穿刺诱导的虹膜新生血管形成作为虹膜红变的小鼠模型

本实验的总体目标是诱导虹膜血管生成，从而实现对血管生成过程的直接活体可视化。该方法有助于解答眼科学领域中的关键问题，特别是在新生血管性疾病方面的研究。该技术的主要优势在于利用白化小鼠，从而能够实现对血管的直接活体观察。

通过该方法可深入了解眼部新生血管疾病。该方法也可作为血管生成的通用模型，例如用于测试新的促血管生成疗法。该方法的可视化演示至关重要，因为小鼠眼球尺寸较小，虹膜解剖操作具有挑战性。

然而，经过练习，这一技术可以被掌握。将一只 P12.5 小鼠麻醉并做好手术准备后，将其置于体视显微镜下侧卧位，并确认面罩位置妥当。此时，小鼠的眼睛应充满整个视野。

眼睛必须保持清晰对焦。接下来，用非优势手持小型结扎镊子，轻轻向下按压眼球背侧和腹侧的眼睑，使眼球小心突出。在此过程中，牢固抓住眼睑会有帮助。

在继续操作前，以40倍放大倍数对血管系统进行拍照记录。接着，使用体视显微镜定位角膜缘。白化BALB/c小鼠的角膜缘可轻易识别为位于角膜后方的环形血管丛。

现在，用主手握住一根30号斜面针头，于睫状体与锯齿缘之间、靠近虹膜睫状体后部边缘处，用针尖进行一个小的葡萄膜穿刺。穿刺时仅使用针头的尖端，且不超过斜面的一半。注意避免损伤晶状体。

穿刺口应具有自封闭性，但仍可通过伤口进行眼内注射研究物质。接下来，在眼球的对侧位置进行第二次葡萄膜穿刺。优化穿刺位置，使其分别位于最背侧和最腹侧的位置。

每四天在相同的两个位置重复进行虹膜穿刺，直至P24.5。每次重复穿刺前，务必检查是否存在外伤性白内障。按照文本方案所述摘除眼球并固定后，移除固定液，并用新鲜的PBS冲洗眼球三次。

然后，将眼球置于光滑、干燥的表面上，前房朝上。接着，在角巩膜缘后方插入一支斜面30号针头，以创建进入点。随后，用小型持针钳固定眼前段，并使用Clayman-Vannas直剪刀在旋转眼球的同时沿角巩膜缘进行环形剪切。

采用部分切口可使操作过程更加简便。完成操作后，眼球的后段应自然分离。接着，将前段朝下放置，以暴露晶状体。

用小镊子轻轻夹住晶状体并向上拉，小心取出。现在，将眼前段组织放置成角膜朝下，切面与视野垂直。然后，用非优势手的小型结扎镊子轻轻夹住睫状体后方的组织。

使用Clayman-Vannas直剪在睫状体前方稍作修剪，旨在去除小梁网并分离虹膜。虹膜随后应在角膜内移动。接下来，用小型结扎镊夹住角膜，并小心地将眼前节杯转移至含有200微升PBS的96孔板中。

保持对角膜的夹持，并通过用PBS冲洗组织继续解离虹膜。如有需要，可使用30号针头辅助移开虹膜。现在，使用小型持针钳移除角膜。

分离的虹膜可暂时保存在磷酸盐缓冲液中，置于4°C条件下，直至进行实验。在P12.5时期的白化BALB/c小鼠上，按照所述方法，每隔四天重复进行一次葡萄膜穿刺，直至P24.5。由于BALB/c小鼠角膜透明且缺乏黑色素，因此在P16.5幼鼠中即可清晰观察到虹膜血管结构，并随着实验进程逐渐增强。

在P27.5时，处死小鼠并仔细解剖其虹膜。穿刺通过激活伤口愈合系统，诱导虹膜产生血管反应。对PECAM1进行免疫组织化学染色。

染色结果显示，与对照组相比，穿刺眼虹膜的总体血管系统有所增加。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导虹膜血管生成以及成功分离小鼠虹膜的操作方法。在完成该实验步骤后，还可进一步采用其他方法（如QBCR）来回答更多分子和细胞层面的问题，例如检测促血管生成或抗血管生成物质的有效性。

该技术问世后，为研究人员利用小型啮齿类动物模型，通过活体、无创的方法探索新生血管疾病开辟了道路。