Name: 银纳米粒子改性多壁碳纳米管的合成及其抗菌活性和细胞毒性的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习利用多壁碳纳米管与银纳米粒子合成抗菌纳米复合物的方法，评估其对细菌的杀灭效果及对人体细胞的低毒性，为开发安全高效的医用抗菌材料提供实验基础。

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本研究由中央大学研究基金（2016年）以及韩国国家研究基金会（NRF）通过科学技术信息通信部资助的纳米材料技术开发项目（编号：2017M3A7B8061942）支持。

1. MWCNT 氧化
<ol>
	<li>称取 30 - 50 mg 多壁碳纳米管（MWCNT）至 50 mL 样品瓶中。使用 1 mL 移液枪头，缓慢加入 8 mL 浓度为 90%（初始浓度）、体积比为 3:1 的 H2SO4:HNO3 溶液。 
	注意：该操作必须在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>静置 30 分钟，使放热反应完全结束。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将溶液在 60 - 80 °C、160 W 条件下超声处理 1 小时，直至多壁碳纳米管沉降至瓶底。 
	注意：超声仪中的水位应低于样品瓶顶部，以防止水进入瓶内。</li>
	<li>将溶液转移至离心管中。
	<ol>
		<li>使用微量移液器，逐滴加入 30 mL 去离子水至 MWCNT-COOH 溶液中。 
		注意：加入去离子水时会发生强烈放热反应。应缓慢加入，并留出足够冷却时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 MWCNT-COOH 溶液在 12,000 × g、室温条件下离心 15 分钟。 
	注意：操作离心机时，应确保离心机保持平衡，需在样品管对称位置放置重量相同的对照管。</li>
	<li>用移液器和 1 mL 移液枪头吸除上清液。加入 5 mL 乙醇，并用额外乙醇冲洗瓶壁。再次在 12,000 × g、室温条件下离心 15 分钟。
	<ol>
		<li>用 pH 试纸测定上清液的 pH 值。重复洗涤和离心操作，直至上清液呈中性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完全去除上清液。加入 1 mL 去离子水，使 MWCNT-COOH 沉淀并均匀分散于溶液中。在 -60 °C 下真空冷冻干燥至完全干燥。</li>
</ol>
2. 多壁碳纳米管上的银纳米颗粒沉积
<ol>
	<li>取10 mg MWCNT-COOH置于50 mL锥形管中，加入30 mL蒸馏水稀释。在60 °C、160 W条件下超声处理溶液1小时。</li>
	<li>取6 mL 0.1 N AgNO3置于50 mL锥形管中，加入18 mL蒸馏水稀释。在60 °C、160 W条件下超声处理溶液1小时。 
	注意：AgNO3的添加量应与MWCNTs的总质量成比例，确保Ag的总质量不超过20%。</li>
	<li>在60 °C、160 W超声条件下，用移液器和1 mL移液器吸头将AgNO3溶液逐滴加入MWCNTs溶液中。加完AgNO3后继续超声处理1小时。</li>
	<li>将溶液在12,000 × g、室温条件下离心15分钟，弃去上清液。再重复离心并弃去上清液两次。</li>
	<li>向Ag-MWCNTs混合物中加入1 mL蒸馏水，使沉淀均匀分散于溶液中。加入5 mL乙醇，在室温下反应1小时。</li>
	<li>将溶液在12,000 × g、室温条件下离心15分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用pH试纸测定上清液的pH值。重复洗涤和离心操作，直至上清液呈中性。</li>
	<li>向Ag-MWCNTs中加入1 mL蒸馏水，使产物均匀分散于溶液中。在-70 °C下真空冷冻干燥24小时。</li>
</ol>
3. 抑菌圈试验
<ol>
	<li>在烧瓶中混合 18.12 g R2A 琼脂和 1 L 蒸馏水。将混合物在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。</li>
	<li>让凝胶在室温下冷却。在凝固前将 10 mL 凝胶倒入培养皿中，以制备固体培养基。</li>
	<li>将 100 µL 细菌接种到固体培养基上。使用涂布棒将细菌均匀涂布在固体培养基表面。 
	注意：该操作必须在点燃酒精灯的通风橱内进行。</li>
	<li>将培养皿在 30 °C 下培养 48 小时。</li>
	<li>在烧瓶中混合 3.12 g R2A 肉汤和 1 L 蒸馏水。将混合物在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。</li>
	<li>用接种环和接种针将生长的菌落转移至液体培养基中，并在 180 rpm 和 30 °C 条件下于培养箱中培养。</li>
	<li>通过紫外分光光度法在 600 nm 处每小时记录一次 OD（光密度）值，以测定细菌生长情况。 
	注：本实验使用 R2A 琼脂而非标准的 Mueller-Hinton 琼脂，因为 R2A 是 Methylobacterium spp. 生长的优选琼脂。</li>
	<li>将 10 mL 制备好的 R2A 琼脂加入培养皿中，制备底层琼脂。
	<ol>
		<li>将 3.12 g R2A 肉汤和 8 g 琼脂与 1 L 蒸馏水混合。将混合物在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。将 10 mL 该凝胶加到底层琼脂上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用微量移液器将 50 µL Ag-MWCNTs 溶液加到无菌纸片上。
	<ol>
		<li>将 Ag-MWCNTs 样品置于真空腔中，在紫外光下干燥并灭菌 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Ag-MWCNTs 样品放置在琼脂表面。</li>
	<li>将琼脂平板在 30 °C 下培养 48 小时。</li>
	<li>测量抑菌圈直径12。 
	注：所用软件的操作说明见参考文献。</li>
</ol>
4. 抗菌测试
<ol>
	<li>重复步骤 3.1 至 3.7 以制备细菌培养物。</li>
	<li>在最大 OD 值时，使用移液器和 100-µL 微量移液器吸头将 100 µL 细菌接种到 3 mL 新鲜液体培养基中。</li>
	<li>在 15-mL 锥形管中制备五份 50 µL 的对照溶液样品。向每根管中分别加入以下物质：1）甲醇；2）1000 µg/mL MWCNT-COOH；3）50 µg/mL Ag-MWCNTs；4）40 µg/mL Ag-MWMWCNTs；5）30 µg/mL Ag-MWCNTs。</li>
	<li>在 180 rpm 和 30 °C 条件下孵育，直至通过上述所述的紫外分光光度法测定对照组达到最大活性。</li>
	<li>测定每个样品的 OD 值并计算 MIC 浓度。OD 值与样品肉汤中的细菌细胞数量直接相关。</li>
	<li>使用涂布棒将培养的细菌涂布于固体培养基上。</li>
	<li>将培养皿在 30 °C 下孵育 48 小时。</li>
	<li>计数细菌菌落并测定 CFU 值以评估抗菌活性12。 
	注意：所用软件的操作说明见参考文献。</li>
</ol>
5. 活性检测
<ol>
	<li>从培养箱中取出培养细胞后，吸除培养基，并用 5 mL PBS 逐滴清洗三次。</li>
	<li>向清洗后的细胞中加入 1 mL 含 PBS 的胰蛋白酶-EDTA 溶液，作用 1 分钟后吸除。
	<ol>
		<li>轻拍培养皿以使贴壁细胞脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 5 mL DMEM（达尔伯克改良伊格尔培养基），然后收集细胞。以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。
	<ol>
		<li>加入 1 mL DPBS 并混匀。</li>
		<li>取 10 µL 溶液，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。 
		注意：所用细胞计数仪的操作说明见参考文献13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每孔 1 × 105 个 AML12 细胞接种至六孔板中，孔内含 DMEM 溶液。培养基中含有 10%（v/v）胎牛血清和 1% 无菌抗生素。</li>
	<li>将六孔板置于 37 °C、5% CO2/95% 空气环境中孵育 8&#160;- 12 小时。</li>
	<li>用移液器吸除各孔中的上清液。
	<ol>
		<li>将各组样品（对照组、NMS-DMSO（二甲基亚砜）和 30-40 µg/mL Ag-MWCNT）分别加入 1 mL DMEM 中。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2/95% 空气环境中孵育 8 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液，并用 5 mL PBS 清洗样品。</li>
	<li>将 1 mL 配制好的活/死细胞检测试剂（在 10 mL PBS 中加入 20 µL 2 mM EthD-1 和 5 µL 4 mM calcein AM 的 DMSO 溶液）逐滴加入细胞中。</li>
	<li>室温孵育 30 - 45 分钟，或 37 °C 孵育 10 分钟。使用标准荧光显微镜在 100X 或 300X 下检测荧光信号。</li>
</ol>
6. 台盼蓝染色法
<ol>
	<li>按照上述步骤 5.1 至 5.6.2 准备样品。</li>
	<li>移除上清液。</li>
	<li>用 1 mL 的 1× DPBS 洗涤培养板，然后倾倒弃去。</li>
	<li>向培养板中加入 1 mL 胰蛋白酶，孵育 3 分钟以使细胞从培养表面脱落。用细胞培养基洗涤培养板并收集细胞，将收集的细胞置于 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 200 × g 和 4 °C 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 mL 新鲜培养基，并重新分散细胞。</li>
	<li>取 10 µL 台盼蓝与 10 µL 分散的细胞混合，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。 
	注意：所用细胞计数仪的操作说明详见参考文献。</li>
</ol>

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<li>NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from:
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种在多壁碳纳米管（MWCNTs）上沉积银纳米颗粒的简单制备方法。这种含银纳米材料表现出显著的抗菌活性，且在体内对银纳米颗粒的非受控吸收潜力极低。我们证明，30 µg/mL 的合成 Ag-MWCNTs 对 Methylobacterium spp. 具有有效的抗菌作用，同时对哺乳动物肝细胞的细胞毒性可忽略不计。尽管在商业化推广之前仍需对 Ag-MWCNTs 进行进一步优化和生物安全性评估，但使用乙醇作为还原剂有助于生产环境友好且成本低廉的 Ag-MWCNTs。
以下几点得到了证实：利用所开发的纳米材料可以杀灭多种类型的细菌。可以在纳米管表面设计多个位点，用于沉积银纳米颗粒。通过控制沉积在表面的银纳米颗粒的尺寸和数量，还可以定制其抗菌性能。所开发的纳米材料对细菌细胞具有毒性，但在适当浓度下对人类和动物细胞无毒。
现提出以下抗菌作用机制：Ag-MWCNT 纳米结构直接接触细菌细胞表面，破坏细胞壁，并引发活性氧物种的次级氧化反应，这些过程共同导致氧化应激。已证实 Ag-MWCNT 纳米结构可释放银离子，抑...

本研究的最终目标是开发出环境友好的抗菌纳米材料，以抑制形成生物膜的细菌的生长。这些抗菌纳米材料有望克服常用化学物质或抗生素类化合物所存在的毒性和抗生素耐药性问题。生物膜是一种含水的胞外聚合物基质（EPS），由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成1,2。生物膜可阻止外来物质侵入，并促进细菌旺盛生长3,4。生物膜会导致异味以及慢性感染性疾病5,6。Methylobacterium spp. 例如，可在长期有水存在或难以持续彻底灭菌的场所（如空调热交换器、淋浴间和医疗器械）附着生长。此类生物膜会引起异味和慢性感染性疾病5,6。
通常使用化学物质或抗生素类化合物来抑制形成生物膜的细菌的生长。由于耐药细菌的出现以及对化学物质在活体（in vivo）中安全性的担忧，亟需开发新型材料以防止生物膜的形成并抑制细菌生长。
本研究合成了无抗生素耐药性和毒性的抗菌纳米材料。银是一种广为人知的抗菌物质，近年来纳米科学与纳米技术的发展推动了金属纳米颗粒抗菌效应的广泛研究7,8。近期研究表明，纳米颗粒的小尺寸和高比表面积可增强其抗菌活性9,10,11。
本文介绍的纳米材料将具有增强抗菌性能的银纳米颗粒与高长径比的碳纳米管相结合，从而增加了单位体积的表面积。所制备的银纳米颗粒-碳纳米管复合材料表现出显著的抗菌性能，同时对人类和动物细胞的毒性极低。以往研究中的合成过程使用了诸如NaBH4、甲酰胺、二甲基甲酰胺和肼等有害还原剂，该方法复杂、危险且耗时。本文报道的合成过程采用乙醇作为显著更安全的还原剂。
测定了Ag-MWCNTs的抑菌圈和最小杀菌浓度（MBC）；采用活/死细胞染色和台盼蓝染色法评估其毒性和抗菌性能。由于碳纳米管具有特殊颜色，可能干扰检测结果，因此未进行最小抑菌浓度（MIC）和线粒体毒性（MTT）实验。最后，确定了在不影响哺乳动物细胞的前提下抑制Methylobacterium spp.生长的最低浓度。

<table><tbody><tr><td>0.1 N 硝酸银</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>1090811000</td><td></td></tr><tr><td>碳纳米管，多壁</td><td>东京化成工业株式会社</td><td>308068-56-6</td><td></td></tr><tr><td>R2A 琼脂</td><td>MBcell</td><td>MB-R1129</td><td></td></tr><tr><td>R2A 肉汤</td><td>MBcell</td><td>MB-R2230</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Methylobacterium spp.&lt;/em&gt;</td><td>韩国典型培养物保藏中心</td><td>12618</td><td>来自韩国大田市韩国典型培养物保藏中心（Korea Collection for Type Cultures）12618，大田，韩国</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞成像试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>AML12</td><td></td><td></td><td>来自韩国忠南大学，大田，韩国</td></tr><tr><td>人外周血单个核细胞（PBMC）</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>PCS-800-011</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>日本电子株式会社</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>X射线衍射仪（XRD）</td><td>理学株式会社</td><td>D/MAX 2500</td><td>Cu K 射线源（40&lt;em&gt;k&lt;/em&gt;V，100 mA）</td></tr><tr><td>JuLI Br</td><td>纳米恩泰克公司</td><td>JULI-BRSC&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

银纳米颗粒修饰的多壁碳纳米管的合成及其抗菌活性与细胞毒性评估

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

在本研究中，多壁碳纳米管（MWCNTs）经硫酸水溶液处理，形成含氧官能团。通过在氧化后的MWCNTs上将AgNO3水溶液中的银离子进行还原沉积，制备了载银MWCNTs。由于碳纳米管具有独特的颜色，无法将其直接用于最小抑菌浓度或线粒体毒性检测来评估其毒性和抗菌性能，因其颜色会干扰检测结果。因此，通过测定Ag-MWCNTs的抑菌圈和最小杀菌浓度，并采用活/死细胞染色法和台盼蓝染色法，在不受碳纳米管颜色干扰的情况下评估其毒性和抗菌特性。

透射电子显微镜（TEM）图像证实了Ag-MWCNTs的形成（图1A 和1B）。通过表面电荷的变化确认了其成功合成。计算了沉积在MWCNTs上的Ag颗粒的尺寸（图1C）。平均粒径约为3.83 nm。所合成的Ag-MWCNTs的XRD图谱如图所示 图1D20 处的峰 30° 对应于MWCNT；其余峰对应于Ag。抗菌活性数据如图所示 图2细菌菌落群体通过以下方法确认： 甲基杆菌属 对照（图 2A）；添加甲醇使群体减少了103 次（图2B），加入MWCNT-COOH使群体数量减少了108 次（<strong class="xfig"...

本研究通过多壁碳纳米管的酸性氧化反应，随后还原沉积银纳米颗粒，合成了抗菌纳米材料。使用所制备的纳米材料进行了抗菌活性和细胞毒性测试。

在本研究中，多壁碳纳米管（MWCNTs）经水性硫酸溶液处理，以形成含氧官能团。银……

本实验的总体目标是制备由碳纳米管表面原位合成银纳米颗粒所构成的抗菌纳米复合物。该方法可用于开发新型细菌用纳米材料，这类材料对人体具有较低毒性，同时对多种细菌及生物膜具有强效抑菌性能。本方案描述了在保持纳米复合物对人体生物相容性的前提下，评估其清除细菌效果的实验流程。开始实验时，将30至50毫克多壁碳纳米管（MWCNTs）放入一个50毫升的小瓶中。使用配备1毫升吸头的微量移液器，缓慢加入8毫升体积比为3:1的浓硫酸与浓硝酸混合溶液至多壁碳纳米管中。等待30分钟，待放热反应结束后，将溶液在60至80摄氏度、160瓦条件下超声处理，直至多壁碳纳米管沉降至小瓶底部，通常需要约1小时。将混合物转移至离心管中。使用微量移液器小心地将30毫升蒸馏水逐滴加入羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）中，必要时暂停操作以使混合物冷却。随后，将混合物在12,000 ×g条件下离心15分钟。用带有1 mL吸头的移液器吸除上清液。向沉淀中加入5 mL乙醇，并用额外的乙醇冲洗离心管管壁。再次以相同条件离心混合物，并用pH试纸检测上清液的pH值。继续通过离心法用乙醇洗涤固体，直至上清液pH呈中性，然后移除上清液，并向沉淀中加入1毫升蒸馏水。将羧基功能化的多壁碳纳米管（MWCNTs）分散于水中，并在真空条件下于-60摄氏度冷冻干燥该分散液。取10毫克冻干的羧基功能化多壁碳纳米管（MWCNTs）置于50毫升锥形离心管中。向试管中加入 30 毫升蒸馏水。在另一个 50 毫升锥形管中，混合 6 毫升 0.1 当量的硝酸银和 18 毫升蒸馏水。将两种混合物在 60 摄氏度、160 瓦条件下超声处理一小时。然后，在持续对MWCNT分散液于60摄氏度、160瓦功率下进行超声处理的同时，使用配备1毫升吸头的移液器将硝酸银溶液逐滴加入MWCNT分散液中。加样完成后，继续超声处理混合物1小时，随后在室温下以12,000 G离心15分钟，并弃去上清液。通过在24摄氏度下超声处理30分钟，将银修饰的MWCNT重新分散于30毫升蒸馏水中。在30毫升蒸馏水中重复离心并去除上清液两次。随后，将洗涤后的银修饰多壁碳纳米管在1毫升蒸馏水中通过超声分散5分钟。向该分散液中加入5毫升乙醇，并在室温下搅拌混合物1小时。然后在室温下以12,000 G离心混合物15分钟，并检测上清液的pH值。弃去上清液，通过涡旋振荡将沉淀物重新悬浮于5毫升乙醇中。继续通过离心用乙醇洗涤沉淀物，直至上清液pH呈中性。最后，将洗涤后的银修饰多壁碳纳米管分散于1毫升蒸馏水中。在真空条件下，于-70摄氏度冷冻干燥24小时，并将所得分散液储存于密封容器中。开始准备实验时，将18.12克R2A琼脂与1升蒸馏水混合并进行高压灭菌。将凝胶在室温下冷却。当凝胶准备就绪后，将10毫升凝胶倒入90毫米的培养皿中，并让琼脂凝固。在通风橱中，使用经酒精火焰灭菌的接种环和接种针，在培养基表面划线接种100微升甲基杆菌属（Methylobacterium）菌种混合物。将培养皿在30摄氏度下孵育48小时，然后将3.12克R2A肉汤与一升蒸馏水混合，并在121摄氏度下高压灭菌15分钟。使用灭菌的接种环和接种针将菌落转移至R2A生长培养基中。将样品置于摇床培养箱中，在30摄氏度、180 RPM条件下孵育。每小时测量一次600纳米处的光密度，直至光密度大于0.7。接着，准备另一块含有10毫升R2A琼脂的培养皿。然后将3.12克R2A肉汤和8克琼脂与1升蒸馏水混合。在121摄氏度下高压灭菌该混合物15分钟。将100微升的甲基杆菌培养物加入琼脂混合物中。将含有甲基杆菌的凝胶10毫升倒入培养皿中R2A琼脂底层上，然后在蒸馏水中制备所需浓度的冻干银多壁碳纳米管分散液。使用微量移液器将 50 微升该分散液加样到一个 6×1 毫米的无菌纸片上。另取一个无菌纸片，加入蒸馏水作为对照。将两个纸片置于真空室中，在紫外光下干燥并灭菌 30 分钟。然后将银修饰的多壁碳纳米管样品和对照样品放置在琼脂培养基上，于30摄氏度培养48小时。培养结束后，测量银修饰的多壁碳纳米管样品周围的抑菌圈大小。试验前，将三蒸水在121摄氏度下高压灭菌15分钟。在无菌水中配制浓度为1000微克/毫升的羧基功能化多壁碳纳米管分散液，以及浓度分别为50微克/毫升、40微克/毫升和30微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液。开始进行抗菌测试时，按先前所述方法制备甲基杆菌培养物，并在600纳米波长下监测其光密度。当光密度达到最大值时，将100微升甲基杆菌培养物接种至3毫升新鲜R2A培养基中。将500微升该溶液分别加入五个15毫升锥形管中。向其中一根管中加入100微升甲醇，以制备甲醇参考样品。以相同方式制备其余四种分散液的样品。将样品和剩余的甲基杆菌对照培养物在180 rpm、30°C条件下振荡培养，直至对照组的光密度显示达到最大活性。使用无菌涂布棒将每个样品涂布于培养皿中的固体R2A琼脂凝胶表面。将培养皿在30°C条件下培养48小时。计数获得的细菌菌落，并确定最小杀菌浓度。采用所述方法成功合成了银多壁碳纳米管（Silver MWCNTs）。沉积的银颗粒平均尺寸约为3.83纳米。当使用50 微克/毫升或40 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液培养时，未观察到甲基杆菌的生长。当使用30 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液培养时，细菌数量较对照样品减少了100,000倍。在由10 微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液制备的样品周围观察到抑菌圈。由1微克/毫升分散液制备的样品未观察到抑菌圈。当加入40微克/毫升的银修饰多壁碳纳米管分散液时，观察到一定的细胞毒性。当加入30微克/毫升的分散液时，未观察到显著的细胞毒性。台盼蓝实验确认，当加入每毫升30微克的银多壁碳纳米管分散液时，细胞毒性极低。本方案将有助于研究人员制备含有直接作用于碳纳米材料的金属纳米颗粒的纳米复合物。按照本方案，研究人员还能够评估所制备纳米复合物的抗菌性能。

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抗菌型氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备

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