，当加入每毫升30微克的银多壁碳纳米管分散液时，细胞毒性极低。本方案将有助于研究人员制备含有直接作用于碳纳米材料的金属纳米颗粒的纳米复合物。按照本方案，研究人员还能够评估所制备纳米复合物的抗菌性能。