Name: 诱导小鼠横向主动脉狭窄的闭合胸模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解小鼠闭合胸横向主动脉狭窄技术，用于诱导左心室肥厚并研究心脏巨噬细胞免疫反应。该微创方法保持肋骨完整，减少手术创伤，适用于不同体型小鼠，为心血管与免疫学研究提供标准化模型。

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感谢 Stilla Frede 和 Susanne Schulz 提供的技术支持。本研究未获得任何资助。

本方案已获得雷克林豪森 LANUV 动物实验伦理委员会批准（编号：#84-02.04.2016.A374）。通常，该操作在成年小鼠（&#62;10 周龄）上进行。然而，也可在较年轻的动物上实施该手术。手术器械在使用前必须灭菌，所有步骤均须在无菌条件下进行。
1. 麻醉诱导与插管
<ol>
	<li>腹腔注射布托啡诺，剂量为0.1 µg/g体重，用于镇痛。术后连续三天每8小时重复一次腹腔注射，每次剂量为0.1 mg/kg。</li>
	<li>诱导时，将小鼠放入麻醉诱导箱中，诱导箱连接至麻醉蒸发器，异氟烷浓度设定为3.0 Vol%，氧气流速为1 L/min。</li>
	<li>通过施加触觉刺激确保深度麻醉。 
	注意：如果麻醉诱导失败或麻醉深度不足，可将异氟烷的体积分数增加至5%。</li>
	<li>捏住小鼠尾部以确认无反射反应。若反射完全消失，称量小鼠体重以优化呼吸机参数设置（参见1.12）。</li>
	<li>将小鼠移至温度控制的手术台，以在整个操作过程中维持37 °C的体温。</li>
	<li>将小鼠的鼻部放入与麻醉诱导箱相连的塑料锥形管中以维持麻醉状态。</li>
	<li>用尼龙缝线固定小鼠的上切牙，用胶带固定四肢。</li>
	<li>用镊子尖端按压后肢足垫，再次确认麻醉效果充分。若无退缩反射，则进行以下步骤。 
	注意：如果麻醉诱导失败或麻醉深度不足，增加异氟烷的体积百分比，并等待缩足反射消失。</li>
	<li>在角膜上涂抹无菌眼科润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。&#160;</li>
	<li>润滑直肠探头，以避免直肠损伤。插入直肠温度探头，维持核心体温为37 °C。</li>
	<li>使用脱毛膏按照制造商说明对喉部和上胸部进行脱毛。1分钟后擦去脱毛膏。如有必要，重复此步骤直至脱毛成功。 
	注意：使用棉签&#160;如发生出血。</li>
	<li>用70%乙醇清洁脱毛区域，然后进行局部皮肤消毒，涂抹聚维酮碘3次，每次至少持续3分钟。</li>
	<li>调整呼吸机参数至生理范围。将呼吸频率设为150次/分钟，潮气量设为8–10 µL/g体重（BW）。</li>
	<li>戴上一副新的无菌手套。将小鼠置于手术显微镜下，并在小鼠身上覆盖无菌开窗洞巾。</li>
	<li>在下颌下方约3 mm处沿中线切开皮肤，直至第2颈椎nd 肋骨。辨认下颌下腺的中线及结缔组织。然后使用成角的囊内镊，用两把镊子在中线处钝性轻柔分离腺体，并探查气管肌。</li>
	<li>用无齿镊轻轻钝性分离气管旁肌肉，以制备气管。</li>
	<li>用镊子牵拉舌头以伸直喉部，为插管创造更便利的条件，并轻柔地将气管插管导管（外径 1.2 mm）插入气管内。通过直接观察导管是否位于气管内以及检查胸廓运动是否正常来确认插管成功。</li>
	<li>插管后，将异氟烷浓度调整为2%异氟烷，氧流量为1.0 L/min，氧气浓度为100%2. 
	注意：如果呼吸运动未停止或小鼠开始活动，首先将呼吸频率增加至180次/分钟。如有必要，随后将异氟烷浓度增加至最高3.5%，直至小鼠自主呼吸停止。最常见的问题包括漏气或蒸发器填充不足，需进行评估。</li>
	<li>或者，按照以下子步骤建议进行插管操作。
	<ol>
		<li>将小鼠置于与水平面呈60°角的桌面上。</li>
		<li>用胶带固定小鼠的四肢并后仰头部。</li>
		<li>将冷光源直接置于喉部上方的皮肤处。</li>
		<li>用镊子轻轻拉出舌头，以观察声带。</li>
		<li>通过声带插入静脉留置针（24 G）的塑料导管，并将塑料导管连接至呼吸机设置。</li>
		<li>将呼吸机连接至导管，通过观察胸廓同步运动来确认插管成功。 
		注意：如果呼吸运动未停止或小鼠开始活动，首先将呼吸频率增加至每分钟180次。如有必要，随后将异氟烷浓度增加至最高3.5%，直至小鼠自主呼吸停止。应评估是否存在漏气或蒸发器填充不足，这是最可能的问题。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 术前多普勒测量
<ol>
	<li>用镊子轻轻分开气管旁的结缔组织，游离出双侧颈动脉。</li>
	<li>将20 MHz多普勒探头的尖端蘸取少量无菌&#160;超声耦合剂，以小于45°的角度分别置于右侧和左侧颈动脉上。</li>
	<li>缓慢旋转探头，向内外侧移动以寻找多普勒信号，并倾斜探头以优化信号质量。</li>
	<li>使用多普勒软件在计算机上显示并记录右侧和左侧颈总动脉的血流速度。</li>
</ol>
3. 开胸术
<ol>
	<li>每只小鼠使用一副无菌手套，以防止手术部位感染。</li>
	<li>将皮肤切口向下延伸至第2处nd 用剪刀分离肋间隙。</li>
	<li>确定 2nd 通过计数肋骨在视觉上确定肋间隙，然后用包膜钳钝性穿入该间隙。 
	注意：第1条st 肋骨位于锁骨下方，因此不可见，因为2nd 肋间隙位于第一可见肋骨之间（即 2nd 肋）和3rd 肋</li>
	<li>打开 2nd 借助镊子尖端分离肋间隙并插入牵开器。</li>
	<li>使用固定在手术台上的橡皮筋调节拉钩，以清晰暴露胸腺。</li>
	<li>若发生出血，使用棉签按压浅表血管2分钟。</li>
</ol>
4. 横向主动脉缩窄术
<ol>
	<li>将放大倍数调整至200%，以识别中线和结缔组织。然后使用弯头镊子轻轻分离胸腺。去除脂肪组织，直至能清晰看到主动脉弓。</li>
	<li>在头臂动脉与左颈总动脉之间的横位主动脉下方，使用带角度的持针钳制备一个隧道（参见 图1用精细镊子夹住6.0缝线的一端，将缝线从主动脉弓下方穿过。</li>
	<li>用第二把镊子从拱形的另一侧取线。</li>
	<li>剪取一段3毫米长的27 G针头，用作体重在19–25 g小鼠进行TAC连接时的间隔物；使用26 G针头作为其他小鼠的间隔物 &#62;25 g 体重。</li>
	<li>将垫片小心地平行放置于横位主动脉旁。</li>
	<li>在垫片上打一个松散的双结，并确保垫片与主动脉平行且位置最佳。然后打第一个结扣，迅速执行第二个反向结扣。立即移除垫片。</li>
	<li>为进行假手术小鼠的对照操作，请遵循相同的实验步骤，但省略主动脉结扎步骤。</li>
	<li>关闭 2nd 用6.0聚丙烯缝线缝合肋间隙。结扎时需特别注意锁骨下血管。</li>
	<li>缝合&#160;使用6.0聚丙烯缝线以连续缝合方式缝合皮肤。</li>
</ol>
5. 确认横主动脉结扎成功
<ol>
	<li>按照第2节所述，将20 MHz多普勒探头以45°角放置于颈部两侧。</li>
	<li>记录每一侧的血流速度。 
	注：可通过多普勒血流速度验证TAC是否成功，如图2所示。颈动脉左右两侧的血流速度比为4 - 10时，通常可确保TAC充分（见图2）。</li>
</ol>
6. 心脏采集
<ol>
	<li>按照步骤 1.2 和 1.3 进行麻醉诱导。</li>
	<li>将小鼠放入安乐死舱内，调节二氧化碳流速，使其每分钟置换舱体体积的 10 - 30%。</li>
	<li>将小鼠固定于手术台，用剪刀打开腹腔，通过套管从下腔静脉采集血液，用于后续分析。</li>
	<li>用粗剪刀剪开膈肌和胸骨，取出心脏。</li>
	<li>在称重前去除心脏上所有动脉和结缔组织。</li>
	<li>将右心室和室间隔与左心室分离，并分别称重。</li>
	<li>将两份组织样本在液氮中迅速冷冻。</li>
</ol>

<ol><li>Tarnavski, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+surgical+models+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Mouse surgical models in cardiovascular research.</a> Methods Mol Biol Clifton NJ. 573, 115-137 (2009).</li>
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<li>Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+ventilation+of+isolated+mouse+lungs+on+surfactant+and+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines.</a> Eur Respir J. 17 (3), 488-494 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

由于TAC引起的高血压具有快速发作的特点，这与临床上由主动脉瓣狭窄或高血压引起的心肌肥厚有所不同。然而，使用小型动物模型诱导心力衰竭具有诸多优势，因此被许多研究者所采用11。这种闭胸模型改进了已有的在小鼠中诱导横主动脉缩窄的手术技术模型4。
最关键的步骤是导管通过主动脉弓的部分。若在主动脉周围结扎过紧，可能导致流向肾脏等重要器官的血流严重减少，从而引发致命后果。根据哈根-泊肃叶定律（Hagen-Poiseuille law），血流量主要取决于血管半径。因此，本实验方案中使用了若干根据体重调整的间隔物。该方法使此模型具有更广泛的适用性，尤其适用于非常年轻或年老的小鼠，具体可根据不同的实验设计进行调整。
手术创伤本身会引发免疫反应，应将其降至绝对最低程度，以防止产生干扰效应。快速恢复和高存活率是必需的，尤其是在复杂的动物模型中。历史上，与人类患者的开胸手术不同，小鼠在TAC手术后胸廓不会被复原。因此，由于肋骨游离且未与胸骨重新连接，生理...

小鼠模型常用于模拟人类疾病1。通过横主动脉缩窄术（TAC）可诱导压力超负荷和左心室肥厚2。小鼠开胸TAC模型已由Rockman et al.3 验证，其手术操作细节由DeAlmeida et al.4 详细描述。与腹主动脉缩窄相比，横主动脉结扎更具优势，因为前者可使更大范围的循环系统补偿后一种操作带来的不利影响2。
对横弓主动脉进行缩窄会导致升主动脉和无名动脉的动脉压升高，但通过远端血管仍可维持器官的充分灌注（即 左侧颈总动脉、左侧锁骨下动脉和降主动脉）。这会导致心肌后负荷增加以及心室壁应力升高。随后由于心肌纤维增厚，壁应力逐渐降低。5慢性的心脏血流动力学改变导致左心室发生不良适应和扩张。通过这种方式，TAC 建立了一个可重复的心肌肥厚模型，并最终发展为心力衰竭。
DeAlmeide 描述的 TAC 标准操作步骤 等4 通过部分上胸廓切开术，经肋骨或胸骨分离，进入纵隔及胸膜腔，从而接近主动脉弓。该入路可良好显露主动脉弓及其侧支血管。然而，被分离的肋骨无法重新固定，导致其游离漂浮，从而改变呼吸动力学。
因此，我们建立了一种经侧方手术入路的微创闭合式胸腔主动脉弓操作方法，通过第2肋间进入nd 肋间隙。该模型最大的优势在于能够不切断肋骨而完成TAC手术。手术创伤仅限于皮肤切口和肋间肌的分离。该操作可最大程度减少创伤本身，并有助于维持足够的胸壁稳定性。
本文介绍了一种无需进行全胸廓切开或上胸廓切开术即可在小鼠中实施TAC手术的详细分步操作流程。采用高频多普勒超声检测以确认TAC手术成功，方法如先前文献所述6,7。

<table><tbody><tr><td>压力-容积导管</td><td>Millar Instruments, USA</td><td>SPR-839</td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Harvard Apparatus GmbH, Germany</td><td>Minivent - TYPE 845</td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Harvard Apparatus GmbH, Germany</td><td>带套管内插管的Y型连接器，外径1.2 mm，货号73-2844</td><td></td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>Dr&amp;auml;ger Medical AG&amp;CO.KG, Germany</td><td>19.3 异氟烷蒸发器（更新版本的目录编号为&amp;nbsp;D-877-2010）</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems, Germany</td><td>MZ 7.5</td><td></td></tr><tr><td>光源&amp;nbsp;</td><td>Schott AG, Germany</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene</td><td>Ethicon, USA</td><td>聚丙烯缝线 BV-1 9.3 mm 3/8c</td><td>手术缝合线</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner, Germany</td><td>USP 5/0 黑色；&amp;nbsp; IC108000&amp;nbsp;</td><td>缩窄术用缝线</td></tr><tr><td>恒温控制手术台</td><td>Harvard Apparatus GmbH, Germany</td><td>型号872/3 HT，配三脚架和恒温控制器874型，货号73-4233</td><td></td></tr><tr><td>柔性直肠探头</td><td>Harvard Apparatus GmbH, Germany</td><td>外径1.6 mm，货号55-7021</td><td></td></tr><tr><td>多普勒信号可视化仪器</td><td>Indus Instruments, USA</td><td>多普勒信号处理工作站（DSWP），配备20 MHz脉冲多普勒模块</td><td></td></tr><tr><td>Arruga 囊内镊</td><td>Altomed, UK</td><td>A5400</td><td></td></tr><tr><td>多普勒探头</td><td>Indus Instruments, USA</td><td>20 MHz管装探头</td><td></td></tr><tr><td>Jaffe 眼睑拉钩</td><td>Altomed, UK</td><td>A3513</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于在小鼠中诱导横主动脉缩窄的闭胸模型

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

通过横向主动脉缩窄术（TAC）诱导的压力超负荷小鼠模型常用于心肌肥厚与心力衰竭的研究。标准操作需进行部分开胸以暴露横位主动脉弓。然而，开胸模型中因肋骨被分离且胸腔闭合后未重新连接，导致手术创伤改变呼吸生理状态。为避免此问题，我们建立了一种经侧胸入路的微创闭胸手术方法。本研究中，通过第2nd 在不进入胸腔的情况下进行肋间切口，使小鼠遭受的创伤更轻，更利于恢复。我们采用标准的实验室条件进行开胸TAC手术操作，术后生存率相当。由于采用闭胸方法，小鼠的生理呼吸模式得以维持，且表现出更快的恢复速度。这种微创技术似乎有助于加快创伤后的愈合过程，并减轻免疫反应。

成功的缩窄术（TAC）可确保诱导出压力超负荷及左心室肥厚。可通过多普勒血流速度测量对压力超负荷进行临时验证，如图2所示。术前两侧颈动脉的血流速度相等，而缩窄术后由于左心室和主动脉压力升高，导致右侧颈动脉血流速度增加，同时左侧颈动脉在狭窄后出现血流速度减弱。
通过计算 C57BL/6J 雄性小鼠术后第 3、6 和 21 天的心脏重量/体重比值（HW/BW；mg/g），验证了 TAC 手术的有效性及其诱导的心肌肥厚效应。术后第 6 天，TAC 小鼠的 HW/BW 比值显著高于未结扎对照组小鼠（4.78 ± 0.18 vs7.66±1.43 mg/g，p &lt;0.0001）。术后 21 天时，该比值基本保持稳定（4.8 ± 0.11 vs 7.81 ± 0.65 mg/g，p &lt;0.0001）（见图 3）。手术存...

本文介绍了一种通过侧胸切开术进行横主动脉缩窄（TAC）的操作方案。该技术是一种微创的闭合式胸腔手术，旨在利用标准的TAC实验室条件，在小鼠中模拟压力超负荷和心力衰竭状态。

关于心肌肥厚和心力衰竭的研究通常基于通过TAC诱导的压力超负荷小鼠模型。标准操作步骤是……

本实验的总体目标是在小鼠闭胸模型中进行横主动脉缩窄，以诱导左心室心肌肥厚。这种微创技术有助于减少呼吸系统并发症，并最大限度地降低炎症反应。该方法可帮助我们回答免疫学领域中的一些关键问题，例如心脏巨噬细胞在左心室肥厚发展过程中的反应。该技术的主要优势在于，肋骨保持完整，因此创伤被降至最低。由于空间和潮气量根据体重进行调整，该方案可用于不同体型的小鼠。此外，该方法还能减少手术创伤，并降低测量值的偏差。根据文本方案，在麻醉小鼠后，将其转移至温度可控的手术台，并断开连接麻醉诱导箱的鼻罩以维持麻醉状态。使用尼龙缝合线固定小鼠的上门齿。轻捏尾巴以确认反射消失。使用胶带固定四肢。插入直肠探头后，根据制造商说明将脱毛膏涂抹于咽喉部和上胸部，静置一分钟。随后擦去脱毛膏，必要时可重复操作。将呼吸机参数调整至生理水平，并在手术显微镜下操作，于下颌骨下方约三毫米处沿中线切开皮肤，向下延伸至第二肋。辨认下颌下腺的中线及结缔组织。然后使用两把弯头镊子轻柔地钝性分离下颌下腺的中线部位，暴露气管周围肌肉组织。用钝性分离法轻轻分开气管旁肌肉，以暴露气管。用镊子牵拉舌头以伸直咽喉，便于插管，并将气管插管导管轻柔地插入气管内。通过直接观察导管是否位于气管内，以及检查胸部是否有适当的起伏运动，来确认插管成功。使用镊子轻轻分离气管旁的结缔组织，暴露两侧颈动脉。在20赫兹多普勒探头尖端涂抹超声耦合剂，将探头尖端以小于45度的角度置于右侧和左侧颈动脉上。缓慢旋转探头，向内外侧移动以寻找多普勒信号，然后倾斜探头以优化信号。 使用一副新的无菌手套和剪刀，将皮肤切口向下扩展至第二肋间隙。然后用镊子尖端打开第二肋间隙，并插入拉钩。在200%放大倍数下，辨认中线及结缔组织。然后，使用弯头镊子轻轻分离胸腺。去除脂肪组织，直至能清晰看到主动脉弓。用弯头持针镊在横主动脉下方、头臂动脉与左颈总动脉之间，制备一个隧道。然后，使用精细镊子夹住6-0缝线，将缝线从主动脉弓下方穿过。用第二把镊子从弓的另一侧接过缝线。小心地将间隔物平行放置于横位主动脉处。在垫片上打一个松散的双结，并确保垫片与主动脉平行且位置最佳。然后打第一个结，迅速打第二个反向结，随后立即移除垫片。整个操作中最关键的步骤是迅速而牢固地打好两个结，并立即取出垫片。用6-0聚丙烯缝线闭合第二肋间间隙，并在结扎时特别注意锁骨下血管。然后使用6-0聚丙烯缝线，以连续缝合方式缝合皮肤。确认结扎无误后，按照文本方案进行术后护理。这些多普勒血流速度测量结果验证了TAC手术的成功：由于左心室和主动脉压力升高，右侧颈动脉血流速度增加，而左侧颈动脉在狭窄后出现血流速度减弱。如本图所示，与未手术小鼠相比，TAC小鼠在术后第6天心脏重量与体重的比值显著升高。该比值在术后21天后趋于稳定。心率对左心室收缩力和心输出量具有显著影响。该图显示，在术后21天，主动脉缩窄小鼠与非主动脉缩窄小鼠的心率无差异。如图所示，通过左心室导管在术后21天测得的收缩压升高，证实了主动脉存在持续性缩窄。C57 black six 小鼠在进行 TAC 手术后通常会出现伴有收缩功能障碍的离心性肥厚。发现左心室直径增大，在压力-容积测量中也显示出显著差异。因此，收缩末期和舒张末期容积均显著增加。一旦掌握，该技术若操作得当，可在10分钟内完成。最后，该方案通过最大程度减少手术创伤，限制了免疫系统的非特异性激活，从而实现了对左心室肥厚中免疫反应的优化分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何进行标准化的微创横位主动脉缩窄手术。

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诱导小鼠横向主动脉狭窄的闭合胸模型

小鼠横主动脉缩窄术（TAC）是研究心肌肥厚和心力衰竭发生机制的常用实验模型。本文描述了缩窄主动脉以在小鼠中建立可重复的心肌肥厚程度的操作步骤。...

小鼠横位主动脉缩窄术

手术创伤会诱发炎症反应。已知细胞因子和内源性配体可调节缺血再灌注后的心肌梗死面积。本文介绍一种改良的闭胸小鼠缺血再灌注模型，通过悬挂重物的方式减少开胸手术的影响。...

一种小鼠闭胸式心肌缺血与再灌注模型

在本视频中，我们演示了一种在小鼠中进行微创横向主动脉缩窄的实验方案，用于研究压力超负荷诱导的心力衰竭。...

小鼠横位主动脉弓缩窄术：一种诱导左心室高压的微创小鼠模型技术

我们描述了一种通过使用小型金属夹缩窄升主动脉，在Wistar大鼠中建立压力超负荷及左心室肥厚的逐步操作方法。该模型被广泛用于研究心脏肥厚过程中的心肌重塑变化，以及识别和评估逆转此类变化的策略。...

大鼠升主动脉缩窄术用于建立压力超负荷性心肌肥厚模型

本实验方案的目的是利用B型和M型超声心动图以及彩色/脉冲波多普勒成像，无创性地评估经主动脉横缩手术建立的小鼠心脏病模型中心脏结构和功能的变化。...

通过超声心动图成像评估横主动脉缩窄小鼠模型中的心脏形态与功能变化

微创横主动脉缩窄术（MTAC）保留了常规横主动脉缩窄术（TAC）的核心要素，同时避免了气管插管和呼吸机的使用。该方法在左心室超负荷的高通量研究中表现出显著优势，尤其适用于转化医学研究。...

小鼠微创横主动脉缩窄术

本实验方案的目的是逐步描述小鼠微创横主动脉缩窄（TAC）技术。通过省去常规标准手术中必需的插管和通气步骤，微创TAC简化了手术操作，并减轻了对动物造成的应激负担。...

小鼠经皮微创主动脉横缩术诱导左心室肥厚的技术

本方案介绍了一种使用可吸收缝线获得短暂性心肌肥厚的改进方法，可模拟在去除压力超负荷后左心室肥厚的减轻过程。该方法对心肌肥厚预处理的相关研究具有重要价值。...

使用可吸收缝线进行横断主动脉缩窄术以获得短暂性心肌肥厚

本方案描述了一种经过改良和简化的微创横主动脉缩窄（TAC）技术，该技术使用自制的牵开器。该手术无需呼吸机或显微镜即可完成，可诱导压力超负荷，最终导致心肌肥厚或心力衰竭。...

小鼠横位主动脉缩窄术的一种改良技术

用表达人类主要自身抗原细胞色素P450...

CYP2D6 动物模型：如何在小鼠中诱导自身免疫性肝炎

了解小鼠闭合胸横向主动脉狭窄技术，用于诱导左心室肥厚并研究心脏巨噬细胞免疫反应。该微创方法保持肋骨完整，减少手术创伤，适用于不同体型小鼠，为心血管与免疫学研究提供标准化模型。

一种用于在小鼠中诱导横主动脉缩窄的闭胸模型

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