Name: 高频超声监测小鼠瘀血致深静脉血栓形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习使用下腔静脉瘀血模型在小鼠中诱导深静脉血栓形成，并通过高频超声无创监测血栓动态变化。该方法可量化血栓形成与消退过程，为抗血栓治疗研究提供可靠的技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大心脏与卒中基金会以及莫里斯和贝拉·法因曼家族基金会的资助支持。作者感谢维罗尼卡·米肖在使用VEVO770超声成像系统过程中提供的技术帮助。

所有实验程序均经加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学机构动物护理委员会批准。所需全部设备列于表 I 中。
1. 小鼠（C57BL/6J）IVC 淤滞实验方案
<ol>
	<li>手术准备 
	注意：本手术为可存活手术，因此必须始终遵循无菌操作技术。包括确保所有材料均已备齐，使用前后对器械进行清洁和灭菌，并在工作台面上划定一个无菌区域用于放置所有无菌物品。
	<ol>
		<li>通过高压灭菌器对所有手术器械&#160;和材料进行灭菌。若同时进行多个手术操作，玻璃珠灭菌器足以用于动物间器械尖端的灭菌。</li>
		<li>使用100%氧气与2.5%异氟烷混合气体对8至10周龄的雄性C57Bl/6小鼠进行麻醉。 
		注意：根据需要调整氧气和异氟烷的流速。</li>
		<li>用镊子夹住动物后肢脚趾之间的部位以确认麻醉状态。若无反应，则表明动物已处于麻醉状态。</li>
		<li>通过皮下注射给予缓释镇痛药（丁丙诺啡），剂量为每1 kg体重给予1 mg镇痛药（1 mg/kg）。</li>
		<li>在动物双眼上涂抹眼膏，以确保手术过程中角膜不会干燥。</li>
		<li>按每10 g体重0.2–0.5 mL的剂量，皮下注射等渗液体。</li>
		<li>使用手术胶带将动物固定在手术台上，使其呈仰卧位以暴露腹部。手术过程中应将动物置于加热垫上，防止低体温。</li>
		<li>在小鼠腹部涂抹脱毛膏，持续1–2分钟以去除毛发。如有必要，用纱布和蒸馏水擦拭腹部区域使其清洁。</li>
		<li>或者，可使用小型电动剃刀剃除腹部毛发。</li>
		<li>在切口前，使用&#160;Baxedin（氯己定葡萄糖酸盐BP溶液）对腹部进行消毒。用纱布轻轻涂抹乙醇，避免因酒精蒸发导致过多热量散失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露下腔静脉（IVC）
	<ol>
		<li>使用手术剪进行剖腹手术，打开腹腔。
		<ol>
			<li>在下腹部用镊子提起皮肤，并沿腹白线两侧平行做垂直切口。根据操作者的惯用手决定在腹白线左侧或右侧做第一个切口。切口应偏离中线，以便后续超声成像。</li>
			<li>在腹部顶端做第二个横向切口。 
			注意：进入腹腔时，应先将肌肉组织“ tenting”（帐篷式提起），再用手术剪刺入，以避免损伤腹腔内器官。</li>
			<li>在动物的腹肌层重复垂直和横向切口。&#160;进入腹腔时务必对肌肉组织进行 tenting 操作，以免损伤下方器官。 
			警告：切口时应将皮肤和肌肉从肠道及其他内脏器官上轻轻提起，避免穿刺。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将皮肤和肌肉向切口外侧翻折，以暴露腹腔。</li>
		<li>用等渗溶液浸湿的纱布置于伤口两侧，将肠道外置。对腹部两侧施加压力以协助肠道外置。使用棉签轻柔移动肠道。将纱布浸泡于等渗溶液后覆盖在外置的肠道上。&#160;
		<ol>
			<li>纱布在接触组织前应预先润湿。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移开任何腹膜脂肪，暴露肾静脉与髂静脉之间的下腔静脉（IVC）。</li>
		<li>初步识别明显的侧支血管。侧支血管表现为从肾静脉与髂静脉之间段的下腔静脉分出的较小但显著的静脉。小鼠的血管结构可能存在较大个体差异，部分小鼠可能在一侧或双侧下腔静脉存在侧支血管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧支血管结扎 
	注意：若存在侧支血管，则对每一支执行以下操作；若无侧支血管，则直接进入第4步：在下腔静脉下方进行初始缝合。无论是否存在侧支血管，下腔静脉的结扎位置均位于左肾静脉远端紧邻处。
	<ol>
		<li>对每支侧支血管两侧进行钝性分离。钝性分离是指反复以轻柔压力张开钝头镊，以穿透筋膜而不损伤周围血管。 
		警告：避免穿刺或损伤静脉。</li>
		<li>提起侧支血管，并在其下方穿过一段6-0丝线缝合线。在提起或移动血管时务必小心，最好夹住血管周围的脂肪组织，否则可能损伤血管。</li>
		<li>使用持针器，采用标准外科打结技术对侧支血管进行手术结扎。完全结扎以确保静脉100%闭塞。至少打三个结以确保结扎牢固。</li>
		<li>对所有剩余的侧支血管重复步骤1.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离腹主动脉与下腔静脉（IVC）
	<ol>
		<li>在左肾静脉远端紧邻处对下腔静脉周围进行钝性分离。腹主动脉通过筋膜与下腔静脉相连，因此需首先对下腔静脉和腹主动脉周围进行初步钝性分离。 
		警告：避免穿刺或损伤静脉。切勿破裂或穿刺任一血管。此步骤为整个手术中最关键的部分，血管损伤风险最高。</li>
		<li>持续通过钝性分离施加轻柔压力，直至在主动脉与下腔静脉之间形成清晰的分离窗口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缝合线放置及下腔静脉（IVC）结扎
	<ol>
		<li>在下腔静脉和腹主动脉下方穿过一段6-0丝线缝合线。</li>
		<li>将缝合线从下腔静脉与主动脉之间的分离窗口中穿过。使用镊子拉出缝合线并将其穿入腹主动脉与下腔静脉之间。小心穿线，避免牵拉或穿刺下腔静脉和腹主动脉。</li>
		<li>使用持针器对下腔静脉进行手术结扎，确保静脉完全闭塞。再次强调，结扎位置应在左肾静脉远端紧邻处。</li>
		<li>打三个结以固定结扎。 
		注意：也可选择在分离腹主动脉与下腔静脉之前，先将缝合线穿置于两者下方作为替代方案。&#160;此外，也可使用7-0 Prolene缝合线对侧支血管和下腔静脉进行结扎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伤口闭合与术后护理
	<ol>
		<li>确认腹主动脉保持通畅，且所有侧支血管均已结扎。结扎远端的下腔静脉应呈现扩张状态，且无血流可见。</li>
		<li>将所有腹膜脂肪和肠道复位至腹腔内。</li>
		<li>使用持针器和6-0丝线缝合关闭伤口。采用连续缝合（单纯连续缝合），并确保缝合线不过紧。过紧的缝合线可能在动物苏醒并在笼内活动时发生断裂。
		<ol>
			<li>或者，可使用PDS、Ethilon、Vicryl、Dexon或不锈钢夹进行伤口闭合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>首先使用适当的打结技术缝合腹肌层。</li>
		<li>重复缝合技术缝合皮肤，并确认伤口闭合充分。 
		注意：若对多只动物使用同一根缝合针和缝线，每次使用前需将其在70%乙醇中灭菌。</li>
		<li>将动物从麻醉气体中移出，并置于34 °C培养箱中至少30分钟。</li>
		<li>再次按每10 g体重0.2–0.5 mL的剂量皮下注射等渗液体。如有必要，可在术后数日内继续给予液体以维持术前体重。</li>
		<li>监测动物直至完全恢复，以确认手术成功并评估其整体健康状况。 
		警告：此类侵入性手术后动物可能出现轻微弓背姿势，但通常在术后30分钟内即可恢复正常行为。</li>
		<li>将动物单独置于笼中，在其完全恢复前不得与其他动物同笼。</li>
		<li>术后最多连续每日给予镇痛药48小时&#160;。</li>
		<li>恢复期间将食物放置于笼底供动物取食。通常无需其他特殊护理。</li>
		<li>检查伤口部位是否有红肿、渗出或其他感染迹象。</li>
		<li>如有必要，可在术后7–10天拆除缝线。</li>
		<li>若手术失败（例如，严重血管损伤和/或失血）或动物术后护理后状况未改善，应立即实施安乐死。&#160;通常在术后48小时&#160;实施安乐死。对于更长期的实验，建议使用7-0 Prolene缝合线结扎侧支血管和下腔静脉，使用5-0 Vicryl缝合线关闭腹腔。
		<ol>
			<li>通过吸入5%异氟烷进行诱导麻醉（方法同前）使动物麻醉，随后在麻醉状态下使用100% CO2进行窒息安乐死。</li>
			<li>确认窒息安乐死完成（心跳停止且无呼吸）后，实施颈椎脱位以确保完全死亡。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高频超声成像实验方案
注意：本方案改编自Lady Davis研究所啮齿类动物表型分析核心实验室的高频超声成像标准操作程序。本方案在给药后24小时进行&#160;术后，但只要动物对手术反应良好，也可更早进行。该方案可在健康小鼠的任何时间实施，常用于手术前后对比。
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>将动物放入诱导室，用100%氧气与2.5%异氟烷的混合气体进行麻醉。</li>
		<li>打开心率和温度监测仪。将加热灯置于操作台上方，以在操作过程中保持动物体温。</li>
		<li>将动物从麻醉诱导室中取出，并涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。将动物置于分析平台上，并将麻醉管固定于动物的口鼻部。</li>
		<li>将超声耦合剂用37 °C水浴系统加热至37 °C，然后将耦合剂涂抹于动物腹部。耦合剂的加热通过水循环加热系统实现，该系统将温水泵入缠绕在耦合剂瓶外的线圈中进行加热。</li>
		<li>如需测量心率，在分析平台的4个电极上涂抹导电胶，并用医用胶带将动物的四肢固定在平台/电极上。将动物置于仰卧位以进行下腔静脉成像。超声成像系统包含一个带有电极、可加热的分析平台，用于监测动物生理状态。</li>
		<li>测量体温时，将电极凝胶涂于温度计上，然后插入动物的直肠内。</li>
		<li>根据需要调节加热灯和异氟烷，以确保动物舒适，呼吸频率维持在30 - 70次/分钟，并保持体温在37 °C。</li>
		<li>如有需要，剃除动物腹部毛发或使用脱毛膏去除毛发。涂抹1-2分钟后，用纱布和蒸馏水擦拭干净。 
		注意：过多的毛发可能会影响图像质量。</li>
		<li>在动物身下或侧面放置纱布，以收集多余的超声耦合剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下腔静脉及血栓成像
	<ol>
		<li>打开成像软件并开始一项新研究。</li>
		<li>选择适合成像的扫描探头。此处使用的探头适用于腹部器官（频率：35 MHz，焦距：12.8 mm）。</li>
		<li>记录动物的相关信息，包括动物编号、性别、体重、出生日期、品系 等等.</li>
		<li>将扫描头下移，直至接触到动物身上的超声耦合剂。</li>
		<li>启动扫描头探头以开始对动物进行二维成像。在此模式下，图像以不同深浅的灰度呈现为二维形式。</li>
		<li>通过在x轴和/或y轴方向上移动小鼠平台，同时在z轴方向上移动扫描头，定位下腔静脉和腹主动脉。 
		注意：血管呈现为管壁白色，管腔内的血液几乎呈黑色。腹主动脉搏动明显，管壁较厚；而下腔静脉（IVC）管壁较薄，在超声探头上下移动时，其管径在图像屏幕上可轻易被压缩或扩张。结扎部位清晰可见，静脉在此处扩张，静脉壁形成一个尖端。任何在静脉内形成的血栓在超声成像下均表现为实性结构，不像静脉壁那样容易被压缩。静脉仅在结扎部位上方（无血栓形成区域）可被压缩。</li>
		<li>在定位下腔静脉（IVC）及结扎部位后，将其置于超声焦点中心，以获得最准确的图像。
		<ol>
			<li>如果图像过暗导致无法清晰观察，调整凝胶并用棉签去除任何气泡。</li>
			<li>如有必要，将扫描头向左或向右倾斜45°，并重新调整动物平台位置，以清晰观察静脉。当扫描头受到干扰时需进行此操作。在此情况下，需以侧向角度成像静脉，以避开缝线。 
			注意：图像干扰最常见的原因是动物皮肤上的深色斑块、伤口缝合位置不佳或超声耦合剂中的气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用软件拍摄任何所需结构的照片，并利用测量工具进行测量。常见测量指标包括血栓的横截面积或结扎部位的宽度。</li>
		<li>将成像模式切换至脉冲波多普勒模式，以进行血流测量。该模式可用于观察血管内血流，并测量血流速度等其他参数。</li>
		<li>倾斜分析平台，以降低动物后端。</li>
		<li>调整扫描头的角度/位置，使其从动物后端以约30°的角度接触凝胶。</li>
		<li>重新调整动物平台和扫描头的位置。如有必要，重新定位静脉输液导管（IVC）和结扎部位。</li>
		<li>在结扎部位周围进行血流测量以确认血流停滞，并采集所需的任何图像。常见的血流测量指标包括平均流速、峰值流速或中位流速。</li>
		<li>保存所有获取的测量数据或图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁与动物恢复
	<ol>
		<li>将扫描头升至初始位置，同时将动物平台重新移回初始位置。</li>
		<li>用纱布轻轻擦去动物身上多余的凝胶，注意动作轻柔，以免撕裂伤口缝线。</li>
		<li>将体温计从动物直肠中取出，并将动物从平台上移开。</li>
		<li>将动物放回笼中，并置于34 °C的培养箱内。</li>
		<li>观察动物直至其恢复。该操作非常轻微且为非侵入性，动物将迅速苏醒。随后几天内应按照本方案第1.6节的要求继续监测动物。</li>
		<li>用纱布和消毒剂清洁动物平台。</li>
		<li>用纱布和蒸馏水将扫描头擦拭干净。 
		注意： 非常轻柔地清洁扫描头 仅使用蒸馏水.</li>
		<li>对下一个动物重复步骤2。
		<ol>
			<li>若所有受试者实验均已完成，需确认所有图像和记录均已保存，随后关闭所有设备和软件。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+diagnosed+deep+vein+thrombosis+in+the+general+population%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>McGuinness, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+labelled+monocytes+by+experimental+venous+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi.</a> Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+thrombus+to+resolve+in+urokinase-type+plasminogen+activator+gene-knockout+mice%3A+rescue+by+normal+bone+marrow-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells.</a> Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).</li>
<li>Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+99mTc+labeled+recombinant+tissue+plasminogen+activator+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits.</a> Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).</li>
<li>Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pulmonary+emboli+and+deep+venous+thrombi+with+99mTc-bitistatin%2C+a+platelet-binding+polypeptide+from+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom.</a> J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).</li>
<li>Wakefield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+thrombosis+prophylaxis+by+inflammatory+inhibition+without+anticoagulation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy.</a> J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).</li>
<li>Robins, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Gas6+contributes+to+thrombogenesis+and+promotes+tissue+factor+up-regulation+after+vessel+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice.</a> Blood. 121 (4), 692-699 (2013).</li>
<li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+synthase+is+upregulated+by+Gas6+during+cancer-induced+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis.</a> Blood. 127 (6), 769-777 (2016).</li>
<li>Laurance, S., et al. <a target="_blank" href="http://atvb.ahajournals.org/content/early/2017/04/27/ATVBAHA.116.308925">Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).</li>
<li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+mouse+models+of+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical review of mouse models of venous thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).</li>
<li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+venous+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of venous thrombosis in mice.</a> J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).</li>
<li>Brandt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+vein+thrombus+formation+induced+by+flow+reduction+in+mice+is+determined+by+venous+side+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).</li>
<li>Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+vena+cava+branch+variations+in+C57BL%2F6+mice+have+an+impact+on+thrombus+size+in+an+IVC+ligation+%28stasis%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model.</a> J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).</li>
<li>Luther, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Effector-Memory+T+Cell+Activation+Regulates+Post-Thrombotic+Vein+Wall+Inflammation+and+Thrombus+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution.</a> Circ Res. , (2016).</li>
<li>Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+contributions+of+complement+factors+to+platelet+activation+and+fibrin+formation+in+venous+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development.</a> Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).</li>
<li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombogenesis+with+continuous+blood+flow+in+the+inferior+vena+cava.+A+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model.</a> Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用淤滞模型成功形成静脉血栓有几个关键步骤。由于下腔静脉和主动脉周围脂肪的积累，老年小鼠的静脉血栓诱导更具挑战性。理想情况下，接受该手术的小鼠应为8至10周龄。在钝性分离和结扎过程中，应格外小心，避免对下腔静脉（IVC）造成内皮损伤。此外，手术后必须将动物置于34 °C的培养箱中至少30分钟，并且仅在动物完全恢复后才将其放回其他动物群体中。&#160;若手术操作正确，动物在术后护理期间表现良好，无严重副作用，如跛行、轻瘫或大小便失禁。手术后动物可能出现活动减少和轻微弓背姿势，但只要镇痛有效且手术操作得当，这种情况并不常见。
血流停滞模型可产生大小可重复的大型血栓。与人类相似，小鼠静脉系统的解剖结构存在个体差异，近期研究已针对深静脉血栓形成（DVT）的狭窄模型和血流停滞模型中下腔静脉分支阻断的问题进行了探讨。13,14. Brandt 等 表明当侧支位于受限血流区域时，可防止由血流受限诱导的血栓形成 &#60;下腔静脉结扎部位远端1.5 mm处。然而...

静脉血栓栓塞症（VTE）包括深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞，是继心肌梗死和卒中之后心血管死亡的第三大原因。该病较为常见，影响约1%至2%的人群，年发病率约为每500人中1例1。VTE可导致：1）因肺栓塞而致死；2）血栓后综合征，表现为慢性腿部疼痛、肿胀和溃疡；或3）慢性肺动脉高压，进而引起显著的慢性呼吸功能障碍。VTE是一种多因素疾病，可能由血流淤滞、血管壁损伤和/或凝血与纤溶系统之间的平衡紊乱所导致的高凝状态引起，这一机制早在一百多年前由Virchow提出，被称为Virchow三要素（Virchow's Triad）。
由于大多数情况下无法获取人类深静脉血栓（DVT）样本，研究人员已开发出DVT的实验动物模型。已有多种动物被用于该研究，包括大鼠2、小鼠3、兔4、猪5、狗6和非人灵长类动物7。小鼠可进行基因修饰，是研究DVT最常用的动物。然而，与其他所有动物一样，小鼠不会自发形成DVT。因此，需通过物理或化学方法改变静脉壁以在小鼠体内诱导血栓形成。我们此前曾采用三氯化铁模型在小鼠下腔静脉（IVC）中诱导血栓形成8,9,10。该模型的优势在于可在数分钟内稳定地形成闭塞性血栓，适用于研究抗凝和抗血小板药物在急性DVT中的作用。然而，该方法为终末性操作。因此，若需研究急性与慢性DVT，淤血模型更为合适。在该模型中，通过完全阻断下腔静脉（IVC）的血流——即Virchow三联征中DVT形成的因素之一——来诱导血栓形成。该模型可用于研究DVT的形成与溶解过程，相较于FeCl3模型具有明显优势11。
我们已开发出一种无创方法，利用微型成像高频超声系统随时间监测血栓的形成与溶解过程12。我们先前已证实，通过超声测量静脉血栓的结果与病理获取的血栓具有良好的相关性。在随后的两项研究中，我们进一步确认了超声测量结果与组织化学定量的血栓重量及血栓面积高度相关9,10。更重要的是，我们已证明高频超声可用于监测小鼠深静脉血栓的形成12。此外，该技术还可用于以无创方式量化血栓的溶解过程。
本文将介绍利用血流停滞诱导的血栓小鼠模型形成血栓的实验方案，以及如何通过高频超声无创地在时间进程中监测血栓的形成。

<table><tbody><tr><td>6-0 永久手缝丝线</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>打结镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊（直头和弯头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G 针头</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VEVO 770 高分辨率成像系统</td><td>Visualsonics</td><td>已停售</td><td></td></tr><tr><td>缓释布托啡诺</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>由兽医给予 LDI</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Systan 眼药膏</td><td>Alcon</td><td>288/28062-0</td><td></td></tr><tr><td>2×2 无菌纱布</td><td>CDMV</td><td>#104148</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td>来自 JGH</td></tr><tr><td>透气性低致敏外科胶带</td><td>CDMV</td><td>#7411</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂（Aquasonic-100）</td><td>Dufort &amp;amp; Lavigne</td><td>#AKEN4061</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>来自 JGH</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉室、管路及给药设备</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛剂</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水循环加热硬垫</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>#HHP-2</td><td></td></tr><tr><td>Gaymar 加热器水泵 TP500</td><td>MATVET Inc.</td><td>#R-500305</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td>electrimat inc.</td><td>#1R175R-PAR</td><td></td></tr><tr><td>小鼠直肠温度探头</td><td>emkaTECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td>来自 JGH</td></tr></tbody></table>

通过高频超声监测的小鼠血流淤滞诱导的深静脉血栓形成

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

静脉血栓是一种常见疾病，影响约1%至2%的人群，年发病率为每500人中1例。静脉血栓可因肺栓塞导致死亡，或引发血栓后综合征，表现为慢性腿部疼痛、肿胀和溃疡，也可导致慢性肺动脉高压，进而引起明显的慢性呼吸功能障碍。该病是心肌梗死和缺血性卒中之后最常见的心血管疾病，也是所有医学学科面临的临床挑战，因为它可能并发于癌症、系统性疾病、外科手术和重大创伤等其他疾病过程之中。
研究这些机制需要借助实验模型。静脉淤滞模型可诱导出大小一致的血栓，并产生可量化的血栓量。然而，必须系统性地结扎下腔静脉的侧支血管，以避免血栓大小的变异以及对数据的错误解读。我们已开发出一种利用超声成像测量血栓大小的非侵入性技术。通过该技术，可在同一动物体内随时间推移评估血栓的形成与消退过程。这种方法减少了为量化静脉血栓形成所需使用的实验小鼠数量，符合研究中动物使用“替代、减少和优化”（3R）原则。我们已证实，血栓重量及血栓大小的组织学分析结果与超声成像测量值具有良好的相关性。因此，本研究旨在描述如何利用下腔静脉淤滞模型在小鼠中诱导深静脉血栓形成，并介绍如何使用高频超声对其进行监测。

静脉淤滞血栓形成模型
在淤滞模型中，小鼠被麻醉后，通过在小鼠左侧或右侧做切口暴露下腔静脉（IVC），而非采用腹中线剖腹术，以避免干扰超声探头。将腹肌和皮肤向两侧翻折以暴露下腔静脉（图1）。首先，使用6-0丝线结扎侧支血管（图2）。然后，通过钝性分离将下腔静脉与主动脉分开，并将丝线环绕下腔静脉（图3A-C）。使用6-0丝线结扎下腔静脉。结扎部位远端下腔静脉的扩张表明血流阻断成功（图3D）。最后，连续缝合腹膜腔和皮肤（图3E）。
<p class="jove_content" fo:ke...

本实验方案描述了利用血流停滞模型诱导静脉血栓形成的操作步骤。此外，我们采用一种非侵入性方法，用于随时间测量血栓的形成与溶解过程。

静脉血栓是一种常见疾病，影响约1%至2%的人口，每年发病率约为五百人中一人。静脉血栓可导致死亡……

本实验的总体目标是利用下腔静脉血流停滞模型在小鼠体内诱导深静脉血栓形成，并使用高频超声监测血栓。该方法有助于解答静脉血栓领域中的关键问题，例如特定药物、基因或细胞类型如何影响血栓的形成或消退。该技术的主要优势在于，可在小鼠体内无创地定量检测血栓的形成与消退过程。我们在研究如何对小鼠下腔静脉中的血栓形成进行去动态化和无创监测时，首次提出了该方法的想法。首先，使用镊子提起一只8至10周龄C57黑六小鼠的下腹部皮肤，然后使用手术剪沿腹白线中线两侧平行作垂直切口。在腹部顶端做一横向切口，随后依次穿过腹肌层进行重复切开。将皮肤和肌肉从切口处向外翻折，以暴露腹腔。将湿润的纱布放置于伤口两侧。轻轻按压腹部两侧，使肠管外置于纱布上。然后在暴露的组织上覆盖第二层湿润纱布。在解剖显微镜下，移开任何腹膜脂肪以暴露肾静脉与髂静脉之间的下腔静脉（IVC）。找到下腔静脉的侧支。使用镊子轻轻钝性分离每条侧支，穿透筋膜，同时避免损伤周围血管。接下来，小心抓住其中一个分支周围的脂肪组织，以抬起该静脉。将一段6-0丝线缝合线从血管下方穿过。然后使用缝合镊子和标准的外科打结技术，在侧支周围至少打三个结，以完全阻断血管。或者使用止血夹。从左肾静脉远端开始，钝性分离下腔静脉与腹主动脉周围及两者之间的组织，注意不要损伤任何一条血管。当在两条血管之间形成清晰的分离间隙后，将一段6-0丝线从下腔静脉和腹主动脉下方穿过。使用镊子将缝线穿过窗口。用缝线镊子在左肾静脉远端立即打三个结，结扎下腔静脉，以完全阻断血管。确认腹主动脉保持通畅未被结扎。并且所有侧支血管均已结扎。下腔静脉在结扎部位远端会呈现扩张状态，且无血流可见。将腹膜脂肪和肠管复位至腹腔内。使用缝合镊子和6-0号丝线，分别连续缝合肌肉层和皮肤层。然后将动物置于34°C的培养箱中至少30分钟，并进行监测，直至完全恢复。将超声耦合剂瓶穿过水加热系统的线圈，使耦合剂加热至 37 摄氏度。结扎后 24 小时，将动物放置在分析平台上，并在平台的四个电极上涂抹导电凝胶。将动物置于仰卧位，将其四肢固定在电极上，并将润滑过的体温计插入直肠。在动物侧边放置纱布，以承接多余的超声耦合剂。然后将凝胶涂抹于暴露的皮肤上，并根据标准超声成像方案对下腔静脉进行成像。使用高频微成像系统，可在结扎前通过纵向视图识别下腔静脉。脉冲波多普勒成像可用于测定血流速度。结扎后立即可见血流减少。结扎24小时后，通过超声检查可在下腔静脉（IVC）内观察到致密的血栓。超声成像还可对血管内血流速度进行定量分析。在结扎前、结扎后即刻以及结扎后24小时使用彩色多普勒进行检测。一旦掌握该技术，根据侧支血管的存在与否及其数量，可在30至45分钟内成功诱导血栓形成。进行该操作时，重要的是要记住放慢速度，动作既要精确又要轻柔，因为血管较易破裂。完成该操作后，可进一步采用免疫荧光、组织学或流式细胞术等方法，以探究血栓中细胞成分的更多信息，或定量分析特定目标蛋白。

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高频超声监测小鼠瘀血致深静脉血栓形成

通过电解诱导下腔静脉内表面内皮细胞活化，可导致静脉型血栓形成，其机制涉及内皮细胞活化和部分血流淤滞，这两者均为维尔肖三联征的组成部分。...

静脉血栓形成的电解下腔静脉模型（EIM）

小鼠下腔静脉完全阻断型血栓形成模型可产生可量化的静脉壁组织和血栓。该模型已证实可用于评估静脉壁与阻塞性血栓之间的相互作用，以及急性向慢性炎症转变的过程。...

小鼠下腔静脉血栓完全淤滞模型

本视频展示了利用活体荧光显微技术在小鼠模型中研究血栓形成的方法。通过向小鼠注射荧光标记的多糖以监测血液循环。当耳部微血管受到高强度光照时，光毒性诱导产生损伤，进而导致血栓形成；通过观察血流阻塞现象可确认血栓的生成。...

活体荧光显微镜观察微血管血栓形成

来源： Kim, D., et. al. 结合近红外荧光成像与微型计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp.

利用微型计算机断层扫描成像技术在小鼠中显示脑血栓

本文描述了下腔静脉狭窄作为深静脉血栓形成的小鼠模型。该模型可重现血流受限这一人类静脉血栓形成的主要诱因之一。...

下腔静脉狭窄：一种深静脉血栓的小鼠模型

通过穿透小鼠肾下腹主动脉的双层管壁进入下腔静脉，建立主动脉-下腔静脉瘘，随后通过部分结扎下腔静脉在其流出道处形成狭窄。该可重复模型可用于研究中心静脉狭窄。...

利用动静脉瘘合并流出道狭窄建立中心静脉狭窄的小鼠模型

本文旨在介绍一种基于超声成像的方法，该方法能够 体内 小鼠脑动脉血流成像。我们展示了该技术在蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型中用于测定与血管痉挛相关的血流速度变化的应用。...

利用高频经颅双功能超声分析小鼠蛛网膜下腔出血模型中的脑血管痉挛

本方案描述了一种独特且具有临床相关性的外周动脉疾病模型，该模型通过结合股动脉和股静脉电凝以及给予一氧化氮合酶抑制剂，在FVB小鼠中诱导后肢坏疽。随后采用心脏内灌注DiI的方法，对足垫血管系统进行高分辨率的三维成像。...

小鼠后肢坏疽模型中足垫血管系统的高分辨率三维成像

本方案描述了一种利用超声成像技术，在可诱导的小鼠子宫内膜癌模型中，通过与大体及组织学变化进行对照，随时间监测子宫形态学改变进展的方法。...

小鼠中通过Pax8导向删除肿瘤抑制因子Arid1a和Pten实现子宫内膜癌进展的无创超声评估

本文旨在介绍一种利用血管夹进行静脉结扎以评估小鼠癌症模型中静脉血栓形成的方法，并对该方法进行了优化。优化后的方案可减少血栓相关测量指标的变异性，并提高其在人类癌症相关静脉血栓研究中的适用性。...

癌症小鼠模型中的静脉血栓形成检测

排卵前期卵巢血流的变化对排卵至关重要。多普勒超声已用于人类和大型动物评估卵巢血流动力学和灌注情况。本文介绍了一种在小鼠排卵前期和围排卵期应用多普勒超声评估卵巢血流动力学的实验方案。...

小鼠卵巢血管功能的活体成像与定量多普勒超声检测

学习使用下腔静脉瘀血模型在小鼠中诱导深静脉血栓形成，并通过高频超声无创监测血栓动态变化。该方法可量化血栓形成与消退过程，为抗血栓治疗研究提供可靠的技术支持。

通过高频超声监测的小鼠血流淤滞诱导的深静脉血栓形成

探索更多视频